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Efecto antitumoral del extracto acuoso de Bomarea cornigera (Alstroemeriaceae) en sarcomas inducidos en ratones.

Antitumoral effect of the aqueous extracts of Bomarea cornigera (Alstroemeriaceae) on the sarcoma induced in mice

Introduccion

Desde hace 3500 anos el hombre ha empleado las plantas para el tratamiento del cancer y son mas de 3000 especies de plantas las que se han reportado para el tratamiento de esta enfermedad, las cuales inhiben, revierten o retardan la carcinogenesis multiestadio (Young-Joon et al. 2001). El periodo de investigacion cientifica al respecto es mucho mas reciente, ya que es en 1958 cuando se aislo la vinblastina, y como resultado de ello, el Instituto Nacional del Cancer de los Estados Unidos de America (NCI) inicio diversas investigaciones acerca de las plantas con actividad anticancerosa, lo que condujo al aislamiento y conocimiento del mecanismo de accion de sustancias como las podofitoxinas, taxanos y camptotecinas. Posteriormente se han aislado de plantas compuestos que se encuentran en fase clinica como es el caso de la combretastatina A-4. (Vega-Avila et al. 2006).

La medicina tradicional es una actividad mundialmente reconocida y tiene una importancia economica creciente. Solamente en el ano 2007 se gastaron en todo el mundo 4 billones de dolares por la venta de drogas anti cancer de origen vegetal y es significativo que de los 141 medicamentos contra el cancer que existen en el mercado de Estados Unidos de America, aproximadamente el 67% de estos son de origen natural (Vega Avila et al. 2006).

En los paises en desarrollo, la medicina tradicional es a menudo el unico y valido tratamiento accesible (Bussmann & Sharon 2006). Las investigaciones para encontrar una droga anticancer efectiva han motivado a los cientificos para investigar la eficacia de los productos naturales en el tratamiento del cancer, teniendo en cuenta que la literatura indica que mucha gente se cura del cancer usando solo productos naturales las cuales en su mayoria tienen efecto antiproliferativos y mejorador de la respuesta inmune entre otros. Segun Fabricant y Farnsworth (2001), el 80% de 122 drogas derivadas de plantas estaban relacionadas a su proposito etnofarmacologico original, dichas plantas eran originarias de los paises tropicales.

La familia Alstroemeriaceae esta distribuida desde Venezuela hasta Argentina especialmente en habitats secos. En el Peru, son reconocidos dos generos, Alstroemeria y Bomarea, y 85 especies basicamente hierbas y enredaderas. El genero Bomarea se distribuye desde Mexico hasta el norte de Argentina y Chile, esta restringido a la cordillera (hasta los 5200 m de altitud). El centro de diversidad es Ecuador y Peru (Hofreiter & Rodriguez 2006) y la mayoria de ellas son ornamentales. Bussmann & Sharon (2006) publicaron un compendio de plantas medicinales utilizadas en el norte del Peru y senalaron a Bomarea dulcis (Hook.) Beauv. como una planta usada para proteger y prevenir enfermedades. Bomarea cornigera Herb. es un bejuco, endemico del Peru, conocido solo en el centro del pais, en unas pocas localidades, en la cuenca del Tulumayo. Si bien el valle de Chanchamayo ha sido extensamente alterado ecologicamente, esta especie ha sido registrada en diferentes anos desde el siglo XIX. (Leon & Salinas 2006).

La ciclofosfamida es una droga alquilante antineoplasica, utilizada para desacelerar o detener el crecimiento de celulas cancerosas (linfomas, mielomas multiples, leucemias, neuroblastoma, carcinoma ovarico, retinoblastoma, cancer del seno, etc.) (Pino et al. 2009).

Material y metodos

Se utilizaron ratones machos (Mus musculus) de la cepa albina Swiss de 6 a 8 semanas de edad y de 20 - 30 g de peso fueron obtenidos del Bioterio del laboratorio de Reproduccion y Biologia del Desarrollo de la Facultad de Ciencias Biologicas de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Todos los ratones fueron mantenidos bajo un regimen de 14 horas luz y 10 horas oscuridad, 22 - 24[grados]C, 75 - 85 % HR y alimentados con alimento balanceado para animales (Purina, Peru), y agua ad libitum.

