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Distribucion y diversidad genetica de Begomovirus que infectan tomate (Solanum lycopersicum l) en Colombia.

Distribution and genetic diversity of tomato-infecting Begomovirus (Solanum lycopersicum L) in Colombia

Introduccion

En Colombia, las investigaciones sobre enfermedades virales que afectan el cultivo de tomate han sido realizadas por medio de tecnicas microscopicas, serologicas y/o moleculares, identificando a la fecha virus pertenecientes a los generos: Begomovirus, (Tomato yellow mosaic virus--ToYMV), Tobamovirus (Tobacco mosaic virus--TMV y/o Tomato mosaic virus--ToMV), Cucumovirus (Cucumber mosaic virus--CMV), Tospovirus (Tomato spotted wilt virus--TSWV, Impatients necrotic spot virus--INSV), Crinivirus (Potato yellow vein virus--PYVV), Potyvirus (Pepper deforming mosaic virus--PepDMV) y Nepovirus, (Tobacco ringspot virus--TRSV) (Tamayo y Jaramillo, 2006; Uribe-Echeverri, et al. 2011).

Los virus clasificados dentro del genero Begomovirus (Familia Geminiviridae) se caracterizan por tener uno o dos componentes de DNA cadena sencilla, el vector biologico es la mosca blanca (Bemisia tabaci Genn; Homoptera: Aleyrodidae) e infectan plantas dicotiledoneas (Rojas et al. 2005). Los begomovirus bipartitas tienen dos componentes genomicos, DNA-A y DNA-B. El DNA-A presenta cuatro marcos de lectura abiertos (MLA) los cuales codifican proteinas requeridas para la replicacion, transcripcion y encapsidacion del virus. El DNA-B tiene dos MLA, los cuales codifican proteinas asociadas al movimiento viral y al desarrollo de sintomas (Hanley et al. 1999; Gutierrez, 2000; Rojas et al. 2005). Rojas et al. (2005) describen que para el establecimiento de una infeccion sistemica eficiente se necesitan ambos componentes virales los cuales son encapsidados en forma independiente.

Los begomovirus han sido considerados como un grupo emergente de virus en plantas por su severidad en las enfermedades causadas. En las ultimas tres decadas se ha observado una alta incidencia de estos virus en regiones tropicales y subtropicales del mundo, causando perdidas devastadoras en produccion en cultivos de frijol, yuca, algodon, cucurbitaceas y tomate (Morales y Anderson, 2001; Polston y Anderson, 1997). America Latina ha sido una region muy afectada en cuanto al surgimiento de nuevos begomovirus, numero de cultivos afectados, perdidas en las cosechas y areas agricolas devastadas (Morales y Anderson, 2001). Los sintomas tipicos de la enfermedad causada por begomovirus son mosaicos amarillos brillantes, moteados amarillos, epinastias, clorosis foliar marginal, abultamientos foliares, reduccion del area foliar, enanismo, retraso del crecimiento y reduccion en tamano de los frutos hasta la abscision floral en casos extremos (Hanley et al. 1999; Gutierrez, 2000; Rojas et al. 2005).

Reportes realizados por la FAO durante el periodo comprendido entre el ano 1990 y el ano 2007, estiman que la produccion de tomate en Colombia paso de 505.005 toneladas (en 23.400 ha) a 390.000 toneladas (en 15.000 ha), con una disminucion en el area sembrada del 35.9% (FAOSTAT 2007). De acuerdo a lo reportado por Morales et al. (2002), una de las causas en la disminucion en la produccion del cultivo de tomate es la aparicion de nuevas enfermedades virales, en especial aquellas causadas por virus del genero Begomovirus.

Dada esta problematica begomoviral en cultivos de tomate, una estrategia para controlarlos es el uso de materiales de tomate resistentes a begomovirus endemicos del pais. Un primer paso para desarrollar un programa de mejoramiento genetico de tomate con resistencia a virus es conocer la identidad y diversidad genetica de los begomovirus que estan afectando el cultivo en Colombia, con el fin de buscar materiales resistentes al begomovirus que prevalecen en las zonas productoras de tomate. En el presente trabajo de investigacion se reporta que las variantes begomovirales que actualmente estan afectando el cultivo de tomate en Colombia estan relacionados filogeneticamente con el Virus del mosaico amarillo de la papa (PYMV) y con el Tomato venezuela virus (ToVEV).

Materiales y metodos

Recoleccion del material vegetal

Se colectaron hojas jovenes de plantas de tomate en 74 fincas en los departamentos del Valle del Cauca, Cundinamarca, Antioquia, Boyaca y Santander con sintomas caracteristicos de la enfermedad begomoviral tales como: mosaicos amarillos brillantes, epinastias, clorosis foliar marginal, abultamientos foliares, reduccion del area foliar, enanismo y retraso del crecimiento (Polston y Anderson, 1997). Los sitios de colecta fueron georeferenciados mediante el equipo GPS-CSX-60 (Garmin[R]).

Extraccion de DNA total

Con el proposito de llevar a cabo los diferentes analisis moleculares, el tejido foliar de cada muestra colectada fue macerado en nitrogeno liquido (N2) y usado para la extraccion del DNA genomico, este proceso se llevo a cabo siguiendo las recomendaciones del fabricante DNeasy Plant mini Kit (Qiagen, Germany).

Reaccion en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Para la deteccion del begomovirus se utilizo la reaccion en cadena de la polimerasa--PCR (Polymerase Chain Reaction), usando los iniciadores y las condiciones de PCR previamente reportadas por Rojas et al. (1993). La identificacion del componente A se realizo usando los juegos de iniciadores PAL1v1978/PAR1c496, los cuales amplifican una region de 1.1kb y la identificacion del componente B con los iniciadores PBL1v2040/ PCRc1 los cuales amplifican una region de 0.6kb. El equipo que se uso para la amplificacion fue un termociclador ICycler[R] de BioRad[R]. Los productos amplificados fueron observados en geles de agarosa al 1% (p/v) tenidos con bromuro de etidio (10 ng/[micron]l), visualizados en un transiluminador de luz ultravioleta (Molecular Imager Gel DocXR+ Systems BIORAD[R]) y analizados mediante el uso del software Quantity One--4.6.5 provisto por el fabricante del equipo.

