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Efecto antioxidante de la melatonina durante la conservacion de semen de cerdo.

INTRODUCCION

En el cerdo la preservacion del semen es limitada debido a que los espermatozoides de esta especie son especialmente sensibles a temperaturas por debajo de 15[grados]C, las cuales generan danos en la membrana plasmatica y en el acrosoma, alterando la viabilidad y funcionalidad de la celula espermatica (24).

Tales efectos de la conservacion seminal se han relacionado con la produccion excesiva de radicales libres (RL) en el espermatozoide (7) que a altas concentraciones generan estres oxidativo (EO), causando alteraciones celulares como la lipoperoxidacion de la membrana plasmatica, situacion a la que el espermatozoide es particularmente susceptible, debido a las altas concentraciones de acidos grasos polinsaturados en la membrana plasmatica (28).

Si bien los espermatozoides son sensibles al estres oxidativo, tambien estan equipados con un sistema antioxidante en el plasma seminal e intracelular (7), los cuales estan armonicamente integrados (1, 6) para contrarrestar los efectos toxicos de las especies reac tivas de oxigeno (EROs) (7).

Dentro del sistema antioxidante enzimatico del semen destaca la superoxido dismutasa (SOD) (10), y se ha podido constatar que a lo largo de la curva de enfriamiento del proceso de criopreservacion y en el postdescongelamiento, la concentracion de esta enzima disminuye, dejando expuesto a los espermatozoides a la accion de los RL (15).

En tal sentido, en los ultimos anos se han realizado estudios con el uso de diferentes antioxidantes (vitamina C y vitamina E) en los diluyentes, para evitar el efecto deletereo de los RL durante la conservacion espermatica en diferentes especies (7).

Se ha demostrado la actividad antioxidante de la melatonina, con efectos superiores a otros antioxidantes (E, C y N-acetilcisteina) a nivel de celulas hepaticas y una de sus principales cualidades es que varios de los metabolitos, como el N1-acetil-N2-formil 5-methoxykynuramine y N1-acetil-5-methoxykynuramine, que resultan de la interaccion de la melatonina con el radical hidroxilo, funcionan tambien como eliminadores de RL, es decir, que una molecula de melatonina puede neutralizar hasta 3 radicales libres (22, 23, 29).

En base a estos antecedentes, la presente investigacion planteo como objetivo determinar el efecto de la adicion de melatonina como antioxidante durante la conservacion de semen de cerdo diluido.

MATERIAL Y METODOS

Poblacion y muestra. El estudio se llevo a cabo en la UCLA (Barquisimeto, Venezuela). Las 20 muestras de semen para el estudio, fueron tomadas de verracos de 7-18 meses de edad y de razas Landrace, Large White y Duroc, procedentes de la granja de reproductores de Inversiones Porcinas C.A., ubicada en la carretera vieja Yaritagua-Barquisimeto, estado Yaracuy-Venezuela. Los machos reproductores seleccionados como donadores de semen eran animales sanos, mantenidos en condiciones optimas de salud, en un habitat limpio y con una nutricion balanceada, siguiendo lo establecido en el Codigo de Etica para la Vida de la Republica Bolivariana de Venezuela (2010) en su segunda parte capitulo 3.

Toma de muestra. La recoleccion de la muestra seminal se realizo mediante masaje peneano con mano enguantada en un potro adecuado para tal fin. Luego de obtener las muestras experimentales, fueron analizadas en el laboratorio de la granja y las que cumplian con los criterios de seleccion seminal para los programas de inseminacion artificial, fueron diluidas para su conservacion a 16[grados]C con diluyente comercial para semen de cerdo (MR-A[R]), tomando en cuenta el volumen y la densidad optica del eyaculado.

Manejo de la muestra. De cada eyaculado seleccionado al azar, el primer dia (dia 0) se prepararon 3 alicuotas de 5 ml, las cuales fueron etiquetadas como control (solo diluyente MR-A[R]), control con el vehiculo (etanol), y la alicuota con melatonina (Sigma[R]) a 1,25 mM, esta ultima diluida y agregada a razon de 20 [micron]l por ml de semen diluido.

