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E-cadherin expression in squamous cell carcinoma and basal cell tumors in dogs/Expressao da E-caderina em carcinoma de celulas escamosas e no tumor de celulas basais de caes.

INTRODUCAO

As caderinas, polipeptidios que representam uma classe de moleculas de adesao (FOTY & STEINBERG, 2004), conectam uma celula a outra atraves de uma ligacao homofilica dependente do ion calcio. Associam-se a um grupo de proteinas intracelulares chamadas cateninas, as quais as ligam a microfilamentos actinicos do citoesqueleto e medeiam mecanismos transdutores de sinais que regulam o crescimento celular e sua diferenciacao (OZAWA & KEMLER, 1998). As moleculas de adesao classicas compreendem a E (epithelial)-caderina, N (neural)caderina e a P (placental)-caderina (FURUKAWA, 1997; FOTY & STEINBERG, 2004).

A manutencao da arquitetura do tecido adulto depende grandemente da integridade funcional e estrutural das caderinas (ELANGBAM et al., 1997). Sao consideradas importantes reguladoras da morfogenese em varios orgaos, incluindo a pele. Elas estao envolvidas nao somente na manutencao do arranjo dessas celulas, como na condensacao dermica (HIRAI et al., 1989). Na pele, a E-caderina e expressa na superficie celular de todas as camadas epidermicas, incluindo os apendices cutaneos (FUJITA et al., 1992). Ultra-estruturalmente, a E-caderina esta distribuida sobre a membrana plasmatica dos queratinocitos, mas nao na superficie dermica das celulas basais. Depositos densos de E-caderina sao encontrados no espaco intercelular dos desmossomos (HORIGUCHI et al., 1994).

Uma disfuncao das caderinas pode estar envolvida com varias desordens cutaneas, como doencas bolhosas e comportamento invasivo e metastatico dos tumores (FURUKAWA et al., 1997). A principal acao da E-caderina em tumores e a supressao da habilidade de invasao e a ausencia desta, associada a progressao tumoral (BEHRENS et al., 1989; NAVARRO et al., 1991; BIRCHMEIER et al., 1993). O dano funcional da E-caderina pode ocorrer por varios mecanismos, mas frequentemente a delecao ou mutacao do gene CDH1 estao envolvidos. Alguns estudos mostram que aberracoes neste gene sao suficientes para predispor o desenvolvimento de tumores malignos. Alem disso, mudancas na expressao de proteinas que fazem parte do complexo de adesao da E-caderina tambem podem prejudicar sua funcao. A reorganizacao da cromatina, a hipermetilacao e a perda do fator de transcricao coincidem com a supressao da E-caderina em carcinomas (SEMB & CHRISTOFORI, 1998). De qualquer maneira, a integridade do tecido e destruida e a celula tumoral fica livre para gerar metastases (GOODSELL, 2002).

O carcinoma de celulas escamosas (CCE) e uma neoplasia maligna que emerge dos queratinocitos (SCOTT et al., 1996) e corresponde a aproximadamente 5% dos tumores cutaneos dos caes (THOMAS & FOX, 1998). Caes de racas de pelo curto e pele branca ou albina apresentam incidencia mais elevada de carcinoma de celulas escamosas induzido pela luz solar. Esses caes costumeiramente passam muitas horas deitados ao sol (SCOTT et al., 1996). Estes tumores sao, geralmente, localmente invasivos e se infiltram na derme e nos tecidos subcutaneos adjacentes, mas lentos para gerar metastases. Apesar disso, ha casos relatados sobre a disseminacao para linfonodos regionais e pulmao (PULLEY & STANNARD, 1990; SCOTT et al., 1996; RODASKI & WERNER, 2009).

Os tumores de celulas basais (TCB) apresentam crescimento lento e raramente observa-se comportamento agressivo (RODASKI & WERNER, 2009). Sao compostos quase exclusivamente por celulas basais e nao exibem evidencias de diferenciacoes de glandulas sebaceas, sudoriparas e de foliculos pilosos. Os TCB podem ser classificados histologicamente como solidos, cisticos, adenoides ou medusoides (VAIL & WITHROW, 1996; THOMAS & FOX, 1998) e a incidencia de recidivas e metastases e baixa (SCOTT et al., 1996; VAIL & WITHROW, 1996; THOMAS & FOX, 1998).

Com base nas caracteristicas descritas desses tumores, buscou-se com este estudo relacionar a expressao da E-caderina com o tipo histologico, grau de diferenciacao e comportamento biologico do carcinoma de celulas escamosas e do tumor de celulas basais.

