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Efecto de la adicion de antioxidantes sobre la motilidad espermatica post-criopreservacion y fertilidad del semen de peces.

Introduccion

La criopreservacion del semen de peces es una tecnica de gran interes para la piscicultura, ya que permite la conservacion de gametos tanto de especies productivas como de aquellas en via de extincion, asi como crear bancos de germoplasma (16) .

Sin embargo, este proceso produce danos celulares en los espermatozoides, tanto a nivel de la membrana plasmatica como en las mitocondrias y el acido desoxiribonucleico (ADN), debido a la formacion de cristales de hielo intra y extracelularmente, asi como tambien por el estres osmotico y oxidativo que provocan los procesos de congelacion y descongelacion (73) .

Para minimizar estos danos se han utilizado diversos medios diluyentes que no solo permiten su almacenamiento por largos periodos de tiempo, sino que tambien simulan las caracteristicas fisiologicas del esperma (55) . Estos medios diluyentes contienen a su vez una o mas sustancias crioprotectoras como dimetilsulfoxido (22) , metanol (39) , dimetilacetamida (45) y metilenglicol (36) .

Los antioxidantes

Con el fin de proporcionar una mayor sobrevivencia espermatica post-descongelacion, se han utilizado diversos tipos de antioxidantes de indole enzimatica y no enzimatica, los cuales favorecen la respuesta de variables como la motilidad, viabilidad e integridad del ADN (46) .

Adicionalmente, se ha reportado que combaten el estres oxidativo generado por el desbalance entre la produccion y eliminacion de las especies reactivas de oxigeno (ERO) durante los procesos de congelacion y descongelacion (62) .

Tambien se ha encontrado que el uso de antioxidantes como el butil hidroxitolueno (BHT) en los medios de criopreservacion de semen de algunas especies, mejoran los porcentajes de fertilidad, expresando una mejor tasa de produccion de embriones y por ende de eclosion.

Objetivo

La presente revision tiene como objetivo comparar las propiedades y respuestas de los diferentes tipos de antioxidantes que han sido utilizados en protocolos de crioconservacion de semen de las especies acuicolas: trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss), trucha de arroyo (Salvelinus fontinalis), esturion ruso (Acipenser gueldenstaedtii), esturion beluga (Huso huso) y carpa comun (Ciprynus carpio), asi como el efecto que producen sobre la fertilidad y la motilidad espermatica post-criopreservacion.

Funciones de los antioxidantes

Un antioxidante se define como una sustancia que cuando esta presente en bajas concentraciones, en comparacion con un sustrato oxidable, reduce o inhibe significativamente la oxidacion de dicho sustrato (31) .

Los antioxidantes tienen diversas funciones, como no permitir que moleculas se unan al oxigeno, al reaccionar e interactuar mas rapido con las especies reactivas de oxigeno en un determinado microambiente (31) , dismutar el oxigeno para formar el peroxido de hidrogeno y proteger a las celulas contra el anion superoxido, y regular la permeabilidad de la membrana plasmatica impidiendo su peroxidacion lipidica (72) .

Usos en criopreservacion

Los antioxidantes se usan como aditivos de los medios diluyentes durante el proceso de criopreservacion, para aumentar el exito del protocolo y obtener mejores tasas de motilidad y fertilidad espermatica (9,) (18,) (58) .

En celulas espermaticas son usados para mitigar los efectos de la criopreservacion y adicionalmente retardar o prevenir la oxidacion de la membrana lipidica causada por radicales libres, los cuales se producen en la mitocondria a traves de la nicotinamida adenina dinucleotido (NAD) dependiente de la via oxidoreductasa y en la misma membrana a traves de nicotinamida adenina di-nucleotido fosfatasa (NADP+) dependiente del sistema oxidasa, durante el proceso de congelacion y descongelacion (1,) (3) .

Efectos sobre las celulas espermaticas

Como producto del metabolismo celular se producen grandes cantidades de radicales libres (7) , los cuales se encuentran clasificados como EROs (anion superoxido, anion peroxido, radical perhidroxilo, radical hidroxilo) y como especies reactivas de nitrogeno (oxido nitrico, radical peroxinitrito).

