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Early feeding to modify digestive enzyme activity in broiler chickens/La alimentacion temprana como modificador de la actividad de enzimas digestivas en pollos de engorde.

INTRODUCTION

In current poultry production, physical separation between the hatchery and farms can cause newborn chickens to spend a variable period of time without food, and usually between 36 to 48 hrs. pass after birth before birds have access to feed, reducing the weight of the birds during this time (1). Delayed feed consumption can reduce the rate of growth and cause weight loss (2).

By contrast, immediate access to food and water after hatching may promote development of the digestive tract, increase body weight (3.4) and reduce mortality in the first 3 days of life (5).

With early feeding, nutrients necessary for infants are supplied during the first 48-72 hrs. It has been reported that this can reduce dehydration and promote rapid reabsorption of the yolk sac (6), the development of the liver, pancreas and intestine (7), increase the bird's immediate development post-hatch, improve young chickens' resistance against exposure to low temperatures (8) and promote further development of the immune system (9).

When studying the effect of feeding immediately after hatching on activation of the genetic program that regulates hepatic lipogenesis, it was found that during the first week after hatch regulating key lipogenic genes was significant, including ATP citrate lyase enzymes, malic enzyme, fatty acid synthase, acetyl-CoAcarboxilasa, alpha stearyl-CoA desaturase-1, etc. (10). Food restriction during the first 48 hrs. post-hatching caused a significant decrease in weight gain, plasma glucose and the regulation of lipogenic genes, which reverts to the beginning of feeding (10). There are no previous reports about how digestive enzyme activity can be affected, mainly those that are an integral part of the intestinal brush border, such as disaccharidases, phosphatases and phytase.

It is of practical interest to study nutritional requirements and effects of early feeding in birds at an early age, or in the period of time from hatching to their arrival at the farm, on the development of the gastrointestinal tract, as it can affect body development. Therefore, this research was conducted in order to evaluate the effect of providing two different supplements at an early age on the activity of pancreatic and duodenal digestive enzymes in broiler chickens.

MATERIALS AND METHODS

Incubation and hatching of fertile eggs. A total of 300 fertile eggs from the Hubbard breeder line of hens, 33 weeks old, purchased from the Vipraca Farm, CA located in the state of Yaracuy, were incubated at 37.8[degrees]C in a Chick master hatchery with automatic dump from the Nutritional Biochemistry Center of the Faculty of Veterinary Science (FVS) at the Central University of Venezuela (CUV) located 67[degrees]36'36" east longitude, 10[degrees]16'20" north latitude and 443 meters above sea level, with an average temperature of 25.1[degrees]C and an average annual rainfall of 1063 mm.

At hatching, the chicks were removed from the hatcher, assigned to metal battery cages for their accommodation in the Department of Biochemistry's animal facility at the FVS-CUV, maintained in suitable conditions of hydration, ventilation and density, and immediately subjected to experimental treatments (100 birds / treatment). The food and water were provided ad libitum from hatching to 72 hours old.

Management of birds and feeding. The hydrated balanced feed was formulated in accordance with international recommendations (11). In Tables 1, 2 and 3, the composition and compositional analysis are shown (12) for the food and food supplements provided. All birds received water ad libitum. In order to take their measurements, at birth and at 48 and 72 hrs. of age, they were sacrificed by cervical dislocation, 30 chicks / treatment / interval to extract, at temperatures between 0 and 4[degrees]C, the duodenal segments and pancreas from which the homogenates were prepared to determine intestinal enzyme activity for maltase, sucrase, alkaline phosphatase and phytase. In duodenal homogenate samples, pancreatic enzyme activity was determined for [alpha]-amylase, trypsin and the activity of lipase was determined in samples of pancreatic homogenate. International ethical standards for animal research were respected, avoiding the provocation of pain or suffering.

Experimental design and treatment. Birds were assigned in a completely randomized design to the following treatments:

T0: Fasting from hatching to 48 hrs.

T1:Hydrated balanced food (HBF) from hatching to 48 hrs. of life.

T3: Commercial Hydrating Supplement (CHS) from hatching to 48 hrs. of life.

Compositional analysis of food. The compositional analyzes were performed in a commercial laboratory, and included the determination of crude protein, crude fat and crude fiber, according to standardized methods (12).

Preparation of intestinal homogenates. Duodenal segments were extracted at temperatures between 0 and 4[degrees]C, cut longitudinally, laid on a glass plate and gently scraped with a glass slide to obtain the mucous that was homogenized at maximum speed for 1 min in buffer with 2 mM HEPES pH 7.1 and stored in aliquots at -20[degrees]C until analysis, within a period not exceeding 15 days.

Pancreatic homogenate preparation. The entire procedure was conducted between 0 and 4[degrees]C. The pancreas were homogenized at maximum speed for 3 min at 4 g/ml of physiological saline, filtered through a sterile cotton cloth and the extract was stored in aliquots at -20[degrees]C until they were required for enzymatic determinations, within a period no longer than 15 days.

Enzymatic activities. Enzyme analyzes were performed at the Enzymology and Toxicology Laboratory attached to the Department of Biochemistry, FVS-CUV. Homogenized composite replicas were analyzed in all cases, with a pool of 3 chicks for a total of 10 determinations / treatment in each time interval.