Bejucos de Bomarea cornigera Herb. fueron obtenidos de las comunidades indigenas Ashaninka de la provincia de Chanchamayo, departamento de Junin, en el mes de noviembre de 2005. En el laboratorio, fueron identificados por las claves vigentes (Hofreiter & Rodriguez 2006).

Se utilizaron una solucion R10 (RPMI 1640 Sigma-Aldrich), suplementado con suero bovino fetal inactivado (Gibco), solucion hepes 1M (Sigma) y L-GlutaminePe-Streptomycin (Sigma), ciclofosfamida (CP) [N, N - bis (2 - cloroetil) tetrahidro - 2H -1, 3, 2 -oxazafosforin - 2 - amino 2 - oxido] - Endoxan 200 mg, agua destilada, y Azul de Trypan.

Para la preparacion del extracto acuoso, se hirvieron nudos (8 - 10 g) del tronco del bejuco en agua destilada por cada dosis, durante 30 min hasta obtener una infusion en recipientes conteniendo: 2 nudos en 1000mL (1X), 2 nudos en 500 mL (2X) y 2 nudos en 250 mL (4X) mL de agua, las dosis se mantuvieron a una temperatura de -20[grados]C en condiciones de esterilidad para su uso diario.

Para formar los tumores solidos se trabajo con celulas de la linea TG180. Las celulas fueron descongeladas a bano maria durante 1 minuto, luego se anadio al vial 1mL de solucion R10 (RPMI 1640 - Sigma-Aldrich suplementado con Suero Bovino Fetal inactivado - Gibco, Solucion Hepes 1M Sigma y L-Glutamine-Pe-Streptomycin Sigma) y se traslado todo el contenido a un tubo Falcon de 15 mL con 8 mL de R10 a 4[grados]C. Las celulas de sarcoma fueron lavadas 3 veces centrifugandolas a 500 g por 10 min a 5[grados]C. Las celulas fueron estabilizadas en R10 (37[grados]C, 5% de C[O.sub.2]) durante 4 h.

Para determinar la viabilidad y recuperacion, se determino la concentracion celulas de sarcoma mediante el conteo de celulas viables y no viables tenidas con un colorante vital (Azul de Trypan) y con ayuda de un microscopio compuesto. Con esos datos se calculo la viabilidad con la formula (Celulas vivas/ celulas totales x100).

Cada raton fue inyectado subcutaneamente (dorso) con 105 celulas/100 [micron]L. Luego de la inoculacion los ratones fueron observados (comportamiento, respiracion e irritabilidad) a los 30, 60, 120, 360 y 720 minutos posteriores al inoculo y luego cada 24 h, a fin de evaluar cualquier cambio que nos indique alguna reaccion secundaria durante el proceso de colonizacion del de las celulas tumorales. Se espero 15 dias para que el sarcoma se desarrollara, luego de lo cual se inicio la fase del tratamiento.

Diseno experimental.- Los ratones fueron distribuidos al azar en cinco grupos (n = 5, cada grupo) de tratamiento: Al grupo control positivo (TI), se le inyecto intraperitone almente (i.p.) Ciclofosfamida (0,3 mg/mL), a los Grupo TII (1X), Grupo TIII (2X), Grupo TIV (4X) se les inyecto via i.p. las dosis preparadas y guardadas; y al control negativo (TV), se le inyecto i.p. agua destilada (Grochow & Ames 1997); Los tratamientos fueron aplicados una vez al dia, a la misma hora (12:00 m) durante 17 dias.

Evaluacion de los ratones.- Al finalizar el periodo de tratamiento los animales fueron eutanizados por dislocacion cervical y se procedio a realizar la extraccion de los tumores (Bezerra et al. 2006). Para ello se realizo una diseccion alrededor del tumor, teniendo mucho cuidado de no comprometer la integridad de este. Luego el tumor fue limpiado de grasa y piel. Los parametros evaluados en los tumores fueron: peso y diametro (balanza analitica y vernier, respectivamente). La tasa de inhibicion (%) fue calculada por la siguiente formula:

Tasa de inhibicion (%) = [(A - B)/A] x 100

Donde A es el peso promedio del tumor del control negativo, y B es el peso del tumor en el grupo tratado. Se reviso, ademas otros organos como higado, rinones, pulmon, estomago, pancreas, intestinos y corazon en busca de alguna anomalia morfologica con ayuda de un microscopio de diseccion.

