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Efecto de diametro de esfera y densidad celular en la produccion de etanol con levadura inmovilizada en alginato.

Effect of pellet diameter and cell density on ethanol production with alginate immobilized yeast

Introduccion

La inmovilizacion de celulas tiene multiples aplicaciones en biotecnologia, biomedicina y ambiente. Entre las principales ventajas que ofrecen las celulas inmovilizadas se incluyen: la posibilidad de llevar a cabo reacciones complejas o acopladas, la reutilizacion de biomasa, una mayor estabilidad del biocatalizador, mayor productividad, la facilidad operativa, el bajo consumo de energia, y la baja contaminacion ambiental, entre otras (Martynenko y Gracheva, 2003; Freeman y Lily, 1998; Salter y Kell, 1991). Se considera que los sistemas de celulas inmovilizadas pueden separarse en totalmente artificiales y naturales (Junter y Jouenne 2004), aunque la inmovilizacion "natural" o "pasiva" es realmente un proceso biologico que da lugar a una biopelicula (Gutierrez-Correa y Villena, 2003). Por tanto, la inmovilizacion de celulas se debe referir solamente a un sistema de ingenieria para la retencion artificial de celulas sobre o dentro de un soporte o matriz.

Para la inmovilizacion de celulas por atrapamiento, los geles de alginato de calcio son los mas utilizados (Manojlovic et al., 2006). Entre las ventajas de este metodo estan la facilidad para manipular las propiedades gelificantes y la resistencia del gel (Sree et al., 2000). Ademas, cuando la inmovilizacion se realiza en perlas de alginato, estas pueden ser resolubilizadas, con lo que se obtienen celulas libres para su conteo o evaluacion. La diferencia del alginato con otros geles como el agar, radica en que el primero es termicamente irreversible, lo que permite trabajar a temperaturas elevadas (Guiseley, 1989). De otro lado, este es un sistema ideal para la reutilizacion del biocatalizador y su utilizacion en diversos tipos de fermentacion (Sree et al., 2000).

Una de las aplicaciones mas destacables de la inmovilizacion de celulas es la produccion de etanol (Nunez y Lema, 1987). Debido a la creciente demanda de este biocombustible, se incrementa la necesidad de emplear tecnologias economicas y microorganismos con altos rendimientos (Lin y Tanaka, 2006). En este aspecto, la fermentacion alcoholica con celulas inmovilizadas ofrece un mayor rendimiento con un menor empleo de recursos, en comparacion con la fermentacion con celulas libres; ademas, tiene una tasa mas alta de fermentacion, ya que permite operar a una alta densidad celular por unidad de volumen, y permite la recuperacion in situ de celulas, con lo que se facilitan las operaciones de recuperacion de biomasa y producto. Esto, a su vez, incrementa la tolerancia de los microorganismos al etanol y reduce costos de produccion de inoculo (Sree et al., 2000; Norton y D'Amore, 1994).

Historicamente, los microorganismos mas utilizados en la produccion de etanol han sido las levaduras. Entre ellas, Saccharomyces puede producir hasta 18% de etanol y crece en glucosa o sacarosa, por lo que es comunmente utilizada para la produccion de etanol. En general, el genero Saccharomyces es reconocido como GRAS (generally recognised as safe) y puede emplearse en forma segura como aditivo alimenticio, produccion de bebidas alcoholicas e industria de panificacion (Lin y Tanaka, 2006).

Si bien el metodo de inmovilizacion de celulas por atrapamiento en geles tiene varias ventajas, posee tambien como desventajas la escasa permeabilidad a moleculas de sustrato con elevado peso molecular y, en general, limitaciones en la transferencia de materiales a las celulas. En tal sentido, el objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto del diametro de las perlas de alginato y la densidad celular sobre la produccion de etanol con celulas inmovilizadas de Saccharomyces uvarum.

Materiales y metodos

Microorganismo. Se utilizo la cepa Saccharomyces uvarum NRRL Y-11877, la cual se mantuvo en cunas de agar Saboraud.