Maltase (EC 3.2.1.20) and Sucrase (EC 3.2.1.48). The specific activity of the disaccharidases maltase and sucrase was determined using 56 mM maltose or sucrose as substrate in 100 mM sodium maleate, pH 6.0 and dissolved in 15% NaOH (w / v) (13). The reaction mixture was incubated at 41[degrees]C, for 15 and 30 min for maltase and sucrase respectively, after which stopped by placing the tubes in boiling water for 20 sec. The amount of glucose released in the reaction was quantified using a GOD-PAP kit 900[R] Bioscience. The absorbance was measured in a spectrophotometer (Perkin Elmer, Lambda 11, California, USA) at a wavelength of 510 nm. The specific activity was expressed as nmoles of glucose released / min / mg protein (13).

Alkaline phosphatase (EC 3.1.3.1). The activity of this enzyme was determined using LABTEST[R] Kits. The alkaline phosphatase present in the sample hydrolyzes the substrate thymolphthalein monophosphate, releasing thymolphthalein and inorganic phosphate. 50 [micro]l of substrate, 500 [micro]l of buffer supplied by the manufacturer and 50 [micro]l of the sample were incubated for 10 min at 41[degrees]C. The reaction was stopped with a solution containing 150 mM sodium carbonate and 100 mM sodium hydroxide. Absorbance was measured in a spectrophotometer at a wavelength of 590 nm and compared against a known concentration standard. The activity was expressed in (Units/L)/min/mg protein (13).

Phytase (EC 3.1.3.8). Determined at 41[degrees]C by incubating 40 [micro]l of duodenal homogenate with 200 gl of 1 mM inositolhexaphosphoric sodium salt and 200 [micro]l of 25 mM Mg[Cl.sub.2] and 50 mM MES buffer pH 6.0. The reaction was stopped by adding 3600 ml of a solution containing 0.28% (w/v) ammonium molybdate, 1.1% Sodium dodecyl sulfate (w/v), and 1.1% ascorbic acid (w/v). The concentration of phosphate released was determined in a spectrophotometer at a wavelength of 820 nm. Absorbance values were compared to a standard curve prepared from a 0.5 mM K[H.sub.2]P[O.sub.4] solution and expressed as nmoles of P[O.sub.4] hydrolyzed/min/mg protein (13, 14).

[alpha]-Amylase (EC 3.2.1.1). The homogenate (50 [alpha]l) was incubated for 15 min at 41[degrees]C in a reaction mixture containing 100 [alpha]l of 160 mM Tris-HCl pH 7.5 and 200 [micro]l of 0.15% starch in saturated sorbic acid. The reaction was stopped by adding 100 [micro]L of 0.5N HCl after which 2 [micro]l of distilled water was added along with 100 [micro]l of 0.01N iodine solution. The amount of starch degraded by amylase was determined spectrophotometrically by measuring the decrease of blue color of the starch-iodine complex ion at a wavelength of 620 nm (15). The values were compared to a standard curve prepared from a 0.15% starch solution (w/v). The activity was expressed as [micro]g of starch degraded/min/mg protein (15).

Trypsin (EC 3.4.21.4). Pancreatic homogenate was incubated for 15 min at 41[degrees]C with 200 [micro]l of 1% (w/v) casein as substrate in 0.1 M sodium phosphate pH 7.4. The reaction was stopped by adding 1 [alpha]l of 5% (w/v) trichloroacetic acid and the mixture was filtered on 42 Whatman paper. 250 [micro]l of the filtrate reacted with 1250 [micro]l of 0.2 M [Na.sub.2]C[O.sub.3] and 250 [micro]l Folin-Ciocalteu reagent diluted 1:5 in distilled water (16). After incubation for 20 min at 41[degrees]C absorbance was measured at a wavelength of 625 nm. The activity was expressed as Units of Proteolytic Activity (UPA) defined as the amount (mEq) of amino acid tyrosine released as a result of proteolysis of the substrate in the experiment conditions (15).

Lipase (EC 3.1.1.3). The activity of this enzyme was determined in pancreatic homogenate, determining the volume of 0.05M NaOH required to neutralize the fatty acids released during 3 hrs. of incubation, with gentle stirring, at 37[degrees]C with 3 ml of olive oil used as substrate. The activity was expressed as [micro]l of NaOH/mg protein (16).

Protein Analysis. Protein content was determined by reacting the samples with a filtered solution on 40 Whatman paper containing 1% Coomassie Brilliant Blue G250 in ethanol, diluted 1:2 in 8.9% orthophosphoric acid (13) using the corresponding buffer as a blank and Bovine Serum Albumin (BSA) as a standard.

Statistical analysis. The results were expressed as the mean [+ or -] standard deviation and statistically analyzed through a Kruskal-Wallis analysis and the average range tests at a significant level of p [less than or equal to] 0.05 (17).

RESULTS

Maltase (EC 3.2.1.20). Immediately after hatching, the specific activity of maltase enzyme determined in homogenate of duodenal segments was 39 [+ or -] 1 nmoles of glucose/min/mg protein. At both 48 and 72 hours old, the activity was higher (p [less than or equal to] 0.05) in animals receiving CHS from birth until 48 hrs. post-hatching (T2) in comparison with the control, which was kept in fasting for 48 hrs. (Figure 1). Birds receiving HBF showed higher activity of this enzyme at 48 hrs. old (p [less than or equal to] 0.05).