MATERIAL E METODOS

Foram empregadas 35 amostras de tumores cutaneos caninos, incluidas em parafina e classificadas histologicamente como CCE (n=20) e TCB (n=15), segundo os criterios de PULLEY & STANNARD (1990). As amostras sao oriundas do arquivo do Departamento de Patologia Veterinaria da Faculdade de Ciencias Agrarias e Veterinarias, UNESP, campus de Jaboticabal, da Faculdade de Medicina Veterinaria e Zootecnia, UNESP, campus de Botucatu e da Faculdade de Medicina Veterinaria, UNESP, campus de Aracatuba.

O metodo de imunohistoquimica empregado foi o complexo streptoavidina biotina (ABC) desenvolvido por HSU et al. (1981). Cortes de 3[micro]m de espessura foram montados em laminas pre-tratadas com Poly-L-Lisina (a). As laminas foram desparafinizadas e reidratadas em baterias de xilois e alcoois em concentracoes decrescentes. Receberam tratamento com solucao de metanol e peroxido de hidrogenio (2,4%) para bloqueio da peroxidase endogena. Para a recuperacao antigenica, ficaram em banho-maria por 40 minutos em solucao pre-aquecida a 92[degrees]C de tampao citrato (pH 6). Depois de resfriados, foram incubados por 30 minutos com Protein Block (b) para bloqueio de reacoes inespecificas. Em seguida, foram incubados durante a noite a 4[degrees]C com o anticorpo primario anti-E-caderina (c) em camara umida. Para deteccao da reacao imune, foi utilizado o kit LSAB (d), por 30 minutos. As reacoes foram reveladas pelo substrato cromogenico 3,3 diaminobenzidina (e), contracorados pela hematoxilina de Harris por um minuto, e entao lavados em agua corrente.

Como controle positivo, alem das areas de epitelio normal dos proprios especimes, foi utilizado utero canino, que sabidamente expressa a E-caderina em sua camada epitelial. Como controles negativo, o anticorpo primario anti-E-caderina foi substituido por tampao PBS, pH 7,2; e por imunoglobulina G de camundongo.

Para avaliacao dos resultados, foram consideradas como expressoes conservadas de E-caderina as marcacoes de coloracao moderada a intensa em mais de 75% das celulas neoplasicas. Expressoes inferiores a 75% foram consideradas reduzidas, seguindo os criterios empregados por BRUNETTI et al. (2005). As observacoes foram feitas em microscopio optico comum por dois observadores e os resultados foram entao estabelecidos.

O teste exato de Fisher foi utilizado para comparar a expressao da E-caderina entre o carcinoma de celulas escamosas e o tumor de celulas basais, atraves do programa SAS (f).

RESULTADOS E DISCUSSAO

Setenta por cento (n=14) dos CCEs apresentaram expressao da E-caderina reduzida. Seis amostras (30%) tiveram a expressao conservada da molecula (Figura 1), sendo cinco delas carcinomas queratinizados e uma carcinoma nao queratinizado. Exemplos de marcacao preservada e reduzida no CCE estao apresentados na figura 2 (2A e 2B). Observou-se tambem que a expressao da E-caderina apresentou diferentes intensidades de coloracao de acordo com o grau de diferenciacao das celulas, em que celulas mais diferenciadas apresentavam coloracao mais intensa (Figura 2C).

[FIGURE 1 OMITTED]

O TCB apresentou comportamento inverso ao do CCE. Oitenta por cento (n=12) das amostras apresentaram expressao E-caderina em mais de 75% das celulas. Em tres amostras (20%), a expressao estava reduzida (Figura 1). Dos TCB, 20% eram do tipo medusoide (3), 53,3% adenoide (8) e 26,7% solido (4). Apenas uma amostra de cada tipo nao apresentou expressao conservada de E-caderina. Exemplo de marcacao preservada no TCB esta apresentado na figura 2D.

A diferenca da expressao da E-caderina no CCE e TCB foi significativa pelo teste de Fisher (P=0,0039) a 1% de significancia. Embora nao se tenha encontrado estudos previos dessa molecula em CCE e TCB de caes, estudos em tumores mamarios caninos mostraram correlacao positiva entre a diminuicao da expressao da E-caderina e o aumento do seu poder de invasao. Em carcinomas mamarios de maior malignidade, houve reducao significativa da expressao de E-caderina, enquanto que aqueles de menor grau de malignidade apresentaram expressao conservada dessa molecula. Tambem relacionaram a reducao de expressao com aumento de tamanho, presenca de ulceracao, metastases em linfonodos, necrose e comportamento infiltrativo do tumor, sem, contudo, associarem ao grau histologico (BRUNETTI et al., 2005; MATOS et al., 2006; PIEKARZ et al., 2008).