PCR-RFLP

Para determinar polimorfismos entre los fragmentos amplificados del componente A begomoviral, se llevo a cabo la tecnica molecular PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism) (Sambrook y Russell, 2001), la cual ha sido reportada para realizar estudios de diversidad genetica de geminivirus (Willment et al. 2001). Para seleccionar las enzimas de restriccion se realizo una busqueda y analisis bioinformatico en el Genebank (Benson et al. 2011), de secuencias reportadas para el componente genomico A de begomovirus que estan afectando el cultivo de tomate en areas del Caribe, Centro y Sur America, seleccionando las siguientes: Tomato yellow mosaic virus isolate Valle del Cauca (AY126610.1); Potato yellow mosaic Panama virus (Y15034.1); Potato yellow mosaic Trinidad virus (AF039031.1); Potato yellow mosaic virus from Martinique (AY126610). Estas secuencias fueron procesadas en el programa Editseq[R] (software DNASTAR[R]) con el fin de contar con la secuencia parcial de aproximadamente 1100 pb (secuencia parcial de la proteina de la capside, region comun y proteina asociada a replicacion) que representan los fragmentos que se amplificaron con los iniciadores de Rojas et al. (1993) utilizados para la reaccion de PCR. Las secuencias parciales de los componentes genomicos A fueron cortados con diferentes enzimas de restriccion en el programa MapDraw[R] (software DNASTAR[R]) (datos no mostrados). Con base en este analisis bioinformatico se seleccionaron las enzimas de restriccion HincII, PstI, Rsal y SspI como mejores candidatos para el analisis por RFLP (tabla 2, restriccion enzimatica in silico).

Para la restriccion enzimatica in vivo, los fragmentos de 1100pb del componente A fueron amplificados por PCR y digeridos con cuatro enzimas de restriccion: RsaI, PstI, SspI y HincII (Invitrogen[R]). Las reacciones de digestion se llevaron a cabo siguiendo las metodologias descritas por el fabricante y los productos obtenidos fueron separados y visualizados en geles de poliacrilamida al 6% tenido con sales de plata.

Clonacion y secuenciacion

Los fragmentos de 1.1kb del componente A fueron purificados mediante el kit (Wizard[R] Genomic DNA Purification Promega[R]) y clonados en el vector TOPO TA (Invitrogen[R]), siguiendo la metodologia descrita por el fabricante. Los fragmentos de 0.6kb del componente B fueron purificados mediante el kit (Wizard Genomic DNA Purification Promega[R]), digeridos con la enzima PstI y clonados en el vector pUC19, utilizando la enzima T4 ligasa. Las reacciones de ligacion fueron transformadas en celulas competentes Escherichia coli (One Shot, Invitrogen[R]) por el metodo de choque termico (Sambrook y Russell 2001). A las colonias transformadas se les extrajo el DNA plasmidico con el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, Germany) siguiendo la metodologia descrita por el fabricante. Para verificar la presencia del inserto se hizo un analisis de restriccion usando las enzimas de restriccion EcoRI y PstI, para liberar el inserto del vector TOPO TA y pUC19, respectivamente. Para la secuenciacion de los fragmentos clonados se utilizaron los iniciadores M13 Forward y M13 Reverse, esta fue llevada a cabo por la empresa Macrogen, la cual emplea el metodo fluorescente del kit de secuenciacion enzimatica The Big Dye Terminador DNA (Perkin-Elmer Inc., Branchburg, NJ) y un secuenciador ABI Prisma 377 (Applied Biosystem Inc. Foster City, CA).

Analisis bioinformatico

Las secuencias fueron editadas y ensambladas mediante el programa CodonCode Aligner[R] (CodonCode Corporation). Para determinar la identidad de los begomovirus hallados en la presente investigacion, se realizo una comparacion de secuencias mediante el algoritmo blastn (Zhang et al. 2000) disponible en la pagina web de Nacional Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov). La edicion y alineamiento multiple de las secuencias parciales correspondientes a 151 nt de la region 5' del Marco de Lectura Abierto (MLA) del gen de la proteina de la capside (CP) de los begomovirus aislados y otros reportados en la base de datos GenBank (Benson et al. 2011), se realizo en los programas Bioedit (Hall, 1999) y ClustalW (Thompson et al. 1997). A partir de estos datos se construyo una matriz de identidad de secuencias de nucleotidos en el programa BioEdit[R].

Para establecer y verificar las relaciones de parentesco y geograficas entre el grupo de begomovirus identificados con otro grupo de begomovirus reportados en la base de datos GenBank GenBank (Benson et al. 2011), se realizaron analisis filogeneticos de las secuencias parciales correspondientes a 151 nt de la region 5' del Marco de Lectura Abierto (MLA) del gen de la proteina de la capside (Cp) en el programa Geneious 4.8.3 [R] Biomatters Ltd (www.geneious.com); la similitud genetica se calculo de acuerdo al modelo de distancia genetica de Tamura-Nei (Nei, 1978) y el analisis de agrupamiento se realizo utilizando el metodo UPGMA para secuencias de nucleotidos (metodo grafico de agrupamiento por parejas, que usa el promedio aritmetico no ponderado).

La identificacion de secuencia repetitivas (regiones regulatorias o iterones) localizados en la region promotora del gen de la proteina asociada a replicacion (Rep) de los begomovirus fue realizado con el algoritmo ClustalW presente en la herramienta MEGA (Tamura et al. 2011). Los begomovirus fueron alineados utilizando como senales el codon de inicio de Rep, la caja TATA de Rep y los interones reportados para PYMV-Guadalupe (Ramos et al. 2003).