Sucrase (EC 3.2.1.48). Upon hatching, the specific activity of sucrase, determined in the homogenate of duodenal segments was 1.2 [+ or -] 0.1 nmoles glucose/min/mg protein, about 32 times lower than the maltase activity after hatching. In the first 48 hrs. after hatching there were no significant differences between treatments. However, at 72 hrs. there were significant differences in favor of T1 and T2 (Figure 1). Therefore, supplying HBF and CHS in the first 48 hrs. of life improved sucrase activity in birds that were 72 hrs. old (p [less than or equal to] 0.05), leading to increased activity about 3-fold compared to the control.

Alkaline phosphatase (EC 3.1.3.1). Immediately after hatching, the specific activity of the alkaline phosphatase enzyme, determined in homogenate of duodenal segments was 53 [+ or -] 12 (U/L)/min/mg protein. At 48 hrs. of life, animals that consumed CHS (T2) had 1.2 times higher activity, with significant differences (p<0.05) compared to the control group (T0) (Figure 1). However, in birds that fasted for 48 hrs. after hatching (T0) activity significantly increased (p [less than or equal to] 0.05) on the third day, 24 hrs. after receiving food.

Phytase (EC 3.1.3.8). Immediately after hatching, the specific activity of the phytase enzyme, determined in homogenate of duodenal segments was 5.1 [+ or -] 0.2 nmoles of P[O.sub.4]/min/ mg protein. The trend, as in the case of alkaline phosphatase, is increasing in the first 72 hours post-hatching. Early feeding of both CHS and HBF promoted greater phytase activity in the first 72 hours of life (p [less than or equal to] 0.05), with increases of up to 3.2 fold compared to the control (Figure 1).

Overall, in animals in the control group that fasted for 48 hrs. there was an effect of providing food after the fasting period, which caused an increase in the activity of integral enzymes in the intestinal brush border. In this case, in the duodenal segment, maltase, sucrase, alkaline phosphatase and phytase, at 72 hrs. after hatching. Similarly, in birds given some food or supplement (HBF or CHS) during the first 48 hrs. of life, a marked increasing tendency in the activity of these digestive enzymes was observed.

[alpha]-Amylase (EC 3.2.1.1). Immediately after hatching, the specific activity of the [alpha]-amylase enzyme, determined in pancreatic homogenate, was 94 [+ or -] 7 [micro]g of degraded starch min/mg protein. The trend was to present a greater value at 48 hrs. and to diminish at 72 hrs.

At 48 hrs. old, chickens receiving all treatments showed significantly lower activity of this enzyme (p [less than or equal to] 0.05) in comparison with control animals, with greater activity in T0 very close to 300% with respect to immediately lesser treatment [T2] (Figure 2).

[FIGURE 1 OMITTED]

[FIGURE 2 OMITTED]

Trypsin (EC 3.4.21.4). Immediately after hatching, the specific activity of the trypsin enzyme, determined in pancreatic homogenate, was 0.3 [+ or -] 0.06 PAU/min/mg protein and showed an increasing trend in the control animals, in the first 72 hrs. of life.

Supplying CHS or HBF did not increase the activity of this enzyme (Figure 2). In the first 48 hrs. of life, activity was similar in both animals that fasted and those that received any food or supplements. After 48 hours of age, a marked increase in trypsin activity was observed only in animals that had been fasting (T0) and a significant reduction (p [less than or equal to] 0.05) in activity is observed in groups that received HBF and CHS (T1 and T2).

Lipase (EC 3.1.1.3). Immediately after hatching, the specific activity of the lipase enzyme, determined in pancreatic homogenate, was 106 [+ or -] 17 [micro]l of NaOH/mg protein. The general trend was increasing in the first 72 hrs.

On the second day of life, all treatments showed a tendency to increase this enzyme's activity in relation to birth, even in birds that were under total fasting conditions (T0). At 72 hrs. accelerated activity of this enzyme was observed in the group of animals that fasted for 48 hrs. (Figure 2).

DISCUSSION

The supply of both HBF and CHS provided from birth until 48 hrs. post-hatching caused an increase in the activity of the maltase enzyme. This effect could have a favorable impact, in terms of better digestive activity, increased glucose uptake from the diet, and at the same time would improve the energy metabolism of the bird. The specific activity of maltase showed a marked increase with age, in agreement with trends reported by other authors (13).

Sucrase activity was almost 32 times lower than maltase activity after hatching. In older chickens, it has been reported that sucrase activity is usually about 13 to 16% lower than that of maltase (13). Providing HBF and CHS in the first 48 hrs. of life increased sucrase activity at 72 hrs. (p [less than or equal to] 0.05). Like maltase, specific sucrase activity increased with the age of the animals over the time span of the study period and increased after food restriction; similar to findings reported by Pinheiro et al (18). It has been reported that digestive enzyme activity may be affected by characteristics of diet and availability of substrate (19), among other factors. The activity of the enzymes maltase, sucrase, alkaline phosphatase and phytase, all integral catalytic proteins of the intestinal brush border, determined in the duodenal segment, increased in the first 72 hrs. of life in groups that received some type of food or supplement immediately after hatching.