Estas sustancias son producidas por mitocondrias, lisosomas, peroxisomas, membrana nuclear, citoplasma y reticulo endoplasmico; sin embargo, tambien son generadas por factores externos como la contaminacion ambiental, la exposicion a radiaciones ionizantes, el tabaco, los medicamentos, los aditivos quimicos en alimentos procesados y algunos pesticidas, herbicidas y fungicidas (60) .

Cuando se realiza la criopreservacion de celulas espermaticas, el sistema antioxidante enzimatico (superoxido dismutasa, catalasa y glutation peroxidasa) se activa convirtiendo al anion superoxido ([O.sub.2]-) en peroxido de hidrogeno ([H.sub.2][O.sub.2]) e impidiendo la aparicion de iones hidroxilos, altamente toxicos (2) . El peroxido de hidrogeno atraviesa los compartimientos celulares sin interactuar con el NADPH, acidos nucleicos, proteinas ni lipidos, siendo usado por las celulas para su maduracion y capacitacion (68) .

Por su parte, el sistema de defensa no enzimatica esta compuesto por una serie de diversos compuestos quimicos que son incorporados a traves de la dieta, los cuales cumplen algunas funciones como impedir las reacciones en cadena producidas por el radical hidroperoxido durante la peroxidacion lipidica (48) o proteger a las lipoproteinas de la membrana plasmatica contra la oxidacion (69) .

Uso en criopreservacion de espermatozoides de peces

Diversos estudios en peces han evaluado el efecto de la adicion de antioxidantes a los medios diluyentes, sobre el porcentaje de motilidad espermatica post-des-congelacion y su fertilidad, los cuales se han llevado a cabo en especies como: trucha arco iris (38,) (40) , trucha de arroyo (40) , esturion ruso (44) , esturion beluga (52) y carpa comun (49,) (50,) (51) . Los antioxidantes evaluados fueron de dos tipos: enzimaticos y no enzimaticos.

Antioxidantes enzimaticos y no enzimaticos

Los antioxidantes enzimaticos catalasa, superoxido dismutasa y peroxidasa se han evaluado en los salmonidos trucha arco iris (38,) (40) y trucha de arroyo (40) . Los antioxidantes no enzimaticos tipo vitamina (C, E y trolox) se han utilizado en las especies trucha arco iris (38) , esturion ruso (44) y esturion beluga (52) ; los tipos aminoacido (lisina, metionina, cisteina y taurina) en trucha arco iris (22,) (38,) (40) , esturion ruso (44) , y carpa comun (49) .

Los compuestos naturales [beta]-caroteno y propoleo se han valorado en trucha arco iris (38) y carpa comun (49) , los compuestos sinteticos (3,5-di-ter-butil-4-hidroxifenil (MDPA) y butilhidroxitolueno (BHT) en esturion beluga y carpa comun (50,) (52) y las sustancias quimicas acido urico, carnitina y glutation en sus formas reducida y oxidada, fueron ensayadas en las especies trucha arco iris (38,) (40) y de arroyo (40) .

Utilidad en la criopreservacion de semen

La adicion de los diferentes tipos de antioxidantes a los medios diluyentes ha producido diversos efectos especie-especificos en parametros como la motilidad y fertilidad de los espermatozoides de peces.

Anteriores estudios han reportado que los antioxidantes no enzimaticos (vitamina C, lisina, cisteina, metionina, vitamina E, glutation reducido, L-carnitina, acido urico, propoleo, MDPA, BHT, mezcla glutation reducido y oxidado) lograron optimizar la funcion mitocondrial en los procesos de criopreservacion de esperma de cuatro especies de peces (Tabla 1).

Sin embargo, los antioxidantes como vitamina C, lisina, cisteina, propoleo, MDPA, BHT, mezcla glutation reducido y oxidado y L-carnitina, aumentaron de forma simultanea las tasas de motilidad espermatica post-descongelacion y de fertilizacion (Tabla 2).

Otros estudios mostraron un efecto diverso al utilizar las vitaminas las C y E como antioxidantes en los procesos de criopreservacion de espermatozoides de especies animales como conejos (74) , bovinos (26,) (32) , equinos (27) , porcinos y humanos (14,) (67) . Resultados similares fueron obtenidos al utilizar como antioxidantes los aminoacidos lisina, cisteina y metionina, en celulas espermaticas de caprinos (70,) (71) y bovinos (13) .