Las siguientes secuencias fueron tomadas de la base de datos GenBank (Benson et al. 2011) para realizar los analisis bioinformaticos:

Abutilon mosaic Bolivia virus (AbMBV, HM585445),

Abutilon mosaic virus (AbMV, X15983),

African cassava mosaic virus (ACMV, J02057),

Bean dwarf mosaic virus (BDMV, M88179),

Bean golden mosaic virus-[Brazil] (BGMV, M88686),

Bean golden yellow mosaic virus-[Puerto Rico] (BGYMV, M10070),

Chino del tomate virus_Sinaloa (CdTVTo, AF101476.1),

Leonurus mosaic virus (LeMV, U92532),

Malvastrum yellow mosaic virus (MalYMV, FJ600483.1)

Pepper golden mosaic virus (PepGMV, AY928516.1);

Pepper huasteco yellow vein virus_Mexico (PHYVV, X70418.1),

Potato yellow mosaic Panama virus (PYMPV, Y15034.1),

Potato yellow mosaic Trinidad virus (PYMV-TT, AF039031.1),

Potato yellow mosaic virus from Martinique (PYMV-Ma, AY126610),

Potato yellow mosaic virus Puerto Rico (PYMV-To [PR:Tom:04], AY965897).

Potato yellow mosaic virus-[Guadalupe] (PYMV-To [GP:Tom], AY120882);

Potato yellow mosaic virus-[Venezuela] (PYMV-Po [VE], D00940),

Sida Brazil virus (SiBV, FN436001),

Sida golden mosaic Costa Rica virus (SGMCRV, X99550),

Sida golden mosaic virus (SiGMV, AF049336),

Squash leaf curl virus (SqLCV, M38183),

Tomato chlorotic mottle virus-[Brazil] (ToCMV, AF490004),

Tomato golden mosaic virus (TGMV, K02029),

Tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV, U15016),

Tomato leaf curl virus_Australia (ToLCV-To, S53251),

Tomato mosaic Barbados virus (ToMBV, AF213013),

Tomato mottle Taino virus (ToMoTV, AF012300.1),

Tomato mottle leaf curl Zulia virus (TMoLCV-Zulia, HQ171986.1)

Tomato mottle virus (ToMoV, L14460),

Tomato rugose mosaic virus [Brazil] (ToRMV, AF291705),

Tomato yellow leaf curl Sardinia virus [Italy] (TYLCSV, X61153),

Tomato yellow leaf curl virus-Mild [Portugal] (TYLCV, AF105975),

Tomato yellow mosaic virus isolate Valle del Cauca (PYMV-Valle, EU518935),

Tomato yellow spot virus from Argentina (ToYSV-Ar, FJ538207),

Tomato yellow vein streak virus [Argentina] (TYVSV-Ar, GQ387369),

Tomato yellow vein streak virus [Brazil] TYVSV-Br U79998),

Venezuela tomato geminivirus (ToVEV, AF026464),

Wissadula golden mosaic virus (WGMV, WGU69280).

Resultados y discusion

Evidencia de infecciones mixtas de begomovirus que afectan tomate en Colombia.

Conociendo la alta incidencia que han tenido los Begomovirus (Familia Geminiviridae) en zonas productoras de tomate de la region Andina Colombiana y el impacto que estos virus ha generado en los agricultores, se realizaron colectas de material vegetal (hojas de tomate) con sintomas virales caracteristicos de begomovirus en los departamentos del Valle del Cauca, Boyaca, Cundinamarca, Antioquia y Santander (Vaca-Vaca et al. 2011). Para determinar la presencia de infecciones mixtas de begomovirus bipartitas en las muestras colectadas, se realizo una extraccion de DNA total y mediante PCR se amplificaron dos fragmentos de 1100pb y 600pb, correspondientes a una seccion del componente geminiviral A y B, respectivamente. Por medio de esta estrategia molecular se evidenciaron begomovirus bipartitas pertenecientes a la Familia Geminiviridae en 24 muestras provenientes de los departamentos de Valle del Cauca, Cundinamarca y Santander (tabla 1).

Con el fin de caracterizar las muestras positivas para begomovirus y determinar polimorfismos entre los diferentes virus detectados, se procedio a realizar la tecnica de RFLP (Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restriccion) a los diferentes fragmentos amplificados por PCR utilizando las enzimas de restriccion HincII, PstI, RsaI y SspI (tabla 2). Para realizar este analisis se emplearon 9 fragmentos de 1100 pb provenientes de Valle del Cauca (6TuV), Cundinamar ca (26SiC, 27SiC, 28SiC, 29SiC, 30SiC) y Santander (59PdCS, 61PdCS y 66CeS). Los analisis de PCR-RFLP permitieron evidenciar la presencia de polimorfismos begomovirales entre las muestras de los diferentes departamentos (figura 1).