In assessing the effect of feed restriction between 7 and 14 days of life in broiler chickens, an increase was reported in maltase and sucrase activity immediately after the restriction period (18). This could be applied to partially explain the effect of the food supply at 48 hrs. on birds in the control group, by increasing the activity of duodenal enzymes.

As for pancreatic enzymes, some authors have reported that specific activity of digestive enzymes increases with age, peaking in the pancreas on the 8th day for amylase and lipase, on the 11th day for trypsin and on the 17th day for amylase (9). During the first 48 hrs. of life, trypsin activity was similar in all groups, including animals that were fasting, indicating that activity is not very dependent on the presence of substrate, in accordance with findings reported by other authors (20) who observed that trypsin activity was not affected after evaluating two different energy levels in the diet of broiler chickens during the first week of life. The results obtained in the present study may be related to previous studies which have shown that when you start feeding chickens 36 hrs. after hatching there is a significant decrease in body weight in the first three days of life (11) as well as growth retardation and reduced meat production (6), which may result from decreased digestive enzyme activity in the intestinal brush border.

In conclusion, providing HBF or CHS to chickens during the first 48 hours of life increased specific activity of duodenal enzymes along the intestinal brush border: maltase, sucrase and phytase, and decreased pancreatic enzyme activity for [alpha]-amylase, trypsin and lipase in the first 3 days of life.

Acknowledgements

The Council of Scientific and Humanistic Development of the Central University of Venezuela for funding this research through Project Group No. PG-U-7118-2008/1.

INTRODUCCION

En la produccion avicola actual, la separacion fisica entre la planta incubadora y las granjas puede ocasionar que los pollos recien nacidos pasen un periodo variable de tiempo sin agua ni alimento y, generalmente, transcurren entre 36 y 48 h despues del nacimiento para que las aves tengan acceso al alimento, reduciendose en este periodo el peso de las aves (1). Un retraso en el consumo de alimento puede reducir la tasa de crecimiento y provocar perdidas de peso (2).

Por el contrario, el acceso inmediato al alimento y al agua despues de la eclosion puede promover el desarrollo del tracto digestivo, aumentar el peso corporal (3, 4) y disminuir la mortalidad en los primeros 3 dias de edad (5).

Con la alimentacion temprana se suministran nutrientes necesarios para los pollos recien nacidos durante las primeras 48 a 72 h. Se ha reportado que esta practica puede reducir la deshidratacion y promover la rapida reabsorcion del saco vitelino (6), el desarrollo del higado, pancreas e intestino (7), incrementar el desarrollo del ave inmediatamente despues de la eclosion, mejorar la resistencia contra la exposicion a las bajas temperaturas en pollos jovenes (8) y promover un mayor desarrollo del sistema inmunitario (9).

Al estudiar el efecto de la alimentacion, inmediatamente despues de la eclosion sobre la activacion del programa genetico que regula la lipogenesis hepatica, se encontro que durante la primera semana post eclosion fue significativa la regulacion de los genes clave lipogenicos incluyendo los de las enzimas ATP citrato liasa, enzima malica, acido graso sintasa, acetil-CoA carboxilasa, alfa estearil-CoA desaturasa-1, entre otros (10). La restriccion de alimentos durante las primeras 48 h post-eclosion provoco una disminucion significativa de la ganancia de peso, de la glucosa en plasma y de la regulacion de los genes lipogenicos, que se revierte al iniciarse la alimentacion (10). No existen reportes previos acerca de como puede afectarse la actividad de enzimas digestivas, principalmente las que forman parte integral del borde en cepillo intestinal, tales como las disacaridasas, fosfatasas y fitasa.

Es de interes practico el estudio de los requerimientos nutricionales y los efectos de alimentar las aves a temprana edad, o en el intervalo de tiempo que transcurre desde la eclosion hasta su llegada a la granja, sobre el desarrollo del tracto gastrointestinal, ya que puede repercutir en el desarrollo corporal, por lo cual se realizo la presente investigacion con el objetivo evaluar el efecto de suministrar dos suplementos diferentes a temprana edad sobre la actividad de enzimas digestivas duodenales y pancreaticas en pollos de engorde.

MATERIALES Y METODOS

Incubacion y eclosion de los huevos fertiles. Un total de 300 huevos fertiles, provenientes de gallinas reproductoras de la linea Hubbard de 33 semanas de edad, adquiridos de la Granja Vipraca, C.A. ubicada en el estado Yaracuy, fueron incubados a 37.8[degrees]C en una incubadora-nacedora, marca Chick master, con volteo automatico del Centro de Bioquimica Nutricional de la Facultad de Ciencias Veterinarias (FCV) de la Universidad Central de Venezuela (UCV) ubicada a 67[degrees]36'36" longitud este, 10[degrees]16'20" latitud norte y 443 m.s.n.m, con una temperatura media de 25.1[degrees]C y una pluviosidad promedio anual de 1063 mm.

En la eclosion, los pollos fueron extraidos de la nacedora, asignados a jaulas metalicas de bateria para su alojamiento en el bioterio de la Catedra de Bioquimica de la FCV-UCV, mantenidos en adecuadas condiciones de hidratacion, ventilacion y densidad, y sometidos de inmediato a los tratamientos experimentales (100 aves/tratamiento). Los alimentos y el agua fueron suministrados ad libitum desde la eclosion hasta las 72 horas de edad.