Analisis estadisticos.- Los resultados fueron expresados como medias [+ o -] D.S. y analizados por la prueba de ANOVA para un factor y el Test de Tukey (SPSS 15), p < 0,05 fue considerado estadisticamente significativo.

Resultados

El extracto acuoso de B. cornigera inhibio al sarcoma 180 (TG 180) en el ensayo in vivo en ratones (Tabla 1). El tamano del tumor decrecio y la tasa de inhibicion aumento con el tiempo en el grupo tratamiento II (1X) comparado con el control, esto fue mas evidente en los ultimos dias de observacion.

Viabilidad de la linea celular TG 180

El numero de celulas TG180 iniciales en el vial fue 12,3 x [10.sup.6]; luego de realizar el primer recuento se obtuvo 9,5 x [10.sup.6] celulas vivas y 1,75 x [10.sup.6] celulas muertas lo que significa una viabilidad del 84,49% y una recuperacion del 91,46%, mientras que luego del establecimiento de las celulas en el segundo recuento se consiguio una viabilidad del 82,95% y una recuperacion del 82,95%.

Estos resultados demuestran que las celulas se encontraban en optimas condiciones para ser inoculadas en los ratones. Se logro formar tumores solidos a partir de celulas TG180 en el 100% de los ratones inoculados.

Peso y longitud del tumor

Al evaluar los datos de peso y longitud del tumor entre los diferentes tratamientos se observo que el tratamiento II (1X) tuvo efectos similares a los observados al grupo tratado con ciclofosfamida. Sin embargo, al evaluar las otras dosis de Bejuco se observo que estas no tuvieron efecto alguno sobre los tumores tratados, siendo la respuesta similar a la del control negativo. Al evaluar los organos de los ratones no se observaron alteraciones morfologicas visibles.

Discusion

El presente trabajo reporta la actividad antitumoral del extracto acuoso de Bomarea cornigera en ratones a los cuales se les transplanto subcutaneamente celulas de Sarcoma 180. El Sarcoma 180 es un tumor originario de ratones y uno de las mas frecuentes lineas celulares utilizados en investigaciones in vivo relacionados a los agentes antitumorales (Bezerra et al. 2006). Los resultados obtenidos muestran que la infusion de B. cornigera a la concentracion 1X posee un efecto antitumoral, tanto en terminos de peso como en longitud, similar al de la Ciclofosfamida (Tabla 1), sin embargo la Ciclofosfamida posee un indice terapeutico muy bajo y es frecuente encontrar efectos toxicos especialmente en pacientes que han recibido tratamiento inmunosupresor, ademas de ser potencialmente teratogenico. Dentro de las principales reacciones adversas de la ciclofosfamida tenemos toxicidad hematologia, astenia, malestar general, infertilidad y alopecia (Grochow & Ames 1998; Sallan et al. 2006). Es por ello la importancia de encontrar tratamientos alternativos con plantas medicinales que muestren una eficacia similar pero sin presentar efectos adversos, lo que repercutiria directamente en mejorar la calidad de vida de los enfermos de cancer que actualmente estan bajo tratamiento quimioterapeutico (Natesan et al. 2007, Xie et al. 2008, Xue et al. 2009).

Aunque se podria esperar una mayor eficacia como efecto antitumoral a mayor concentracion de la infusion, esto no fue asi ya que se encontro a 1X la mayor reduccion y eliminacion del tumor, debido a una sobresaturacion de los componentes activos sobre el sustrato. Nuestra observaciones de los organos como higado, estomago, rinon, pulmones y cerebro no encontraron danos. Sin embargo es necesario realizar estudios sobre los posibles efectos toxicos de la infusion de B. cornigera en los sistemas biologicos. Segun Rao et al. (2008) cuando se ha utilizado Withaferina --A (obtenida de la solanacea Withania somnifera) en ratones inoculados con sarcoma 180, se observo un retardo significativo del crecimiento tumoral en dosis de 10, 12, 15 mg/kg de peso corporal, sin evidenciar ninguna toxicidad sistemica notable.

En la mayoria de los casos, los fitoquimicos contra el cancer, aislados de plantas medicinales, actuan como potentes antioxidantes o antagonistas de los radicales libres y de esta manera minimizan el dano al DNA previniendo el cancer (Madhuri & Pandey 2009). Otros fotoquimicos son inhibidores de la lipooxigenasa y de la urokinasa (Rao et al. 2008). Igualmente, los flavonoides tienen un rol quimo preventivo en el cancer a traves de sus efectos en la transduccion de senales en la proliferacion celular (Rajkapoor et al. 2004).