En la muestra del Valle del Cauca (figura 1, carril 1) se observo digestion del fragmento de 1100pb con las enzimas de restriccion RsaI, PstI, SspI y HincII y la suma de los fragmentos obtenidos con las diferentes enzimas fue de 1100bp aproximadamente, lo que indicaba que en la muestra del Valle del Cauca predominaba una unica variante begomoviral afectando los cultivos de tomate. En las muestras de Cundinamarca (figura 1, carril 2-6) se observo digestion con todas las enzimas de restriccion utilizadas en el analisis mostrado un alto polimorfismo entre ellas. Con la enzima Pst I se obtuvieron tres patrones de restriccion: a) un fragmento de 1100 pb para la muestras 27SiC, 28SiC y 29SiC; b) dos fragmentos de 670 pb y 630 pb para las muestras 26SiC, 28SiC, 29SiC y 30SiC, patron que fue similar al encontrado en la muestra de Valle y muestras de Santander; c) dos fragmentos de 850 y 820pb en la muestra 30SiC. Los resultados de este analisis permitieron evidenciar la presencia de tres entidades begomovirales diferentes en las muestras recolectadas en el departamento de Cundinamarca y se encontro que en la muestras 28SiC, 29SiC y 30SiC, existian al menos dos entidades begomovirales presentes en cada muestra analizada. Este mismo resultado se observo cuando el analisis de restriccion se realizo con la enzima Ssp I, donde la suma de los fragmentos liberados por algunas muestras (26SiC, 27SiC, 29SiC y 30SiC) es mayor de 1100 pb, evidenciando la presencia de mas de un begomovirus por muestra analizada (figura 1, carril 2-6). Para el caso de las muestras recolectadas en el departamento de Santander (figura 1, carril 7-9), el analisis tipo PCR-RFLP arrojo dos resultados: las muestras 59PdCS y 61PdCS presentaron dos patrones de restriccion, implicando la presencia de al menos dos begomovirus diferentes; por su parte la muestra 66CeS presento un unico patron de restriccion. Este patron de restriccion fue similar al observado cuando se analizaron las muestras 59PdCS y 61PdCS por esta metodologia. Por ejemplo, con la enzima Ssp I se liberan cuatro fragmentos en las muestras 59PdCS y 61PdCS de 850, 750, 600 y 350pb; mientras que la muestra 66CeS libera solo dos fragmentos de 600 y 350pb, respectivamente (figura 1, carril 9). Es importante mencionar que las muestras 59PdCS y 61PdCS mostraron el mismo patron de restriccion con las cuatro enzimas utilizadas (tabla 2), lo que indica que ambas muestras presentan infecciones mixtas causadas por los mismos virus.

[FIGURA 1 OMITIR]

Estos resultados evidenciaron una distribucion geografica de los begomovirus que estan afectando tomate en Colombia: hay un unico begomovirus afectando el Valle; al menos tres begomovirus afectando Cundinamarca mientras que para el caso de Santander, se observaron al menos dos geminivirus afectando esta hortaliza. El patron de restriccion presentado por el begomovirus de Valle del Cauca fue tambien observado en muestras analizadas de Cundinamarca y Santander, lo que estaria indicando que este aislado geminiviral, podria estar presente en las areas productoras de tomate ubicadas en estos departamentos. Sin embargo, vale la pena anotar que algunos de los patrones de restriccion observados en las muestras de Cundinamarca y Santander son exclusivos de cada una de estos departamentos. Estos resultados en conjunto nos indicarian que al menos cuatro aislados geminivirales diferentes estan afectando cultivos de tomate en Colombia.

Otro resultado obtenido de este analisis tipo PCR-RFLP es la deteccion de mezclas de begomovirus afectando cultivos de tomate en areas biogeograficas particulares de Colombia. Este fue el caso de las muestras colectadas en los departamentos de Cundinamarca y Santander en los cuales se evidencio la presencia de mezclas de al menos dos geminivirus en cada muestra analizada. La presencia de infecciones mixtas de dos o mas geminivirus infectando una misma planta son comunes en cultivos ubicados en zonas tropicales y subtropicales del planeta (Harrison et al. 1997; Sanz et al. 2000). Actualmente hay evidencias que indican que la aparicion de enfermedades geminivirales cada vez mas severas pueden ser debido a las interacciones que entre este tipo de virus se pueden verificar cuando estan presentes en infecciones mixtas (Pita et al. 2001). Entre geminivirus que se encuentran coinfectando una misma planta (infeccion mixta) diferentes tipos de interacciones pueden verificarse entre ellos: algunas de ellas pueden implicar relaciones de sinergismo, que a la postre pueden conducir a la generacion de enfermedades en el tomate con sintomatologias mas acentuadas que aquellas producidas por cada virus por separado, o tambien pueden verificarse interacciones virales antagonicas en donde la presencia de un geminivirus particular interfiere con el desarrollo normal del ciclo infectivo del otro geminivirus presente en una misma planta conduciendo a infecciones cuyas sintomatologias son generalmente atenuadas (Mendez et al. 2003). Si cualquiera de estos tipos de interaccion entre geminivirus se esta verificando de manera particular en los cultivos de tomate de Santander y Cundinamarca es un topico interesante de abordar en futuras investigaciones.

El cultivo de tomate en Colombia es afectado por begomovirus relacionados con el Potato yellow mosaic virus y el Tomato venezuela virus

Con el fin de establecer la identidad de los begomovirus previamente detectados por PCR-RFLP, se procedio a clonar y secuenciar los productos amplificados de los componentes A y B (tabla 1). Para el componente genomico geminiviral A, se obtuvieron 13 clones en total: dos del Valle del Cauca provenientes de Tulua (6TuV-A) y Caicedonia (7CaV-A); Siete clones de Cundinamarca, provenientes de fincas ubicadas en la localidad de Silvania (27SiC-A, 28SiC-A, 29SiC1-A, 29SiC2-A, 30SiC1-A, 30SiC2-A, 30SiC3-A) y cuatro clones de Santander provenientes de las localidades de Pie de Cuesta (58PdCS-A, 59PdCS-A, 61PdCS-A) y Cepita (66CeS-A). Para el caso del componente genomico geminiviral B, se obtuvieron nueve clones en total: tres del Valle del Cauca provenientes de Pradera (5PrV-B), Caicedonia (7CaV-B) y Barragan (8BaV-B); cuatro de Cundinamarca provenientes de fincas en la localidad Silvania (26SiC-B, 27SiC-B, 28SiC-B, 29SiC-B) y dos de Santander provenientes de la localidad de Pie de Cuesta (59PdCS-B, 61PdCS-B).