Manejo de las aves y alimentacion. EL alimento balanceado hidratado fue formulado de acuerdo con las recomendaciones internacionales (11). En las tablas 1, 2 y 3 se presenta la composicion y el analisis bromatologico (12) de los alimentos y suplementos suministrados. Todas las aves recibieron agua a voluntad. Para realizar las respectivas mediciones, al nacer y a las 48 y 72 h de nacidos, fueron sacrificados, por dislocacion cervical, 30 pollos/tratamiento/intervalo, para extraer, a temperaturas entre 0 y 4[degrees]C, los segmentos duodenales y el pancreas a partir de los cuales se prepararon los homogenizados para las determinaciones de las actividades de las enzimas intestinales maltasa, sacarasa, fosfatasa alcalina y fitasa. En las muestras de homogenizado duodenal se determino la actividad de las enzimas pancreaticas [alpha]-amilasa, tripsina y la actividad de la lipasa se determino en muestras de homogenizado pancreatico.

Diseno experimental y tratamientos. Las aves fueron asignadas, en un diseno completamente al azar, a los siguientes tratamientos:

T0: Ayuno desde la eclosion hasta 48 h

T1: Alimento balanceado hidratado (ABH) desde la eclosion hasta las 48 h de vida.

T3: Suplemento hidratante comercial (SHC) desde la eclosion hasta las 48 h de vida.

Analisis bromatologico de los alimentos. Los analisis bromatologicos fueron realizados en un laboratorio comercial, e incluyeron la determinacion de proteina cruda, extracto etereo y fibra cruda, segun los metodos estandarizados (12).

Preparacion del homogeneizado intestinal. Los segmentos duodenales fueron extraidos a temperaturas entre 0 y 4[degrees]C, cortados longitudinalmente, colocados sobre una placa de vidrio y raspados suavemente con una lamina portaobjeto para obtener la mucosa que fue homogeneizada a maxima velocidad durante 1 min en solucion tampon con 2 mM de HEPES a pH 7.1 y almacenada en alicuotas a -20[degrees]C hasta el momento del analisis, en un lapso no mayor a 15 dias.

Preparacion del homogenizado pancreatico. Todo el procedimiento se realizo entre 0 y 4[degrees]C. Los pancreas fueron homogeneizados, a maxima velocidad, por 3 min en 4 g/ml de solucion salina fisiologica, filtrados a traves de un liencillo esteril y el extracto almacenado en alicuotas a -20[degrees]C hasta que fueron requeridos para las determinaciones enzimaticas, en un lapso de tiempo no mayor a 15 dias.

Actividades enzimaticas. Los analisis enzimaticos se realizaron en el Laboratorio de Enzimologia y Toxicologia adscrito a la Catedra de Bioquimica, FCV-UCV. Se analizaron replicas de homogenizado compuestas, en todos los casos, por un pool proveniente de 3 pollos para un total de 10 determinaciones/tratamiento en cada intervalo de tiempo.

Maltasa (EC 3.2.1.20) y Sacarasa (EC 3.2.1.48). La actividad especifica de las disacaridasas maltasa y sacarasa fue determinada utilizando como sustrato una solucion de maltosa o sacarosa 56 mM en maleato de sodio 100 mM a pH 6.0 y disuelto en NaOH al 15% (p/v) (13). La mezcla de reaccion fue incubada, a 41[degrees]C, durante 15 y 30 min para maltasa y sacarasa respectivamente, luego de lo cual se detuvo colocando los tubos en agua en ebullicion por 20 seg. La cantidad de glucosa liberada en la reaccion fue cuantificada utilizando un kit Bioscience GOD-PAP 900[R]. La absorbancia se cuantifico en un espectrofotometro (Perkin Elmer, Lambda 11, California, USA) a una longitud de onda de 510 nm. La actividad especifica se expreso como nmoles de glucosa liberada/min/mg de proteina (13).

Fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1). La actividad de esta enzima fue determinada utilizando Kits LABTEST[R]. La fosfatasa alcalina presente en la muestra hidroliza al sustrato timolftaleina monofosfato, liberando timolftaleina y fosfato inorganico. Se incubaron 50 [micro]l de sustrato, 500 [micro]l de tampon suministrado por el fabricante y 50 [micro]l de la muestra durante 10 min a 41[degrees]C. La reaccion de detuvo con una solucion conteniendo carbonato de sodio 150 mM e hidroxido de sodio 100 mM. La absorbancia fue medida en el espectrofotometro a una longitud de onda de 590 nm y comparada contra la de un patron de concentracion conocida. La actividad se expreso en (Unidades/L)/min/mg de proteina (13).

Fitasa (EC 3.1.3.8). Se determino a 41[degrees]C incubando 40 | l del homogenado duodenal con 200 |l de la sal sodica de inositol hexafosforico 1 mM y 200 [micro]l del tampon conteniendo 25 mM de Mg[Cl.sub.2] y 50 mM de MES a pH 6.0. La reaccion se detuvo agregando 3600 |l de una solucion con 0.28% (p/v) de molibdato de amonio, SDS al 1.1% (p/v) y acido ascorbico al 1.1% (p/v). La concentracion de fosfato liberado fue determinada en el espectrofotometro a una longitud de onda de 820 nm. Los valores de absorbancia se compararon con los de una curva estandar elaborada a partir de una solucion 0.5 mM de K[H.sub.2]P[O.sub.4] y fue expresada como nmoles de P[O.sub.4] hidrolizados/minuto/mg de proteina (13, 14).