De igual forma, se reporto el mismo efecto cuando se utilizo propoleo y BHT en espermatozoides de caprinos (18,) (34,) (47) y porcinos (56) , asi como l-carnitina en seres humanos (8) , felinos (41) , caprinos (71) y roedores (53) , el glutation en su forma reducida (GSH) en personas (29) y porcinos (28) , el glutation oxidado (GSSH) y la mezcla de glutation reducido y oxidado en bovinos (13) .

El efecto benefico de antioxidantes como cisteina, lisina, metionina, acido ascorbico y carnitina, representado por el aumento de la motilidad, podria estar relacionado con el hecho de que la cisteina -al ser adicionada a medios diluyentes- refuerza el aumento de la produccion de glutation, tanto intra como extracelular, lo cual ayuda a prevenir la perdida de la motilidad espermatica debida a la formacion de iones peroxido (13) .

Asimismo, la lisina junto con metionina y acido ascorbico, son esenciales para la biosintesis de carnitina, la cual es un antioxidante fundamental para metabolizar los acidos grasos de cadena larga en el interior del citosol de las mitocondrias, donde al ser degradados se convierten en energia (ATP) para ser luego utilizada por las celulas espermaticas para aumentar su motilidad (15) . Adicionalmente, la carnitina ayuda a proteger la membrana fosfolipidica del espermatozoide contra la peroxidacion lipidica (53) .

De igual forma, el efecto reportado por el propoleo podria estar relacionado con la induccion de la activacion de enzimas como la superoxido dismutasa (33) y la catalasa (66) , las cuales protegen al organismo del ataque de radicales y al ADN contra el dano oxidativo producido por el malondialdehido durante la peroxidacion lipidica (59) .

De otra parte, MDPA, BHT y alfa tocoferol, dado que son compuestos fenolicos estericamente impedidos, funcionan como antioxidantes atrapando los radicales oxi y peroxi (35) . Las altas tasas de motilidad y fertilidad reportadas con el uso de MDPA y BHT se deben a la propiedad redox que tienen estos compuestos permitiendo la absorcion y neutralizacion de los radicales libres, protegiendo a las celulas espermaticas de la oxidacion y degradacion prematura y brindandoles una estabilidad frente los cambios bruscos de temperatura (52) . Otros autores le atribuyen excelentes resultados al efecto sincronico de antioxidantes fenolicos estericamente impedidos con el medio diluyente yema de huevo (30,) (54) .

Tambien se ha descubierto que los antioxidantes como la metionina reducida, la mezcla de metionina reducida y oxidada y el glutation oxidado, produjeron menores tasas de motilidad espermatica post-des-congelacion, sin afectar de forma negativa las tasas de fertilizacion (Tabla 3).

En estos casos se puede inferir que tales antioxidantes produjeron una fragmentacion del ADN, la cual provoco la disminucion de la motilidad espermatica sin afectar las tasas de fertilizacion, debido a que en algunas especies de peces y mamiferos, los ovocitos pudieron haber activado el sistema enzimatico de reparacion del ADN propio actuando sobre el ADN de los espermatozoides, reparandolo y permitiendo que se realice la fertilizacion y el normal desarrollo de los embriones (5,) (37) .

La utilizacion del glutation, tanto individual como combinada en sus formas reducida y oxidada, produjo resultados variables debido a su concentracion durante el proceso de criopreservacion (Tabla 4).

Se ha reportado que durante la criopre-servacion los niveles de glutation decrecen en los espermatozoides (28,) (29) . Siendo asi, al anadir altas cantidades para compensar el efecto se evidenciaria una alteracion de la homeostasis celular. Un investigador reporto que el glutation se encuentra dentro de las celulas en una alta concentracion (5-10 mM), predominando la forma reducida (GSH) sobre la oxidada (GSSG) y que cuando se produce un aumento o disminucion en la proporcion de alguno de ellos, es afectado el equilibrio interno de la celula (21) .

Por el contrario, se ha descubierto que los antioxidantes enzimaticos como catalasa, superoxido dismutasa y peroxidasa, asi como los no enzimaticos (trolox, taurina y [beta]-caroteno) no lograron mejorar de forma significativa las tasas de motilidad y fertilidad en peces. Estos resultados han sido similares o inferiores a los obtenidas con los diluyentes estandares (Tabla 5).