Inmovilizacion de celulas en esferas de alginato

Las celulas de levadura utilizadas para inmovilizacion se obtuvieron a partir de cultivos de 24 horas de crecimiento en matraces de 250 mL conteniendo 20 mL de caldo saboraud a 28[grados]C con agitacion de 175 rpm. Para separar las celulas, el medio de cultivo fue centrifugado a 4000 rpm durante 12 minutos descartando el sobrenadante y lavando la biomasa con 30 mL de una solucion de NaCl al 0,85% (p/v) por 3 veces. La biomasa obtenida, de aproximadamente 25 mg de peso fresco, segun la densidad por probar, se resuspendio con 5 mL de NaCl al 0,85% y se le agregaron 5 mL de solucion de alginato al 4% (p/v). La mezcla homogenea fue absorbida con jeringas esteriles de diferentes tamanos de aguja para obtener diferentes diametros de perla, como se muestra en la figura 1. La mezcla se dejo gotear sobre una solucion de Ca[Cl.sub.2] 0,05 M para permitir la gelificacion de las perlas de alginato. Una vez formadas, las perlas se mantuvieron en refrigeracion por 12 horas en Ca[Cl.sub.2] 0,05 M. Finalmente, se lavaron con suero fisiologico esteril 3 veces antes de ser transferidas a los microbiorreactores.

Determinacion de la densidad celular por perla

Para determinar la densidad celular, cada perla se coloco en un tubo de microcentrifuga que contenia 1,5 mL de buffer citrato 0,1 M a pH 4,8 y se incubo por 15 minutos a temperatura ambiente para solubilizar el alginato. Luego, se agito vigorosamente el tubo para obtener una solucion liquida homogenea. El conteo celular se realizo en una camara de Neubauer. Se realizaron cuatro repeticiones para cada diametro de perla.

[FIGURA 1 OMITIR]

Medio de cultivo. El medio de fermentacion para la produccion de etanol tuvo la siguiente composicion: K[H.sub.2]P[O.sub.4] 1 g/L; MgS[O.sub.4]x7[H.sub.2]O 1 g/L y glucosa 120 g/L; con un pH final de 4,5.

Biorreactor. Se utilizaron biorreactores de columna construidos con tubos de vidrio de 15 cm de longitud y 2,4 cm de diametro, cada uno conectado a un frasco colector de C[O.sub.2] como se muestra en la figura 2. La altura del liquido fue de 7 cm y el espacio de cabeza 5,3 cm.

[FIGURA 2 OMITIR]

Condiciones del cultivo. Los biorreactores contenian, cada uno, 20 mL de medio de fermentacion y se operaron durante 4 lotes consecutivos de 48 horas cada uno, a 28[grados]C, sin agitacion. Luego, el medio de fermentacion de cada lote fue reemplazado por un volumen igual de medio fresco. Los frascos colectores de C[O.sub.2] fueron reemplazados cada 24 horas.

Analisis

La concentracion de etanol fue determinada mediante oxidacion con dicromato de potasio utilizando una reaccion de titulacion redox (Pilone, 1985; Archer et al., 2007; Seo et al., 2009). Se preparo una solucion de dicromato de potasio en acido sulfurico diluido (0,1 M [Cr.sub.2][O.sub.7.sup.2-] en [H.sub.2]S[O.sub.4] 5 M). Un mL de muestra de etanol contenida en un vial de plastico se introdujo en un matraz de 250 mL con 15 mL de la solucion de dicromato de potasio. El vial se mantuvo suspendido al interior y el matraz fue sellado e incubado a 50[grados]C por una noche. En estas condiciones, el etanol se evaporo entrando en contacto con el dicromato. La solucion resultante fue titulada con una solucion de tiosulfato de sodio al 0,03 M. Por relacion estequiometrica, 1 mol de tiosulfato de sodio fue equivalente a 0,25 moles de etanol.