[alpha]-Amilasa (EC 3.2.1.1). El homogenado (50 [micro]l) se incubo durante 15 min a 41[degrees]C en una mezcla de reaccion conteniendo 100 gl de Tris-HCl 160 mM a pH 7.5 y 200 [micro]l de almidon al 0.15% en acido sorbico saturado. La reaccion se detuvo agregando 100 [micro]L de HCl al 0.5N luego de lo cual se anadio 2 ml de agua destilada y 100 [micro]l de solucion de yodo 0.01 N. La cantidad de almidon degradado por la amilasa se determino por espectrofotometria midiendo la disminucion de la coloracion azul del complejo ionico almidon-yoduro a una longitud de onda de 620 nm (15). Los valores se compararon con los una curva estandar elaborada a partir de una solucion de almidon al 0.15% (p/v). La actividad se expreso como [micro]g de almidon degradado/min/ mg de proteina (15).

Tripsina (EC 3.4.21.4). El homogenizado de pancreas fue incubado durante 15 min a 41[degrees]C con 200 [micro]l del sustrato caseina al 1% (p/v) en fosfato de sodio 0.1 M a pH 7.4. La reaccion se detuvo con la adicion de 1 ml de acido tricloroacetico al 5% (p/v) y la mezcla filtrada en papel Whatman 42. Se hicieron reaccionar 250 [micro]l del filtrado con 1250 pl de [Na.sub.2]C[O.sub.3] 0.2 M y 250 [micro]l del reactivo de Folin-Ciocalteu diluido 1:5 en agua destilada (16). Despues de una incubacion durante 20 min a 41[degrees]C se midio la absorbancia a una longitud de onda de 625 nm. La actividad se expreso como Unidades de Actividad Proteolitica (UAP) definidas como la cantidad (mEq) del aminoacido tirosina liberado como producto de la proteolisis del sustrato en las condiciones del ensayo (15).

Lipasa (EC 3.1.1.3). La actividad de esta enzima se determino en homogenizado de pancreas, determinando el volumen de NaOH 0.05 M requerido para neutralizar los acidos grasos liberados durante 3 h de incubacion, con agitacion moderada, a 37[degrees]C con 3 ml de aceite de oliva utilizado como sustrato. La actividad se expreso como [micro]l de NaOH/mg de proteina (16).

Analisis de proteina. El contenido de proteina se determino haciendo reaccionar las muestras con una solucion filtrada en papel Whatman 40 conteniendo azul comassie brillante-G250 al 1% en etanol, diluida 1:2 en acido ortofosforico al 8.9% (13) utilizando el tampon correspondiente como blanco y Albumina Serica Bovina (BSA) como estandar.

Analisis estadistico. Los resultados fueron expresados como el promedio [+ or -] la desviacion estandar, y analizados estadisticamente a traves del Analisis de Kruskal-Wallis y la prueba de rangos promedios a un nivel de significancia p [less than or equal to] 0.05 (17).

RESULTADOS

Maltasa (EC 3.2.1.20). Inmediatamente despues de la eclosion, la actividad especifica de la enzima maltasa, determinada en homogenizado de segmentos duodenales, fue de 39 [+ or -] 1 nmoles de glucosa/min/mg de proteina. Tanto a las 48 como a las 72 h de nacidos, la actividad fue mayor (p [less than or equal to] 0.05) en los animales que recibieron SHC desde el nacimiento hasta las 48 h post-eclosion (T2) en comparacion con el control, que se mantuvo en ayuno durante 48 h (Figura 1). Las aves que recibieron ABH presentaron mayor actividad de esta enzima a las 48 h de nacidos (p [less than or equal to] 0.05).

Sacarasa (EC 3.2.1.48). En el momento de la eclosion, la actividad especifica de la enzima sacarasa, determinada en homogenizado de segmentos duodenales, fue de 1.2 [+ or -] 0.1 nmoles de glucosa/min/mg de proteina, cerca de 32 veces mas baja que la actividad de la maltasa despues de la eclosion. En las primeras 48 h despues de la eclosion no se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos. No obstante, a las 72 h se presentaron diferencias significativas a favor de T1 y T2 (Figura 1). Por tanto, el suministro de ABH y SHC en las primeras 48 h de vida mejoro la actividad de la sacarasa a las 72 h de edad de las aves (p [less than or equal to] 0.05), provocando un incremento de la actividad de cerca de 3 veces en comparacion con el control.

Fosfatasa Alcalina (EC 3.1.3.1). Inmediatamente despues de la eclosion, la actividad especifica de la enzima fosfatasa alcalina, determinada en homogenado de segmentos duodenales, fue de 53 [+ or -] 12 (U/L)/min/mg de proteina. A las 48 h de vida, los animales que consumieron el SHC (T2) presentaron una actividad 1.2 veces mas alta, con diferencias significativas (p<0.05) en comparacion con el grupo control (T0) (Figura 1). No obstante, en las aves mantenidas en ayuno durante 48 h despues de la eclosion (T0) se presento una actividad significativamente mayor (p [less than or equal to] 0.05) en el tercer dia de edad, 24 h despues de recibir el alimento.