Otros estudios mostraron un efecto diverso al utilizar la superoxido dismutasa (SOD) como antioxidante en los procesos de criopreservacion de espermatozoides de especies animales como caprinos (12,) (65), porcinos (57) , aves (4) , equinos (11) , simios (43) y caninos (19) . Similares efectos se constataron cuando se empleo la catalasa en espermatozoides humanos (46) , porcinos (57) , bovinos (24) y ciervos (23) y de igual forma, el trolox en equinos (64) y caprinos (63) , la taurina en bovinos (20,) (54) y caprinos (6) y finalmente, los carotenoides como la luteina y crocin en semen de porcinos y caprinos (25,) (42) .

Los antioxidantes enzimaticos no lograron incrementar las tasas de motilidad y fertilidad debido a que las altas concentraciones de las enzimas pudieron ser toxicas para las celulas. En un estudio se reporto que 50 U/mL de SOD eran suficientes para mantener la viabilidad espermatica postdescongelacion en el esperma de gallos; sin embargo, a medida que se acrecentaba la concentracion del antioxidante en el medio, aumentaba la toxicidad (4) .

La respuesta contraria presentada por la enzima superoxido dismutasa (250 U/l) en la trucha arco iris, podria haberse debido a la composicion del medio diluyente utilizado (38,) (40) . Un estudio reporto que durante la criopreservacion se producen resultados variables utilizando el mismo antioxidante, cuando los medios diluyentes con los que se trabaja poseen distintas composiciones (54) .

Por otra parte, el efecto negativo en cuanto a las tasas de motilidad espermatica y fertilidad reportado al utilizar antioxidantes enzimaticos (catalasa, superoxido dismutasa y peroxidasa) y no enzimaticos (trolox, taurina y [beta]-caroteno), estuvo influenciado por la concentracion, dado que no potencializo la funcion del medio diluyente, ocasionando danos en el ADN mitocondrial y nuclear durante el proceso de la criopreservacion, afectando la sintesis de proteinas involucradas en la produccion de energia celular y tambien el proteoma (17) .

En una investigacion se reporto la desaparicion de 21 proteinas espermaticas despues de la criopreservacion, las cuales contenian los factores de transcripcion de genes importantes no solo para la motilidad sino para la fusion del ovocito con el espermatozoide (75) .

Se afirma que la variabilidad de los resultados obtenidos para los parametros relacionados con la motilidad espermatica y su fertilidad frente a la adicion de antioxidantes en los medios diluyentes utilizados en los procesos de criopreservacion de espermatozoides, se debe principalmente al tipo de antioxidante y a las diferencias especie-especificas expresadas en el grado de susceptibilidad al estres oxidativo, asi como tambien al mismo protocolo utilizado durante la criopreservacion (10,) (61) .

Conclusiones

Los antioxidantes adicionados a los medios diluyentes durante los procesos de criopreservacion de espermatozoides presentan propiedades especie-especificas; por lo cual se evidencia una variabilidad en la respuesta de parametros de calidad espermatica y fertilidad.

La respuesta de las variables de motilidad espermatica post-criopreservacion y fertilidad, se ven afectadas directamente por el tipo de antioxidante utilizado, su concentracion y el medio diluyente al que son adicionados.

Los antioxidantes enzimaticos como superoxido dismutasa, catalasa y peroxidasa producen bajas tasas de motilidad espermatica post-descongelacion, sin mejoria de las tasas de fertilizacion en las especies acuicolas (truchas arco iris y de arroyo).

Los antioxidantes no enzimaticos como MDPA, BHT, cisteina, propoleo, acido ascorbico, lisina y carnitina, mejoran de manera significativa la motilidad espermatica post-descongelacion y las tasas de fertilizacion en las especies esturion beluga, carpa comun, esturion ruso y trucha arco iris.

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Rodriguez, M.; Nivia, A.