Determinacion de indicadores hepaticos de lipoperoxidacion. Se midieron indicadores de estres oxidativo como los dienos conjugados (DC), que son los productos iniciales del proceso de lipoperoxidacion. Fueron extraidos con isopropanol y valorados por la tecnica de Wallin (30). El malondialdehido (MDA), producto final del proceso de lipoperoxidacion, se determino mediante el test para sustancias reaccionantes con el acido 2-tiobarbiturico acorde al metodo de Ohkawa (19). La actividad enzimatica de superoxido dismutasa (SOD) se obtuvo mediante un kit comercial (Cayman[R]) y los resultados fueron expresados en U de SOD/mg de proteinas. Las proteinas totales se determinaron mediante el kit Bio Rad (Richmond, CA, EEUU.) basado en el metodo de Bradford (3).

Tecnicas de procesamiento y analisis de datos. Los datos fueron analizados mediante paquete estadistico SPSS 15.0 para Windows y se realizo ANOVA de un factor con un criterio de clasificacion (p[menor que o igual a]0,05).

RESULTADOS

Al evaluar los niveles de DC y MDA como indicadores de estres oxidativo, se pudo evidenciar que en el semen con melatonina a 1,25 mM, los niveles de DC el dia 0 y 1 de conservacion presentaron elevacion significativa (p[menor que o igual a]0,05) de las concentraciones de este biomarcador, con respecto al grupo control y con vehiculo (Figura 1).

Por su parte, los niveles de MDA en las muestras con melatonina (Figura 2) presentaron niveles menores al dia 0, cuya reduccion se hizo significativa el dia 1 de conservacion (p[menor que o igual a]0,05).

Al evaluar la actividad enzimatica total de la SOD se pudo evidenciar que el grupo de muestras con melatonina presento mayor actividad enzimatica durante la conservacion, con diferencias significativas el dia 1 (p[menor que o igual a]0,05), con respecto al grupo control y con vehiculo (Figura 3).

Estos resultados demuestran que la melatonina a 1,25 mM en semen de cerdo diluido tiene efecto antioxidante durante la conservacion a 16[grados]C.

DISCUSION

La criopreservacion espermatica es una biotecnologia de gran trascendencia, debido a que tiene un papel relevante en la conservacion y difusion de recursos geneticos. Sin embargo, en el cerdo esta tecnica no ha tenido tanto exito como el obtenido en bovinos, por lo tanto el manejo del semen de cerdo para reproduccion asistida es principalmente en fresco o conservado mediante refrigeracion a 16 [grados]C (12).

Por otro lado, la conservacion de semen, es un procedimiento que genera EO al incrementar los niveles de EROS y al disminuir la disponibilidad de los antioxidantes endogenos (2). Este evento puede causar dano oxidativo en los espermatozoides durante el almacenamiento y ser la causa de disminucion de la movilidad y fertilidad, por lo que se ha evaluado utilizar antioxidantes exogenos para mantener la calidad seminal durante su conservacion (18).

En esta investigacion la melatonina a una concentracion 1,25 Mm tuvo accion antioxidante en el semen de cerdo los dias 0 y 1 de conservacion a 16[grados]C, con aumento de la actividad enzimatica de SOD y al evidenciar una interrupcion del proceso de la lipoperoxidacion, que pudiera ocurrir por la interaccion del radical lipoperoxilo con la melatonina, de esta manera el proceso de lipoperoxidacion entra en fase de terminacion, lo que promueve el aumento de los niveles de DC y la disminucion de MDA.

La mayoria de los estudios que evaluan EO en semen conservado, no determinan DC, lo que dificulta contrastar los resultados obtenidos. En el caso de los niveles de MDA, en esta investigacion se obtuvo un resultado similar al reportado por otros investigadores en semen de ciervo tratado con melatonina (8), la cual redujo los niveles de MDA. De igual forma existen reportes en semen humano, en el cual la melatonina disminuyo significativamente en un 63% el MDA en comparacion con el grupo control (13).

Por otra parte, en semen bovino almacenado in vitro hasta 30 h, la melatonina demostro tener efectos protectores sobre los parametros espermaticos relacionados con disminucion en la produccion de MDA, incluso en diferentes epocas del ano (21).