El C[O.sub.2] producido fue cuantificado por titulacion con Ba[Cl.sub.2] de acuerdo con lo descrito por Sugama y Okasaki (1979). El C[O.sub.2] fue colectado en frascos con 30 mL de una solucion 1,0 N de NaOH. Para la titulacion, el contenido de cada frasco fue transferido a un matraz de 250 mL y se le anadieron 10 mL de una solucion al 10% (p/v) de Ba[Cl.sub.2]. La mezcla se titulo con HCl 1,0 N, utilizando fenolftaleina como indicador. La medicion de C[O.sub.2] se hizo cada 24 horas. La glucosa residual en el medio de fermentacion se determino mediante el ensayo de azucares reductores de Miller (1959).

Analisis estadistico. Los resultados fueron analizados por el software Statistical Analisis System[R] (Version 8.1) (SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA), teniendo en cuenta el analisis de varianza por el procedimiento de Modelos Lineales Generales y la prueba de Duncan de rangos multiples. Para los analisis estadisticos se consideraron cuatro repeticiones.

[FIGURA 3 OMITIR]

Resultados

Se cultivo Saccharomyces uvarum NRRL Y-11877 (Saccharomyces bayanus) inmovilizada en perlas de alginato en microrreactores para la produccion de etanol (figura 2). La figura 3 muestra produccion de etanol y consumo de glucosa. La produccion de etanol fue variable en el tiempo respecto al diametro de perlas. Para las perlas de 2 mm de diametro (figura 3a) se alcanzo una produccion maxima de etanol de 48,02 g/L en el segundo lote (48-96 horas de incubacion), disminuyen do en 7 y 15% en los dos ultimos lotes respectivamente. En las perlas de 2,5 mm de diametro (figura 3b), la produccion de etanol se mantuvo casi constante, con un maximo de 49,27 g/L correspondiente al cuarto lote (144-192 horas de incubacion). La produccion de etanol en las perlas de 3 mm de diametro (figura 3c) fue la maxima registrada alcanzando 57,75 g/L, con un rendimiento del 97% correspondiente al segundo lote (48-96 horas de incubacion), disminuyendo en los lotes sucesivos hasta en un 22%. El consumo de glucosa fue similar en todos los casos.

Con los datos obtenidos se comparo la produccion de etanol respecto a la relacion superficie/volumen (S/V) y densidad celular para los diferentes diametros. Los resultados se muestran en la tabla 1. De acuerdo con esto, la relacion S/V es inversa al diametro de las perlas obteniendose una menor relacion S/V para las perlas de 3 mm. Sin embargo, debido a la menor densidad celular obtenida en este diametro de perla se consiguio una mayor produccion de etanol. Con base en ello, la produccion promedio de etanol mostro una relacion directa con el diametro de perla e inversa respecto a la densidad celular, resultando una mayor produccion promedio de etanol de 50,1 g/L para las perlas de 3 mm de diametro. Asi tambien, la produccion acumulada de etanol durante los 4 lotes fue de 177,8, 189,5 y 200,2 g/L para las perlas de 2, 2,5 y 3 mm de diametro respectivamente, encontrandose una relacion lineal ([R.sup.2] = 0,99). Asimismo, el C[O.sub.2] producido en cada sistema fue concordante con la produccion de etanol.

En concordancia con la produccion de etanol, la mayor productividad volumetrica alcanzada correspondio a los biorreactores con perlas de 3 mm, siendo 1,2 g/L/h. Ademas, la productividad total alcanzada por este mismo sistema (1,043 g.L.h) fue significativamente mayor respecto a los diametros de 2,5 y 2 mm (0,98 g/L/h y 0,926 g/L/h, respectivamente). Por ultimo, en la tabla 2 se presentan los rendimientos maximos para cada diametro de perla, observandose que la produccion de etanol por perla es superior en aquellas de 3 mm de diametro para el segundo lote, alcanzando un 97 % del rendimiento teorico.

Discusion

Aunque S. cerevisiae es la principal responsable en la fermentacion alcoholica, otras especies de Saccharomyces sensu stricto, como S. bayanus (S. uvarum) y S. paradoxus pueden actuar tambien como cultivos iniciadores de la fermentacion (Querol et al., 2003; Redzepovic et al., 2002). Se ha reportado que algunas especies de S. bayanus tienen caracteristicas de fermentacion inusuales y especificas, con altas tasas de crecimiento y mejor fermentacion a bajas temperaturas en comparacion a S. cerevisisae, ademas de su alta capacidad de produccion de aromas (Masneuf et al., 1998; Querol et al., 2003). Sin embargo, existen pocos reportes sobre su comportamiento en inmovilizacion (Mc Ghee et al., 1982).