Escuela de Ciencias Agricolas, Pecuarias y del Medio Ambiente (ECAPMA), Universidad Nacional Abierta y a Distancia (UNAD), Sede Nacional Calle 14 Sur No 14-23, Bogota, CP 110911, Colombia, PBX: (+57)1344 3700. E-mail: alexander.nivia@unad.edu.co

Recibido: 9 noviembre 2016 / Aceptado: 29 junio 2017
Tabla 1. Antioxidantes no enzimaticos que optimizaron la funcion
mitocondrial durante el proceso de criopreservacion del semen de peces.

especie           antioxidante            MC     MA

esturion ruso     vitamina C, 0,01 mM     32     38
trucha arco iris  metionina, 1,5 mM/L     32     65
esturion ruso     lisina, 0,05 mM         32     36
carpa comun       cisteina, 2,5 mM        46,67  50
                  cisteina, 5 mM          46,67  64,67
                  cisteina, 20 mM         46,67  76
trucha arco iris  GSH, 1,5 mmol/l         32     42
                  GSH+GSSG, 3,0 mM        21,2   22,9
                  L-carnitina,0,05 mM/l   32     57
                  acido urico, 0,25 mM/l  32     62
carpa comun       propoleo, 0,2 mg/ml     40,3   54,3
                  propoleo, 0,4 mg/ml     40,3   55
                  propoleo, 0,6 mg/ml     40,3   61,7
                  propoleo, 0,8 mg/ml     40,3   68,7
                  propoleo, 1 mg/ml       40,3   63,3
esturion beluga   MDPA, 0,1 mM            20     50
                  BHT, 0,1 mM             20     40
carpa comun       BHT, 0,0001 mM          45,7   54,3
                  BHT, 0,001 mM           45,7   72,9
                  BHT, 0,01 mM            45,7   81,4
                  BHT, 0,1 mM             45,7   51,4
trucha arco iris  vitamina E, 2 mmol/l    32     53

GSSG: glutation oxidado; GSH: glutation reducido; MDPA:
3,5-di-ter-butil-4-hidroxifenil; BHT: butilhidroxitolueno, MC: tasa de
motilidad espermatica posdescongelacion del control; MA: tasa de
motilidad espermatica post-descongelacion con el antioxidante.
Elaborada en base a datos de Mirzoyan 2006 (44), Kutluyer 2014 (38),
Ogretmen 2014 (49), Ogretmen & Inanan 2014 (50), Osipova 2014 (52),
Ogretmen 2015 (51) .

Tabla 2. Antioxidantes no enzimaticos que aumentaron de forma
simultanea las tasas de motilidad espermatica post-descongelacion y de
fertilizacion en peces.

especie           antioxidante         MC     MA     FC     FA

esturion ruso     vitamina C, 0,01mM   32     38     55     78
                  lisina, 0,05mM       32     36     55     63
carpa comun       cisteina, 2,5mM      46,67  50     96     96
                  cisteina, 5mM        46,67  64,67  96     96,33
                  cisteina, 20mM       46,67  76     96     97
trucha arco iris  GSH+GSSG, 3,0mM      21,2   22,9   87     92
                  L-camitina,0,05mM/l  32     57     86,71  90,01
carpa comun       propoleo, 0,2mg/ml   40,3   54,3   84,7   92,7
                  propoleo, 0,4 mg/ml  40,3   55     84,7   92,7
                  propoleo, 0,6 mg/ml  40,3   61,7   84,7   94,3
                  propoleo, 0,8mg/ml   40,3   68,7   84,7   94,7
                  propoleo, 1mg/ml     40,3   63,3   84,7   95
esturion beluga   MDPA, 0,1mM          20     50     30     60
                  BHT, 0,1mM           20     40     30     40
carpa comun       BHT, 0,0001mM        45,7   54,3   69,3   75
                  BHT, 0,001mM         45,7   72,9   69,3   76
                  BHT, 0,01mM          45,7   81,4   69,3   79
                  BHT, 0,1 mM          45,7   51,4   69,3   87,3

GSSG: glutation oxidado; GSH: glutation reducido; MDPA:
3,5-di-terbutil-4-hidroxifenil; BHT: butilhidroxitolueno; MC: tasa de
motilidad espermatica posdescongelacion del control; MA: tasa de
motilidad espermatica post-descongelacion con el antioxidante; FC: tasa
de fertilidad del control; FA: tasa de fertilidad con el antioxidante.
Elaborada en base a datos de Mirzoyan 2006 (44), Kutluyer 2014 (38),
Ogretmen 2014 (49), Ogretmen & Inanan 2014 (50), Osipova 2014 (52),
Ogretmen 2015 (51) .