Estos 22 fragmentos clonados fueron secuenciados, ensamblados y analizados en el programa blastn (Zhang et al. 2000). Los fragmentos correspondientes al componente genomico A presentaron un rango de longitud entre 1186-1287 bp y los fragmentos correspondientes al componente genomico B, una longitud de 510-558 bp. El analisis bioinformatico de la secuencia de nucleotidos de los fragmentos 29SiC1-A y 29SiC2-A indico la presencia del mismo fragmento clonado, por lo tanto a partir de este momento se denomino 29SiC-A. Este mismo hecho se observo para los fragmentos provenientes de la muestra 30SiC-A, los cuales mostraron ser identicos entre si. La secuencia de nucleotidos de estos 19 fragmentos fue depositada en la base de datos Genbank (tabla 1).

El analisis con blastn para cada una de las secuencias de nucleotidos provenientes del componente A geminiviral permitio determinar la presencia de 3 entidades virales relacionadas con el Virus del mosaico amarillo de la papa (Potato yellow mosaic virus--PYMV) y Tomato venezuela virus (ToVEV) (tabla 3). Dos fragmentos aislados de Valle del Cauca (6TuV-A, 7CaV-A) y dos de Cundinamarca (28SiC-A, 30SiC-A) presentaron su mayor porcentaje de identidad (96-99%) con Tomato yellow mosaic virus isolate Valle del Cauca (AY126610.1) (nombre propuesto no aceptado oficialmente por ICTV ya que se considera este puede ser una variante de PYMV; en este escrito se propone el acronimo PYMV-Valle para referirse a este virus), un begomovirus previamente reportado en Colombia infectando cultivos de tomate en la localidad de Rozo-Valle del Cauca (Martinez et al. 2008). Dos clones identificados en Cundinamarca (27SiC-A y 29SiC-A) presentaron identidades de 83% con Venezuela tomato geminivirus (AF026464.1), un begomovirus aislado de cultivos de tomate en Venezuela (Guzman et al. 1997) y posteriormente denominado ToVEV (Tomato Venezuela virus) por Arguello-Astorga & Ruiz-Medrano (2001). Por su parte, tres clones aislados en el departamento de Santander (58PdCS-A, 59PdCS-A, 61PdCS-A) presentaron valores de identidad de 93-94% con Potato yellow mosaic virus aislado Martinique (AF026464.1) un begomovirus reportado en el ano 2004 infectando plantas de tomate en isla Martinica (Urbino et al. 2004), mientras que el clon 66CeS-A tambien aislado en el departamento de Santander presento una identidad de 83% con Venezuela tomato virus (ToVEV). Estos resultados permiten afirmar que en las infecciones mixtas de geminivirus detectadas en este estudio afectando el cultivo tomate en Colombia hay tanto aislados begomovirales relacionados con PYMV como variantes lejanamente relacionados con el geminivirus ToVEV.

Para los fragmentos parciales del componente genomico geminiviral B, el analisis blastn de los clones 5PrV-B, 7CaV-B, 8BaV-B, 26SiC-B, 27SiC-B, 28SiC-B y 29SiC-B mostro valores de identidad del 81 al 92% con PYMV aislado Panama (Y15033.1). Mientras que el clon 59PdCS-B presento una identidad de 82% con PYMV aislado Puerto Rico (AY126613.1) y el clon 61PdCS-B una identidad de 82% con PYMV aislado Trinidad & Tobago (AF039032.1). La amplia diversidad a nivel de secuencia que presenta el fragmento correspondiente al componente genomico B con otros geminivirus reportados en el Genebank es una situacion bastante comun entre cepas de geminivirus bipartitas (Brown et al. 2005).

En conjunto estos resultados permiten plantear la posibilidad de que posibles eventos de pseurecombinacion podrian ocurrir (Padidam et al. 1999) entre estos geminivirus, cuando estos se encuentren presentes en infecciones mixtas en plantas de tomate. Si estos posibles eventos de pseudorecombinacion se constituyen en una fuente de origen de nuevas variantes geminivirales que conduzcan al desarrollo de patologias mas severas en este cultivo sera materia de futuras investigaciones.

El gen de la capside (CP) presenta el mayor grado de conservacion de todos los genes de los geminivirus (Wyatt & Brown, 1996), por tanto a partir del analisis de la secuencia del gen CP se puede preliminarmente inferir la identidad de un begomovirus particular, asi como su distribucion geografica y su relacion con su vector biologico (Brown et al. 2001; Fauquet et al. 2008). A partir de este criterio se procedio a realizar una matriz de identidad (tabla 4) utilizando aproximadamente 151nt del extremo 5'del MLA de CP de cada uno de los 10 begomovirus aislados y se compararon contra las secuencias de un grupo de begomovirus reportados previamente afectando el tomate en otras latitudes del planeta y cuyas secuencias reposan en el GenBank (ver metodologia). Por medio de este analisis se pudo evidenciar que dos begomovirus diferentes estan afectando el tomate en Colombia: un primer grupo de ellos (clones 6TuV-A, 7CaV-A, 27SiC-A, 28SiC-A, 29SiC-A y 30SiC-A recolectados en los departamentos del Valle del Cauca y Cundinamarca), estan relacionados con el PYMV tentativamente reportado como PYMV-Valle, con valores de identidad del 0,97 al 1. Este resultado podria indicar que PYMV emergio simultaneamente en estas dos regiones del pais bien sea por la diseminacion efectiva del mismo por parte de su vector biologico o bien sea por el transporte de material vegetal infectado por este virus de entre estas dos regiones. Un segundo grupo de geminivirus (clonas 58PdCS-A, 59PdCS-A, 61PdCS-A y 66CeS-A todos provenientes de muestras colectadas en el departamento de Santander) que se encontraron afectando el cultivo de tomate en Colombia estan relacionados con Tomato venezuela virus (ToVEV) con valores de identidad del 0,96-0,99. Es posible que la prevalencia de PYMV asi como de ToVEV afectando el cultivo de tomate en Colombia en diferentes zonas geograficas del pais pueda ser el producto de una rapida emergencia, a lo largo de un periodo medianamente largo de adaptacion a este hospedero, lo que condujo a un desplazamiento de cepas virales menos adaptadas al mismo, como se ha documentado en Mexico y Brasil en los ultimos anos (Polston & Anderson, 1997; Riveiro et al. 2003). Este mismo resultado puede reflejarse en el arbol filogenetico elaborado con las secuencias de CP de los geminivirus encontrados afectando el cultivo de tomate en campo (figura 2) en donde el porcentaje de identidad para miembros de un mismo grupo estaba en concordancia con el criterio de identidad de CP (Brown et al. 2001). Estos resultados indican que diferentes cepas de begomovirus estan afectando el cultivo de tomate en Colombia en diferentes zonas biogeograficas del pais: es decir que los geminivirus que afectan el tomate en los departamentos de Valle del Cauca y Cundinamarca estan principalmente relacionados con el PYMV, mientras que begomovirus que afectan este mismo cultivo pero en Santander estan relacionados con ToVEV, un geminivirus no emparentado con el PYMV (Guzman et al. 1997; Arguello & Medrano, 2001; Romay et al. 2010). Asimismo de los cladogramas se puede inferir que los geminivirus que afectan al tomate en Colombia todos pertenecen al hemisferio occidental (figura 2) pues se agrupan junto con otros begomovirus reportados en esta parte del planeta tales como PHYVV, SiGMV, AbMV, PePGMV y BDMV este ultimo ampliamente reportado afectando el cultivo de frijol en Colombia. A la fecha y de acuerdo a los resultados obtenidos en este estudio no hay evidencia de que algun geminivirus monopartita perteneciente al hemisferio oriental se encuentra afectando cultivo de tomate en Colombia (datos no mostrados).