La inmovilizacion de celulas por atrapamiento en gel tiene algunas limitaciones, principalmente referidas a las restricciones difusionales internas, por lo que el tamano de perla es un parametro importante por considerar. La estrategia mas comun para mejorar la transferencia interna de masa es reducir el diametro de perla, lo cual conlleva una situacion de compromiso de elegir el menor tamano posible, manteniendo las caracteristicas operativas de las perlas (Norton y D'Amore, 1994).

Los problemas difusionales y, por tanto, el diametro de perla tambien tienen influencia en la produccion de etanol (Lin y Tanaka, 2006). Se han reportado problemas difusionales con diametros mayores a 3,5 mm (Norton y D'Amore, 1994). Los resultados obtenidos en este estudio con S. uvarum (S. bayanus) coinciden con esto, ya que se registro un aumento en la produccion y rendimiento de etanol hasta un diametro de 3 mm, pero se obtuvo lo contrario a lo obtenido en un estudio semejante con Saccharomyces cerevisiae (Goksungur et al., 2001), en el cual la produccion de etanol disminuyo a medida que se incremento el diametro de las perlas, obteniendo producciones de 42,7, 46,2 y 38,1 g/L para los diametros 1,3-1,7, 2,0-2,4 y 2,8-3,2 mm, respectivamente. Aunque al aumentar el tamano de las perlas disminuye el area superficial disponible para la transferencia de masa de sustrato dentro y a traves de las perlas (Goksungur et al., 2001), se han reportado cambios fisiologicos y metabolicos relacionados con procesos de inmovilizacion celular. Estos cambios podrian atribuirse a una modificacion en el entorno fisico y quimico de las celulas inmovilizadas, estrechamente asociados a limitaciones en transferencia de masa al interior del sistema, lo cual puede contrarrestarse por el empleo de monocapas celulares o trabajando a bajas densidades celulares (Norton y D'Amore, 1994). Segun esto, los resultados obtenidos en el presente estudio para las perlas de 3 mm de diametro en las que se obtuvo la mayor productividad de etanol a pesar de tener menor relacion S/V, mostrarian un importante efecto de la densidad celular para la transferencia de masa, lo cual no ha sido evaluado en los estudios mencionados. De acuerdo con el diseno de los experimentos, la densidad celular fue menor conforme se aumento el diametro de las perlas, con lo cual esta resulta ser el parametro mas significativo en relacion con los problemas difusionales (Tabla 1).

Desde el punto de vista operativo, el diametro de 3 mm es aun manejable, mantiene su resistencia y permite la facil separacion de biomasa. Otros autores han reportado diametros optimos de 1 a 1,6 mm para contrarrestar problemas difusionales en la produccion de etanol (Norton y D'Amore, 1994). Otro aspecto tambien importante en la inmovilizacion en alginato, es la concentracion del mismo. En otros estudios realizados se menciona la importancia de la dureza y la rigidez de las perlas en relacion con la concentracion de alginato. Trabajando con Saccharomyces cerevisiae inmovilizada con soluciones de alginato al 1,5, 2, 3 y 6 %, la solucion de alginato al 2% resulto la mas adecuada para evitar inconvenientes en la difusion de los nutrientes a altas tasas de actividad celular y con buenas caracteristicas de resistencia del gel durante todo el tiempo de cultivo (Najfpour et al., 2004). Estos resultados coinciden con los del presente estudio, ya que la utilizacion de alginato al 2% permitio mantener la integridad de las perlas durante los cuatro lotes de cultivo con rendimientos maximos de etanol cercanos al valor teorico.