Sin embargo, en espermatozoides de gallos indigenas de Iran, la melatonina a concentraciones de 3 y 6 mM, disminuyo significativamente la viabilidad de los espermatozoides en comparacion al grupo control, con niveles maximos de MDA al usar melatonina a 6 mM (17). De igual manera, en otros estudios la melatonina a 1 Mm en semen de cerdo no obtuvo efecto antioxidante, por el contrario aumento los niveles de RL (16).

La variabilidad encontrada entre las especies en respuesta a la adicion de melatonina, pudiera deberse a la variacion en la susceptibilidad a la lipoperoxidacion que presentan los espermatozoides de cada una de ellas. Esta diferencia se ha relacionado a la proporcion de acidos grasos poliinsaturados (PUFA) en la membrana del espermatozoide (25) que juega un rol importante en las modificaciones fisicoquimicas que ocurren durante la fecundacion (14).

En el caso de las aves, la clase de PUFA que predomina en la membrana espermatica es del tipo n-6, especificamente 22C:4 y 20C:4 (27), mientras que en la mayoria de los mamiferos predominan (mas del 60% del total de acidos grasos) los de la serie n-3 de cadena larga altamente insaturados, como el 22:5, 22:6 y 20:4 que poseen alto riesgo de ser oxidados (4).

Asi el 22C:6 se encuentra en altas cantidades en la membrana de los espermatozoides del cerdo y se ha podido constatar en esta especie que, durante la conservacion, estos fosfolipidos van disminuyendo en proporcion en la membrana de los espermatozoides asociados al proceso de lipoperoxidacion (5).

Estos elementos pudieran afectar la respuesta a la adicion de melatonina al semen durante la conservacion entre las especies, de alli la importancia de que se realicen estudios previos, antes de adicionar antioxidante al semen para la criopreservacion, con el proposito de determinar la dosis correcta para mantener niveles adecuados de MDA durante la conservacion en cada una de las especies en particular, lo cual es de importancia debido a que altos niveles de este biomarcador de estres oxidativo se han asociado con disminucion de la capacidad fecundante que conlleva finalmente a infertilidad masculina (7).

En el caso de la actividad enzimatica de la SOD otros investigadores obtuvieron resultados similares a los del presente trabajo, al determinar que la melatonina a concentraciones de 0,1 mM elevo la actividad de la SOD en semen de bufalo luego de ser conservado en nitrogeno liquido (-196[grados]C) por 24 h en comparacion con el control (9).

Resultados similares se han obtenido en seres humanos con muestras espermaticas frescas, en caneros con semen congelado y en verracos con semen refrigerado, demostrando que la melatonina protege a los espermatozoides contra el estres oxidativo (11, 26).

Igualmente, en bovinos la melatonina eleva la actividad enzimatica de la SOD (21). La melatonina puede incluso preservar la actividad de enzimas antioxidantes a nivel intracelular durante la conservacion, aun en diferentes epocas del ano (20).

En base a los resultados se puede concluir que la melatonina a 1,25 mM, tiene efecto antioxidante (dias 0 y 1) en semen de cerdo conservado a 16[grados]C.

Agradecimientos: A la Unidad de Investigacion en Ciencias Funcionales Dr. Haity Moussatche y al Consejo de Desarrollo Cientifico, Humanistico y Tecnologico (CDCHT-UCLA) por su apoyo para la realizacion de esta investigacion.

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Flores, C.; Melendez, C.; Mendoza, C.; Marquez, Y.; Vilanova, L.T.

Unidad de Investigacion en Ciencias Funcionales Dr. Haity Moussatche (UNIHM), Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Centroccidental "Lisandro Alvarado" (UCLA), Barquisimeto (Lara, Venezuela). E-mail: caf06@hotmail.com

Recibido: 17 enero 2017 / Aceptado: 24 abril 2017
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Author:Flores, C.; Melendez, C.; Mendoza, C.; Marquez, Y.; Vilanova, L.T.
Publication:Revista Veterinaria
Date:Jul 1, 2018
Words:2919
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