Tabla 3. Antioxidantes no enzimaticos que produjeron menores tasas de
motilidad espermatica post-descongelacion sin afectar de forma negativa
las tasas de fertilizacion.

especie           antioxidante        MC    MA    FC     FA

trucha de arroyo  RMet, 1,5mM         22,2  19,7  67,9   75,2
                  RMet+ OxMet, 1,5mM  22,2  21,3  67,9   71,1
trucha arco iris  RMet+ OxMet, 1,5mM  21,2  21,7  87     88,7
                  RMet+ OxMet,3,0mM   21,2  17,2  87     85,4
                  GSSG,1,5mM/L        32    30    86,71  88,16

GSSG: glutation oxidado; OxMet: metionina oxidada; RMet: metionina
reducida; MC: tasa de motilidad espermatica post-descongelacion del
control; MA: tasa de motilidad espermatica post-descongelacion con el
antioxidante; FC: tasa de fertilidad del control; FA: tasa de
fertilidad con el antioxidante. Elaborada en base a datos de
Lahnsteiner 2011 (40), Kutluyer 2014 (38) .

Tabla 4. Antioxidantes no enzimaticos que presentaron resultados
variables durante el proceso de criopreservacion.

especie           antioxidante     MC    MA    FC     FA

trucha arco iris  GSH, 1,5mmol/l   22,2  21,3  67,9   76,3
                  GSH, 1,5mmol/l   32    42    86,71  87,26
                  GSSH,1,5mmol/l   32    30    86,71  88,16
                  GSH+GSSG, 1,5mM  21,2  17    87     88,7
                  GSH+GSSG, 3,0mM  21,2  22,9  87     92
trucha de arroyo  GSH+GSSG, 1,5mM  22,2  18    67,9   57,2

GSSG: glutation oxidado; GSH: glutation reducido; MC: tasa de motilidad
espermatica post-descongelacion del control; MA: tasa de motilidad
espermatica post-descongelacion con el antioxidante; FC: tasa de
fertilidad del control; FA: tasa de fertilidad con el antioxidante.
Elaborada en base a datos de Lahnsteiner 2011 (40), Kutluyer 2014 (38) .

Tabla 5. Antioxidantes enzimaticos y no enzimaticos que no mejoraron de
forma significativa las tasas de motilidad y fertilidad en peces
durante el proceso de criopreservacion.

especie           antioxidante             MC    MA     FC     FA

trucha arco iris  SOD 250U/l               32    60     86,71  89,23
trucha arco iris  SOD 250U/l               21,2  16,8   87     77,1
trucha de arroyo  SOD 250U/l               22,2  18,4   67,9   62,1
trucha arco iris  SOD 500U/l               21,2  10,9   87     73,4
trucha de arroyo  SOD 500U/l               22,2  18,3   67,9   59,8
trucha arco iris  PER 250U/l               32    22     86,71  88,61
trucha arco iris  PER 250U/l               21,2  17,7   87     90,7
trucha de arroyo  PER, 250U/l              22,2  17,7   67,9   68,1
trucha arco iris  PER,500U/l               21,2  22,6   87     88,6
trucha de arroyo  PER,500U/l               22,2  18,7   67,9   59,8
trucha arco iris  CAT 250U/l               32    31     86,71  87,1
trucha arco iris  CAT 250U/l               21,2  11,1   NR     NR
trucha de arroyo  CAT 250U/l               22,2  13,6   67,9   43,3
trucha arco iris  CAT 100U/l               21,2  22,9   87     89,6
trucha de arroyo  CAT 100U/l               22,2  22,6   67,9   75,9
esturion beluga   trolox, 0.1mM            20    10     20     30
esturion beluga   taurina, 50mm            61,7  63,3   69,5   63,7
trucha arco iris  taurina, 75mm            61,7  63,3   69,5   29
trucha arco iris  taurina, 100mm           61,7   3,3   69,5    9
trucha arco iris  [beta]-caroteno,0,5mM/L  32    26     86,71  87,44

SOD: superoxido dismutasa; CAT: catalasa; PER: peroxidasa, MC: tasa de
motilidad espermatica post-descongelacion del control; MA: tasa de
motilidad espermatica post-descongelacion con el antioxidante; FC: tasa
de fertilidad del control; FA: tasa de fertilidad con el antioxidante.
Elaborada en base a datos de Lahnsteiner 2011 (40), Ekici 2012 (22),
Kutluyer 2014 (38), Osipova 2014 (52) .
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Author:Rodriguez, M.; Nivia, A.
Publication:Revista Veterinaria
Date:Dec 1, 2017
Words:6177
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