Otras variables importantes en la inmovilizacion de levaduras para la produccion de etanol incluyen el soporte de la inmovilizacion, del tipo de cultivo utilizado, el sistema de cultivo (cultivo en lote o cultivo continuo), la concentracion y el tipo de azucar, y la temperatura de fermentacion.

Altas concentraciones de glucosa muestran un efecto inhibitorio en la produccion de etanol, aunque se ha sugerido un menor efecto en celulas inmovilizadas (Lin y Tanaka, 2006). En el presente estudio, los valores de rendimiento maximo de etanol (Tabla 2) para todos los diametros de perla probados a una concentracion de 12% de glucosa confirman esta ventaja en celulas inmovilizadas. Asimismo, Mc Ghee et al. (1982) utilizaron Saccharomyces uvarum, Saccharomyces cerevisiae y Zymomonas mobilis inmovilizadas en alginato para produccion de etanol en cultivo continuo, para lo cual probaron concentraciones de glucosa de 1, 3, 5, 10 y 20%. En estas condiciones no se observo una gran variacion en la produccion de etanol entre las concentraciones de 1, 3, 5 y 10% en columnas empaquetadas con las perlas; pero cuando la concentracion de glucosa se incremento del 10 al 20%, la produccion de etanol de las cepas disminuyo. En cambio, en columnas con una distribucion uniforme de perlas, la produccion de etanol de S. uvarum aumento. Tomando en cuenta esto, y considerando un bajo empaquetamiento del reactor usado en este estudio (figura 2), los resultados coinciden con lo encontrado por estos autores para S. uvarum (S. bayanus), por lo cual se puede sugerir una concentracion de 1 2% de glucosa para la produccion de etanol con Saccharomyces uvarum en reactores no empacados. Concentraciones mayores podrian producir inhibicion en la produccion de etanol, como fue demostrado para otras especies como Saccharomyces cerevisiae (Sree et al., 2000).

Respecto a la temperatura, se conoce que este parametro tambien tiene una marcada influencia en la productividad la cual, en el caso de S. cerevisiae, disminuye al disminuir la temperatura de fermentacion (Bakoyianis et al., 1997). Sin embargo, S. uvarum (S. bayanus) mantiene su capacidad fermentativa a bajas temperaturas (Querol et al., 2003). En este estudio la temperatura fue controlada a 28[grados]C por lo cual no se evaluo el efecto de esta variable.

Finalmente, la productividad maxima de etanol obtenida en el presente trabajo con Saccharomyces uvarum inmovilizada fue de 1,2 g/L/h, equivalente a 57,8 g/L para una concentracion inicial de glucosa de 120 g/L, valores comparables o mayores a los obtenidos por otros autores. Asi, la produccion y el rendimiento alcanzados en este estudio utilizando un sistema de lotes repetidos fueron mayores a los alcanzados por Mc Ghee et al. (1982) en cultivos continuos con 10% de glucosa para S. cerevisiae (47 g/L) y S. uvarum (40 g/L), y semejantes a los valores de productividad de 60,3 g/L/dia obtenidos por Bakoyianis et al. (1997), con Saccharomyces cerevisiae alcohol-resistente, y criotolerante que fue inmovilizado en alginato de calcio en un medio de fermentacion con 12,0 Be (equivalentes aproximadamente a 240 g/L de azucar).

Debido a los pocos estudios realizados con Saccharomyces uvarum (S. bayanus) inmovilizada para la produccion de etanol, los resultados obtenidos en el presente estudio son de utilidad para considerar a esta especie como una buena alternativa en la produccion de etanol.

Conclusiones

De acuerdo con los resultados obtenidos, el rendimiento y la produccion de etanol con Saccharomyces uvarum (S. bayanus) inmovilizada en 2% de alginato estan directamente relacionados con el diametro de esferas e inversamente con la densidad celular. Para los tres diametros evaluados, las perlas con mayor diametro y menor densidad celular (3 mm) mostraron el mayor rendimiento y la mayor produccion; mientras que las esferas de menor diametro y mayor densidad celular (2 mm) tuvieron los menores valores para estas variables. Asimismo, por los rendimientos obtenidos, S. uvarum NRRL Y-11877 inmovilizada en alginato muestra una buena capacidad fermentativa para la produccion de etanol.