Al realizar el analisis de secuencias de acidos nucleicos para el extremo 5' del gen de la proteina asociada a replicacion (Rep) de cada una de las clonas, se encontro la presencia de cuatro variantes virales asociadas a PYMV: una primera asociada a PYMV-Valle con valores de identidad entre 0,96 y 0,99 con los clones 6TuVA, 7CaV-A, 28SiC-A y 30SiC-A identificados en los departamentos de Valle del Cauca y Cundinamarca; una segunda entidad viral asociada a PYMV-Ma con valores de identidad de 0,93 con los clones 58PdCS-A, 59PdC-A y 61PdCS-A identificados en el departamento Santander; una tercera entidad asociada a CdTVTo con valores de identidad de 0,82 y 0,83 con los clones 27SiC-A y 29SiC-A; y una cuarta entidad viral asociada con los begomovirus PYMV-TT y BDMV con una identidad de 0,86 con el clon 66CeS-A identificado en el departamento de Santander (Tabla 4). Es interesante encontrar tres clones, 27SiC-A, 29SiC-A y 66CeS-A, que a nivel de CP tienen una identidad de 0,94-1,0 con PYMV, pero cuando se compara con Rep esta identidad tiene un valor bajo (Tabla 4). Este mismo resultado se encuentra cuando se compara su region intergenica (RI) encontrado un valor de identidad con PYMV de 0,47 (datos no mostrados). Con el fin de establecer la identidad de estos begomovirus, actualmente se esta trabajando en el laboratorio en la obtencion del genoma completo de 27SiC-A, 29SiC-A y 66CeS-A.

[FIGURA 2 OMITIR]

Analisis de interones presentes en el promotor del gen de la proteina asociada a la replicacion (Rep) de los begomovirus que afectan tomate en Colombia

Los geminivirus han evolucionado gracias a eventos de recombinacion y pseudorecombinacion sucedidos entre ellos a lo largo de la escala evolutiva (Van der Waltz et al. 2009; Padidam et al. 1999). Ese ultimo mecanismo evolutivo (pseudorecombinacion) esta determinado en gran medida por la similitudes a nivel del los elementos cis-regulatorios (particularmente los iterones) presentes en el promotor del gen de la proteina asociada a la replicacion (Rep) de estos virus. Basado en la teoria del iteron (Arguello-Astorga et al. 1994; Arguello-Astoga & Ruiz-Medrano, 2001) se realizo el analisis bioinformatico de los elementos cis-regulatorios (enfocado en la identificacion de los iterones) presentes en el promotor del gen de la proteina asociada a la replicacion (Rep) de cada uno de los aislados geminivirales que se encontraron afectando el tomate en Colombia (figura 3). La clona 59PdCS-A se descarto de este analisis dado que presenta una deleccion en la region comun que no permite obtener resultados validos. Por medio de este analisis se obtuvieron los siguientes resultados: primero, la disposicion y numero de los iterones presentes en la region promotora de Rep de los aislados geminivirales colombianos es similar a la que presentan los geminivirus presentes en el Hemisferio Occidental, de acuerdo al analisis filogenetico y estructural publicado por Arguello-Astorga y colaboradores (1994). Segundo, de acuerdo a la disposicion y orientacion de los iterones presentes en la region promotora de Rep de los aislados geminivirales colombianos se puede hablar que estos se distribuyen en dos grupos: un primer grupo de geminivirus (28SiC-A,30SiC-A, 6TuV-A, 7CaV-A, 58PdCS-A y 61PdCS-A) tienen cuatro iterones, dos en sentido directo y dos en sentido invertido, con una secuencia consenso AHHGGGGG; un segundo grupo de geminivirus (66CeS-A, 27SiC-A y 29SiC-A) que afectan el tomate en Colombia presentan una disposicion diferente presentando unicamente tres iterones, dos en sentido directo y uno en sentido invertido, con dos secuencias consensos: ATYGGKGT para 66CeS-A y ATTSGGTR para los aislados 27SiC-A y 29SiC-A. Esta ultima secuencia consenso de iterones es diferente a las reportadas a la fecha en otros geminivirus del hemisferio occidental y la cual seria un aporte novedoso de este trabajo. Tomando como base el resultado de estos analisis de iterones presentes en la region promotora de Rep de los aislados geminivirales que se encontraron afectando el tomate en Colombia se puede hipotetizar lo siguiente:

1) Aquellos aislados geminivirales colombianos que tienen iterones cuyo consenso es AHHGGGGG presentes en muestras de Valle del Cauca, Santander y Cundinamarca no solo pueden sufrir eventos de pseudorecombinacion entre ellos sino ademas con otros begomovirus cuyos iterones sean similares a nivel de secuencia tales como PYMV-Guadalupe, PYMV-Valle, ToMoTV y MalYMV. Si bien es cierto que ToMoTV, MalYMV y PYMV-Guadalupe no han sido reportados en Colombia afectando el tomate, no seria descabellado suponer que con el trasiego de material vegetal en un mundo globalizado como este, la introduccion de estos geminivirus y su posible pseudorecombinacion con cualquiera de los aislados colombianos cuyos iterones sean similares podria conducir a una enfermedad geminiviral mas acentuada (sinergismo) en tomate causando mayores perdidas a los productores. Existen pruebas irrefutables que dos geminivirus pueden pseudorecombinarse gracias a que la secuencia consenso de sus iterones era similar; los estudios que llevaron a cabo Ramos y colaboradores en 2003 comprobaron, por medio de ensayos de inoculacion por biobalistica, que el virus taino del tomate (ToMoTV) co-bombardeado junto con el PYMV-Guadalupe en plantas de tomate y tabaco producian la aparicion de sintomas tipicos de la enfermedad geminiviral. Ambos virus tenian secuencias de iterones similares y jamas se habian reportado juntos afectando el tomate. Es posible que este sinergismo entre geminivirus pueda evolutivamente permitirles la conquista de nuevos hospederos mediante una rapida adaptacion a los mismos.

2) En cuanto se refiere a los aislados geminivirales colombianos cuyos iterones tienen secuencias consenso ATYGGKGT y ATTSGGTR, estos no podrian pseudorecombinarse entre ellos ni con aquellos aislados geminivirales cuyo iteron tenga la secuencia consenso AHHGGGGGG. Es decir, posiblemente al encontrarse ambos aislados en una misma planta de tomate en vez de darse una relacion sinergica posiblemente se daria un fenomeno de interferencia, gracias a la diferencia entre sus iterones, debido a que competirian entre si por el replisoma de la planta. Es posible que desde un punto de vista evolutivo estos eventos de interferencia conduzcan a las poblaciones de geminivirus con iterones diferentes a evolucionar hacia nichos distintos o simplemente limiten sus posibilidades de sinergismo solamente a un grupo particular de geminivirus que estan compartiendo un area biogeografica particular. Este podria ser el caso del aislado de Santander (66CeS-A) el cual por su disposicion, secuencia y orientacion de sus iterones podria pseudorecombinar con PYMV-Trinidad asi como con TMoLCV-Zulia, todos los cuales son geminivirus que estan afectando el cultivo de tomate en un area geografica comun del nororiente del continente suramericano. Un caso particular se evidencio en dos aislados geminivirales que se encontraron afectando el cultivo de tomate en Cundinamarca (27SiC-A y 29SiC-A) cuya secuencia consenso de iterones era ATTSGGTR; estos podrian formar pseudorecombinantes viables entre ellos mismos pero no con otros aislados de PYMV reportados a la fecha en el Caribe y en Colombia. Es decir, estos aislados a pesar de estar emparentados filogeneticamante con PYMV no pueden transreplicarse con otros PYMV que no tengan iterones similares en secuencia con aquellos que estos poseen. Asimismo esta diversidad en iterones encontrados al interior del las poblaciones de PYMV que estan afectando el tomate en Colombia estan en perfecta concordancia con la comprobacion de la presencia de infecciones mixtas de geminivirus en el cultivo de tomate en Colombia. Es decir, a traves del analisis bioinformatico de iterones presentes en el promotor de la proteina asociada a la replicacion de geminivirus que estan afectando el tomate en Colombia, fue posible encontrar evidencia adicional que corrobora los resultados que indican la presencia de infecciones mixtas de estos afectando este cultivo en diferentes zonas geograficas del pais.

[FIGURA 3 OMITIR]

Conclusiones

Los resultados obtenidos en este trabajo de investigacion permiten concluir que los geminivirus que estan afectando actualmente el cultivo de tomate en Colombia pertenecen al genero de los Begomovirus y todos son bipartitas. No hay evidencia a la fecha de begomovirus monopartitas afectando esta hortaliza en Colombia. Se encontro que variantes de los begomovirus identificados afectando el tomate en campo estan relacionados filogeneticamente con el Virus del mosaico amarillo de la papa (PYMV) y con el Tomato venezuela virus (ToVEV). Existe una distribucion geografica de variantes de begomovirus identificados afectando el tomate en campo en Colombia: en el departamento de Santander predominan geminivirus relacionados filogeneticamente con PYMV-Martinica y con ToVEV; en el departamento de Cundinamarca hay begomovirus emparentados con PYMV-Valle y con el ToVEV; y en el departamento de Valle del Cauca predominan unicamente geminivirus relacionados con el PYMV-Valle.