El mecanismo de accion responsable de la actividad antitumoral de la infusion de B. cornigera aun no esta elucidado, sin embargo actualmente se esta estudiando a nivel mundial el rol que tienen las sustancias naturales de diferentes plantas con propiedades medicinales sobre los diferentes sistemas biologicos del organismo para demostrar su efecto antitumoral, entre ellos tenemos los que buscan factores de inhibicion de la mitosis (Bezerra et al. 2006), aquellos que estimulan al sistema inmune (Malik et al. 1991, Ismaili et al. 2009) o los que actuarian sobre el material genetico (Hu et al. 2007), es por ello la importancia de disenar pruebas posteriores como el ELISPOT con la cual podriamos medir el grado de expresion del INF-[gamma] por parte de los linfocitos T (Alzamora et al. 2007) y que permitirian esclarecer a que nivel estaria actuando la infusion de B. cornigera; ademas de analisis que permitan determinar la composicion quimica de la infusion y establecer las fracciones que contienen los principios activos.

El presente estudio in vivo puntualiza la potencial actividad antitumoral de B. cornigera, sin embargo es importante senalar que se requieren estudios posteriores a fin de caracterizar los principios activos y elucidar los mecanismos biologicos por los cuales la infusion estaria teniendo este efecto.

Literatura citada

Alzamora L., E. Alvarez, D. Torres, H. Solis, Colona E. et al. 2007. Efecto de cuatro ecotipos de Lepidium peruvianum Chacon sobre la produccion de oxido nitrico in vitro. Rev. peru. biol. numero especial 13(3): 215 - 217.

Bezerra D., F. Castro, A. Alves, et al. 2006. In vivo growth-inhibition of Sarcoma 180 by piplartine and piperine, two alkaloid amides from Piper. Brazilian Journal of Medical and Biological Research 39:801 - 807.

Bussmann R. & D. Sharon. 2006. Traditional medicinal plant use in Northern Peru: tracking two thousand years of healing cultura. Journal of Ethnobiology and Ethnomedicine 2:47 [http://www.ethnobiomed.com/content/2/1/47].

Fabricant D.S., & N. R. Farnsworth. (2001). The value of plants used in traditional medicine for drug discovery. Environ Health Perspect 109: 69-75.

Grochow L. & M. Ames. (Eds.). 1998. A Clinician's Guide to Chemotherapy PharmacoKinetics and Pharmacodynamics. Lippincott Williams & Wilkins Publishers.

Hofreiter A. & E. Rodriguez. 2006. The Alstroemeriaceae in Peru and neighbouring areas. Rev. peru. biol. 13(1): 5 - 69.

Hu S., S. Chen, X. Li, R. Qin, & Z. Mei. 2007. Antitumor effects of Chi-Shen extract from Salvia miltiorrhiza and Paeoniae radix on human hepatocellular carcinoma cells. Acta Pharmacologica Sinica 28 (8): 1215-1223.

Ismaili N. Y. Bensouda, N. Mellas & H. Errihani. 2009. Role of chemotherapy in the management of primary rectal lymphoma: a case report and review of the literatura. Cases Journal 2:9373

Leon B. & N. Salinas. 2006 Alstroemeriaceae endemicas del Peru. Rev. peru. biol. Numero especial 13(2): 685 - 689.

Madhuri S. & G. Pandey. 2009. Some anticancer medicinal plants of foreign origin. Current Science 96 (6): 779-783.

Malik S., R. Knowles, N. East, et al. 1991. Antitumor Activity of -y-Interferon in Ascitic and Solid Tumor Models of Human Ovarian Cancer. Cancer Research 51: 6643-6649.

Natesan S., S. Badami, S. Dongre & A. Godavarthi. 2007. Antitumor Activity and Antioxidant Status of the Methanol Extract of Careya arborea Bark Against Dalton's Lymphoma Ascites-Induced Ascitic and Solid Tumor in Mice. Journal of Pharmacology Science 103:12 - 23.

Patel B., D. Sattwik, R. Prakash & M. Yasir. 2010. Natural Bioactive Compound with Anticancer Potential. International Journal of Advances in Pharmaceutical Sciences 1:32-41.