Fitasa (EC 3.1.3.8). Inmediatamente despues de la eclosion, la actividad especifica de la enzima fitasa, determinada en homogenado de segmentos duodenales, fue de 5.1 [+ or -] 0.2 nmoles de P[O.sub.4]/min/ mg de proteina. La tendencia, al igual que en el caso de la fosfatasa alcalina, es a aumentar en las primeras 72 h post-eclosion. El suministro de alimentacion temprana, tanto del ABH como del SHC promovio una mayor actividad fitasica en las primeras 72 h de nacidos (p [less than or equal to] 0.05), con incrementos de hasta 3.2 veces en comparacion con el control (Figura 1).

En terminos generales, en los animales del grupo control que se mantuvieron en ayuno durante 48 h, se evidencio, como efecto de suministrar alimentacion despues del periodo de ayuno, un aumento en la actividad de las enzimas integrales del borde en cepillo intestinal, en este caso en el segmento duodenal, maltasa, sacarasa, fosfatasa alcalina y fitasa, a las 72 h despues de la eclosion. Asimismo, en las aves que recibieron algun tipo de alimento o suplemento (ABH o SHC) durante las primeras 48 h de edad, se observo una marcada tendencia al incremento de la actividad de estas enzimas digestivas.

[alpha]-Amilasa (EC 3.2.1.1). Inmediatamente despues de la eclosion, la actividad especifica de la enzima a-amilasa, determinada en homogenizado de pancreas, fue de 94 [+ or -] 7 [micro]g de almidon degradado/ min/mg de proteina. La tendencia fue a presentarse un valor mayor en las 48 h y a disminuir a las 72 h.

A las 48 h de edad los pollos de todos los tratamientos presentaron una actividad de esta enzima significativamente menor (p [less than or equal to] 0.05) en comparacion con los animales del grupo control, siendo mayor la actividad en T0 muy cercana al 300% con respecto al tratamiento inmediatamente inferior [T2], (Figura 2).

Tripsina (EC 3.4.21.4). Inmediatamente despues de la eclosion, la actividad especifica de la enzima tripsina, determinada en homogenizado de pancreas, fue de 0.3 [+ or -] 0.06 UAP/min/mg de proteina y mostro una tendencia, en los animales del grupo control, al incremento en las primeras 72 h de vida.

El suministro de ABH o SHC no aumento la actividad de esta enzima (Figura 2). En las primeras 48 h de edad, la actividad fue semejante tanto en los animales en ayuno como en aquellos que recibieron algun tipo de alimento o suplemento. A partir de las 48 h de edad, se observa un marcado incremento en la actividad de la tripsina unicamente en los animales que se habian mantenido en condiciones de ayuno (T0) y una disminucion significativa (p [less than or equal to] 0.05) en la actividad en los grupos que recibieron ABH y SHC (T1 y T2).

Lipasa (EC 3.1.1.3). Inmediatamente despues de la eclosion, la actividad especifica de la enzima lipasa, determinada en homogenizado de pancreas, fue de 106 [+ or -] 17 [micro]l de NaOH/ mg de proteina. La tendencia general fue a incrementarse en las primeras 72 h.

Al segundo dia de edad, todos los tratamientos presentaron una tendencia al incremento en la actividad de esta enzima, con relacion a la actividad al nacimiento, aun en las aves que estuvieron bajo ayuno total (T0). A las 72 h, se observo un incremento acelerado en la actividad de esta enzima en el grupo de animales que estuvo bajo ayuno durante 48 h (Figura 2).

DISCUSION

Tanto el suministro de ABH como el SHC suministrados desde el nacimiento hasta las 48 h post-eclosion provocaron un aumento en la actividad de la enzima maltasa. Este efecto pudiese repercutir favorablemente en una mejor actividad digestiva y mayor absorcion de glucosa proveniente de la dieta, lo que al mismo tiempo permitiria mejorar el metabolismo energetico del ave. La actividad especifica de la maltasa presento una tendencia marcada al incremento con la edad, en concordancia con lo reportado por otros autores (13).

La actividad de la sacarasa fue casi 32 veces mas baja que la actividad de la maltasa despues de la eclosion. En pollos de mayor edad se ha reportado que la actividad de la sacarasa suele ser alrededor de 13 a 16% menor que la de la maltasa (13). El suministro de ABH y SHC en las primeras 48 h de vida aumento la actividad de la sacarasa a las 72 h (p [less than or equal to] 0.05). Al igual que la maltasa, la actividad especifica de la sacarasa se incremento con la edad de los animales en el lapso de tiempo que duro el estudio y aumento despues del periodo de restriccion de alimentos; de manera similar a lo reportado por Pinheiro et al (18). Se ha reportado que la actividad de las enzimas digestivas puede ser afectada por las caracteristicas de la dieta y la disponibilidad del sustrato (19), entre otros factores. La actividad de las enzimas maltasa, sacarasa, fosfatasa alcalina y fitasa, todas proteinas cataliticas integrales del borde en cepillo intestinal, determinadas en el segmento duodenal, aumento en las primeras 72 h de edad de las aves en los grupos que recibieron algun tipo de alimento o suplemento desde inmediatamente despues de la eclosion.