[FIGURE 2 OMITTED]

Em tumores cutaneos humanos, a reducao da expressao de E-caderina tambem foi relacionada com o poder invasivo e metastatico desses tumores (SCHTPPER, 1991; FURUKAWA et al., 1997). No cancer colorretal humano, a reducao da expressao da E-caderina indica mau prognostico, sendo correlacionada com o aumento da invasividade tumoral, desenvolvimento de sitios metastaticos e menor taxa de sobrevida (KWAK et al., 2007).

O rompimento da adesao celula-celula durante a carcinogenese e a base para a invasao e metastase (BATLLE et al., 2000; POLAKIS, 2007; GLOUSHANKOVA, 2008). AE-caderina e uma molecula de adesao celular responsavel pela manutencao da integridade do tecido e por suprimir a habilidade de invasao das celulas tumorais (BEHRENS et al., 1989; NAVARRO et al., 1991; BTRCHMEIFR et al., 1993). Sendo assim, a perda dessa molecula no tecido neoplasico poderia interferir diretamente na liberacao de celulas tumorais, aumentando o poder de invasao e a chance de formacao de metastases.

Neste estudo, a deficiente expressao da Ecaderina nos CCEs pode indicar que esse tumor apresenta menor adesao entre as celulas, com maior potencial infiltrativo e de invasao dos tecidos adjacentes, apresentando comportamento mais agressivo nos caes, quando comparado aos TCBs. Esse resultado e condizente com o comportamento biologico desses tumores descrito na literatura, em que o CCE apresenta um comportamento mais agressivo que o TCB, principalmente pelo seu poder infiltrativo (THOMAS & FOX, 1998). Portanto, a reducao da expressao da E-caderina nos CCEs pode ter relacao com o comportamento tumoral, podendo ser utilizada na definicao de um prognostico.

CONCLUSAO

Com base nos resultados deste estudo, sugere-se que a expressao reduzida da E-caderina em tumores cutaneos pode indicar maior poder infiltrativo e consequentemente mau prognostico na especie canina.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem aos professores Dra Renee L. Amorim, da Faculdade de Medicina Veterinaria e Zootecnia da UNESP, campus de Botucatu e Dra Gisele F. Machado da Faculdade de Odontologia da UNESP, campus de Aracatuba pela doacao de amostras para a realizacao deste trabalho. Esta pesquisa foi financiada pela Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP).

COMITE DE ETICA E BIOSSEGURANCA

Trabalho aprovado pela Comissao de etica no uso de animais (CEUA), Faculdade de Ciencias Agrarias e Veterinarias (FCAV), Universidade Estadual Paulista (UNESP) de Jaboticabal sob protocolo n.008410.

FONTES DE AQUISICAO

(a-) Poly-L-Lisina (cod. P4832 - Sigma Chemical Co., St. Louis, MO EUA)

(b-) Protein Block (DakoCytomation, Ref. X0909)

(c-) Anticorpo monoclonal anti-E-caderina (camundongo antihumano, Zymed Laboratories Inc., clone 4A2C7)

(d-) LSAB (Sistema de Deteccao Ultra Estreptavidina Universal, DakoCytomation, Ref. K0690)

(e-) DAB (Cod. SK-4100--DAB Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA)

(f-) SAS (9.1, SAS Institute, Cary, NC, USA).

REFERENCIAS

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Carolina Franchi Joao (I) Mirela Tinucci-Costan Diogo Jose Cardilli (II) Joice Lara Maia Faria (III) Georgia Mode Magalhaes (II) Antonio Carlos Alessi (II)

(I) Universidade Federal do Para (UFPA), Rua Maximino Porpino, 1000, 68740-080, Castanhal, PA, Brasil. Email: carolinafj@ufpa.br. Autor para correspondencia.

(II) Faculdade de Ciencias Agrarias e Veterinarias (FCAV), Universidade Estadual Paulista (UNESP), Jaboticabal, SP, Brasil.

(III) Universidade de Uberaba (UNIUBE), Uberaba, MG, Brasil.

Recebido para publicacao 28.02.11

Aprovado em 08.06.11

Devolvido pelo autor 10.08.11

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Author:Joao, Carolina Franchi; Tinucci-Costa, Mirela; Cardill, Diogo Jose; Faria, Joice Lara Maia; Magalhae
Publication:Ciencia Rural
Date:Sep 1, 2011
Words:2734
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