Pino J., M. Noblecilla, P. Diaz, et al. 2009. Efecto del extracto acuoso de Uncaria Tomentosa Wiild D.C. sobre la calidad espermatica de ratones tratados con Ciclofosfamida. Revista Cientifica 6(3):244 - 249.

Rajkapoor B., B. Jayakar, & N. Murugesh. 2004. Antitumor activity of Indigofera aspalathoides on Ehrlich Ascites carcinoma on mice. Indian Journal of Pharmacology 36(1): 38-40.

Rao G., S. Kumar, M. Islamand & S. Mansour. 2008. Folk medicines for anticancer therapy-a current Status. Cancer Therapy 6: 913-922.

Sallan S., B. Camitta, D. Chan, D. Traggis, & N. Jaffe. 2006. Chemotherapy with cyclophosphamide, vincristine, cytosine arabinoside, and prednisone (COAP) in childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL). Medical and Pediatric Oncology 3 (4): 359 - 364.

Vega-Avila E., R. Velasco-Lezama & M. Jimenez-Estrada. 2006. Las plantas como fuente de compuestos antineoplasicos. Revision. Bioquimia 31(3): 97-111.

Xie Y., T. Morikawa, K. Nimomiya, et al. 2008. Medicinal Flowers, XXIII. New Taraxastane-Type Triterpene, Punicanolic Acid, with Tumor Necrosis Factor -a Inhibitor Activity from the Flowers of Punica granatum. Chemical Pharmacy Bulletin 56(11):1628-1631.

Xue Z., W. Yu, M. Wu, & J. Wang. 2009. In Vivo Antitumor and Antioxidative Effects of a Rapeseed Meal Protein Hydrolysate on an S180 Tumor-Bearing Murine Model. Bioscience Biotechnology Biochemistry. 73 (11):2412-2415.

Young-Joon S., Hye-Kyung N., Ji-Yoon L. & Y. Sam Keum. 2001. Molecular Mechanisms Underlying Anti-Tumor Promoting Activities of Heat-Processed Panax ginseng C.A. Meyer. Journal of Korean Medicine Science 16 (Suppl): S38-41.

Jose Suarez (1,2) *, Christian Villanueva (1,2), Claudia Rodriguez (1,2), Karol Lavado (1), Melissa Barbieri (2), Luis Guzman (1,2), Ricardo Alfaro (1,2) y Jose Pino (1)

* Direccion para correspondencias

(1) Laboratorio de Reproduccion y Biologia de Desarrollo. Facultad de Ciencias Biologicas. Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Ciudad Universitaria, Av. Venezuela s/n. Apartado postal 11-058, Lima 11.

(2) Asociacion Presservaris. Calle Felix Tello Mz K lot 2 Urb. Honor y Lealtad, Surco. Lima, Peru. Telefono. 51 1 2577556.

Email Jose Suares: jsuarez@presservaris.org

Presentado: 05/07/2010

Aceptado: 22/11/2010

Publicado online: 21/01/2011
Tabla 1. Efecto (en porcentaje) de la infusion de extracto acuoso de
Bomarea cornigera sobre la inhibicion de tumores inducidos por
celulas de Sarcoma TG180 en ratones.

Tratamiento                     Peso (g)      Longitud    Eliminacion
                                                (mm)         tumor

Control            Tumor       0,92806 (a)   14,26 (a)        0/5
  Negativo     Inhibicion %        --            --

Control            Tumor       0,1752 (b)     5,28 (b)        3/5
  Positivo     Inhibicion %       81,12        62,97

Tratamiento        Tumor       0,11652 (b)    3,98 (b)        3/5
  1X           Inhibicion %       87,44        72,09

Tratamiento        Tumor                     10,64 (a)        1/5
  2X           Inhibicion %       8,52         25,39

Tratamiento        Tumor       0,77136 (a)   11,93 (a)        1/5
  4X           Inhibicion %       16,88        16,34

(a) y (b) indican diferencias estadisticamente significativas P<0,05.
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Title Annotation:NOTA CIENTIFICA
Author:Suarez, Jose; Villanueva, Christian; Rodriguez, Claudia; Lavado, Karol; Barbieri, Melissa; Guzman, L
Publication:Revista peruana de biologia
Article Type:Report
Date:Dec 1, 2010
Words:3193
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