Al evaluar el efecto de la restriccion de alimento entre 7 y 14 dias de edad, en pollos de engorde, se reporto un aumento en la actividad de las enzimas maltasa y sacarasa inmediatamente despues del periodo de restriccion (18). Esto podria aplicarse para explicar en parte el efecto del suministro de alimento a las 48 h de edad, en las aves del grupo control, al incrementar la actividad de las enzimas duodenales.

En cuanto a las enzimas pancreaticas, algunos autores han reportado que la actividad especifica de las enzimas digestivas aumenta con la edad, alcanzando valores maximos en el pancreas al 8vo dia para amilasa y lipasa y al 11vo dia para tripsina. En el contenido intestinal la actividad maxima se observo al 4to dia para lipasa, al 11vo dia tripsina y al 17vo dia en amilasa (9). Durante las primeras 48 h de edad, la actividad de la tripsina fue semejante en todos los grupos, incluyendo a los animales en ayuno, indicando una actividad poco dependiente de la presencia del sustrato, en concordancia por lo reportado por otros autores (20) al observar que la actividad de la tripsina no fue afectada despues de evaluar dos niveles diferentes de energia en la dieta en pollos de engorde durante la primera semana de vida. Los resultados obtenidos en el presente estudio podrian estar relacionados con estudios previos en los cuales se ha demostrado que al iniciar la alimentacion de los pollos 36 h despues de la eclosion se produjo disminucion significativa del peso vivo en los primeros tres dias de edad (11), asi como retardo del crecimiento y menor produccion de carne (6), lo que puede ser consecuencia de una menor actividad de las enzimas digestivas del borde en cepillo intestinal.

En conclusion el suministro de ABH o SHC durante las primeras 48 h de vida de los pollos aumento la actividad especifica de las enzimas duodenales del borde en cepillo intestinal maltasa, sacarasa y fitasa y disminuyo la actividad de las enzimas pancreaticas [alpha]-amilasa, tripsina y lipasa en los primeros 3 dias de edad.

Agradecimientos

Al Consejo de Desarrollo Cientifico y Humanistico de la Universidad Central de Venezuela por el financiamiento de la presente investigacion, a traves del Proyecto de Grupo N[degrees] PG-11-7118-2008/1.

REFERENCES

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(2.) Careghi C, Tona K, Onagbesan O, Buyse J, Decuypere E, Bruggeman V. The effects of the spread of hatch and interaction with delayed feed access after hatch on broiler performance until seven days of age. Poult Sci 2005; 84(8):1314-1320.

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Milagro Leon T, M.Sc, Gerardo Garrido G, M.Sc, Maria Castaneda D, TSU, Emma Rueda de A, Ph.D.

Central University of Venezuela, Faculty of Veterinary Science, Department of Biomedical Science, Nutritional Biochemistry Center, Enzymology and Toxicology Laboratory. Final Prolongation 19 de Abril Avenue, El Limon Lane, Maracay, Venezuela. Correspondence: emmarueda@gmail.com.

Received: November 2013; Accepted: March 2014.
Table 1. Characteristics of hydrated balanced feed
(HBF).

Ingredients                   g/Kg

Cornmeal                       543
Soybean meal                   350
Soybean oil                    60
Monocalcium phosphate          20
Calcium carbonate              15
Vitamin-mineral pre-mix (1)     6
Salt                            3
DL-Methionine                   2
L-Lysine. HCl                   1

Composition (2)               g/Kg

Crude protein                 215.5
Ether extract                 80.3
Crude fiber                   33.1
Lysine                        12.2
Calcium                       10.2
Phosphorous                    7.8
AME (Kcal/Kg)                 3,100

(1) Mineral-vitamin Pre-mix Content (mg/kg):
80 Iron, Zinc (ZnO) 40, Manganese 60, 0.8 Iodine, 8 Copper, 0.2
Selenium, 0.4 mg Cobalt, Vitamin A 4,500 IU, 1,000 IU
Cholecalciferol, Vitamin E 25 IU, Menadione 1.5, 0.02 Vitamin
B12, 3 Riboflavin , 5 pantothenic acid, 20 Niacin, 0.5 folic
acid, 1.5 Thiamine, 0.5 Biotin, 2.5 Pyridoxine.

(2) Calculated values

(3) Determined according to AOAC (8).

Table 2. Characteristics of the commercial hydrating
supplement (CHS).

Ingredients       g/Kg

Soy flour          400
Corn flour         150
Corn Syrup         180
Citric Acid        20
Water              250

Composition (1)   g/Kg

Crude protein      212
Ether extract       6
Crude fiber        27

(1) Values determined according to AOAC (8).

Table 3. Compositional analysis of food mixtures.

Composition (1)
(g/Kg)               HBF (2)    CHS (3)

Crude Protein          264        212
Ether Extract          79          6
Crude Fiber            33         27

(1) Values determined according to AOAC (8).

(2) HBF = Hydrated balanced feed

(3) CHS = Commercial hydrating supplement
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Author:Leon, Milagro T.; Garrido, Gerardo G.; Castaneda, Maria D.; de Rueda, Emma A.
Publication:Revista MVZ (Medicina Veterinaria y Zootecnia)
Date:Sep 1, 2014
Words:7528
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