Agradecimientos

El presente trabajo fue subvencionado por el Laboratorio de Micologia y Biotecnologia (LMB), Universidad Nacional Agraria La Molina, Peru. Los autores desean expresar su reconocimiento al senor Mario Garcia por su asistencia tecnica.

Recibido: diciembre 6 de 2009 Aprobado: mayo 9 de 2011

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Martha V. Jimenez *, Gabriella G. Zarkovic *, Gretty K. Villena *, Marcel Gutierrez-Correa *

* Investigadores del Laboratorio de Micologia y Biotecnologia, Universidad Nacional Agraria La Molina, Lima, Peru, gkvch@lamolina.edu.pe mgclmb@lamolina.edu.pe
Tabla 1. Comparacion de parametros de productividad de
etanol para tres diametros de perlas con S. uvarum
inmovilizada en alginato

   Diametro de      Relacion S/V      Densidad
   perla (mm)       ([mm.sup.2]/      celular
                    [mm.sup.3])    (x [10.sup.5]/
                                    [mm.sup.3])

2,0 [+ o -] 0,07       3,0           2,54 (c)
2,5 [+ o -] 0,02       2,43          1,03 (b)
3,0 [+ o -] 0,14       2,0           0,19 (a)

   Diametro de           Produccion             Produccion
   perla (mm)            promedio de             promedio
                        etanol (g/L)           de C[0.sup.2]
                                                   (g/L)

2,0 [+ o -] 0,07   44,5 [+ o -] 2,9 (c)   41 [+ o -] 0,8 (c)
2,5 [+ o -] 0,02   47,4 [+ o -] 2,9 (b)   45 [+ o -] 0,6 (b)
3,0 [+ o -] 0,14   50,1 [+ o -] 6,1 (a)   47 [+ o -] 0,8 (a)

   Diametro de           Produccion de         Productividad
   perla (mm)              etanol por           volumetrica
                           perla (g)             maxima de
                                                  etanol
                                                  (g/L/h)

2,0 [+ o -] 0,07   0,076 [+ o -] 0,001 (c)      1,00(c)
2,5 [+ o -] 0,02   0,083 [+ o -] 0,001 (b)     1,03 (b)
3,0 [+ o -] 0,14   0,148 [+ o -] 0,003 (a)     1,20 (a)

   Diametro de      Productividad   Produccion   Rendimiento
   perla (mm)         total de      acumulada    de etanol/
                       etanol       de etanol      glucosa
                       (g/L/h)        (g/L)       consumida
                                                    (g/g)

2,0 [+ o -] 0,07     0,926(c)       177,8 (c)     0,38 (c)
2,5 [+ o -] 0,02     0,987 (b)      189,5 (b)     0,41 (b)
3,0 [+ o -] 0,14     1,043 (a)      200,2 (a)     0,43 (a)

Los valores representan el promedio de cuatro repeticiones
[+ o -] SD. Promedios con la misma letra dentro de una
columna no son apreciablemente diferentes (P < 0,0001).
Los datos fueron evaluados por el analisis de varianza
(Anova) y la prueba de Duncan de rangos multiples.

Tabla 2. Rendimientos maximos de etanol por Saccharomyces
uvarum inmovilizada en alginato al 2%

Diametro   No. de   Rendimiento   Consumo de
  (mm)      Lote    respecto al   glucosa (%)
                    teorico (%)

  2,0        2          81c          99,6c
  2,5        3          83b          99,7b
  3,0        2          97a          99,8a

Los valores representan el promedio de cuatro repeticiones. Los
promedios con la misma letra dentro de una columna no son
significativamente diferentes (p < 0,0001). Los datos fueron
evaluados por el analisis de varianza (Anova) y la prueba de
Duncan de rangos multiples.
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Title Annotation:ARTICULO DE INVESTIGACION
Author:Jimenez, Martha V.; Zarkovic, Gabriella G.; Villena, Gretty K.; Gutierrez-Correa, Marcel
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Jul 1, 2011
Words:4599
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