Hay evidencia que indica que la enfermedad geminiviral en tomate en Colombia es causada por el accionar de dos o mas geminivirus en infecciones mixtas y que este hecho puede explicar la presencia de sintomas severos de enfermedad viral en algunos de las zonas tomateras muestreadas en el Pais. La evidencia de la presencia de infecciones mixtas proviene de los resultados obtenidos por medio de RFLP, secuenciacion de fragmentos de PCR asi como analisis de Iterones presentes en el promotor del la proteina asociada a la replicacion de geminivirus (Rep/AL1). El analisis bioinformatico de Iterones presentes en el promotor de la proteina asociada a la replicacion de geminivirus (Rep) permite hipotetizar los siguiente: algunas de las variantes geminivirales de Valle del Cauca, Santander y Cundinamarca pueden sufrir eventos de pseudorecombinacion entre ellos asi como con los begomovirus PYMV-Guadalupe, PYMV-Valle, ToMoTV y MalYMV; mientras que dos variantes geminivirales encontradas en Cundinamarca solo podrian formar pseudorecombinantes viables entre ellos mismos pero no con otros aislados de PYMV reportados a la fecha en el Caribe y en Colombia. Estas interacciones pueden conducir a sinergismos o a interferencias segun la identidad a nivel de secuencia que se pueda verificar por sus iterones.

El que los geminivirus que se encontraron afectando el tomate en Colombia sean en su mayoria variantes begomovirales de PYMV facilita implementar un programa de mejoramiento genetico por vias tradicionales o biotecnologicas encaminado a la busqueda de materiales de tomate con resistencia derivada de este fitopatogeno. A este respecto, nuestro grupo de trabajo se encuentra actualmente evaluando un banco de germoplasma de tomate silvestre inoculando aislados geminivirales colombianos mediante biobalistica para identificar materiales promisorios resistentes a estos virus endemicos de Colombia.

Recibido: noviembre 29 de 2011

Aprobado: junio 14 de 2012

Agradecimientos

El presente proyecto de investigacion fue financiado con recursos del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia, contrato 134-2008N6396-3460, y se desarrollo en asocio con la empresa Defrescura S.A. y la Universidad Nacional de Colombia. Los autores expresan su mas sincero agradecimiento a la Compania Agroindustrial de Semillas S.A., por su invaluable ayuda para la organizacion y recoleccion del material vegetal a lo largo ancho del territorio Colombiano. Betancurt-Perez J. agradece a Colciencias la beca recibida para realizar estudios de doctorado en Ciencias Agropecuarias.

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Juan Carlos Vaca-Vaca, Ph.D, Biotecnologia de Plantas; MSc. Microbiologia con Enfasis en Biotecnologia; Profesor del Departamento de Ciencias Agricolas. Universidad Nacional de Colombia. AA 237. Palmira Valle del Cauca, Colombia. Autor para correspondencia: jcvacav@unal.edu.co

Jhon Fredy Betancur-Perez, Candidato a Doctor en Ciencias Agropecuarias area de enfasis mejoramiento genetico. Universidad Nacional de Colombia.

Karina Lopez-Lopez, Ph.D, Biotecnologia de Plantas; Profesora Asociada del Departamento de Ciencias Biologicas. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad Nacional de Colombia.
Tabla 1. Descripcion de las clonas begomovirales obtenidas de las
muestras de tomate con sintomas virales obtenidas en este trabajo
de investigacion.

Departamento   Localidad    No. de    Rango de     Analisis
                            muestra   altitud      realizado
                                      (m.s.n.m.)
                                      (a)

Valle del      Pradera      5PrV      1146         PCR, clonacion,
Cauca                                              secuenciacion

Valle del      Tulua        6TuV      978          PCR-RFLP,
Cauca                                              clonacion,
                                                   secuenciacion

Valle del      Caicedonia   7CaV      1200         PCR, clonacion,
Cauca                                              secuenciacion

Valle del      Barragan     8BaV      1157         PCR, clonacion,
Cauca                                              secuenciacion

Cundinamarca   Silvania     26 SiC,   1978         PCR-RFLP,
                                                   clonacion,
                                                   secuenciacion
                            27SiC,    2184         PCR-RFLP,
                                                   clonacion,
                                                   secuenciacion
                            28SiC,    1845         PCR-RFLP,
                                                   clonacion,
                                                   secuenciacion
                            29SiC     1845         PCR-RFLP,
                                                   clonacion,
                                                   secuenciacion
                            30SiC     1845         PCR-RFLP,
                                                   clonacion,
                                                   secuenciacion

Santander      Pie de       58PdCS,   1151         PCR, clonacion,
                                                   secuenciacion
               cuesta       59PdCS    1632         PCR-RFLP,
                                                   clonacion,
                                                   secuenciacion
                            61PdCS    1632         PCR-RFLP,
                                                   clonacion,
                                                   secuenciacion

Santander      Cepita       66CeS     655          PCR-RFLP,
                                                   clonacion,
                                                   secuenciacion

Departamento      Localidad       No. de    Clonas      Numero de
                                  muestra   obtenidas   accesion en
                                            (b)         el Genbank

Valle del Cauca   Pradera         5PrV      5PrV-B      JQ073295

Valle del Cauca   Tulua           6TuV      6TuV-A      JN604019

Valle del Cauca   Caicedonia      7CaV      7CaV-A      JQ045696
                                            7CaV-B      JQ073296

Valle del Cauca   Barragan        8BaV      8BaV-B      JQ073297

Cundinamarca      Silvania        26 SiC,   26SiC-B     JQ073298
                                  27SiC,    27SiC-A     JQ045697
                                            27SiC-B     JQ073299
                                  28SiC,    28SiC-A     JQ045698
                                            28SiC-B     JQ073300
                                  29SiC     29SiC-A     JQ045699
                                            29SiC-B     JQ073301
                                  30SiC     30SiC-A     JQ045700

Santander         Pie de cuesta   58PdCS,   58PdCS-A    JQ045701
                                  59PdCS    59PdCS-A    JQ045702
                                            59PdCS-B    JQ073302
                                  61PdCS    61PdCS-A    JQ045703
                                            61PdCS-B    JQ073303

Santander         Cepita          66CeS     66CeS-A     JQ045704

(a) abreviatura de metros sobre el nivel del mar.

(b) La letra A indica que el fragmento clonado es parte del genoma
geminiviral A y la letra B, indica que el fragmento clonado es parte
del genoma geminiviral B.

Tabla 2. Analisis de restriccion enzimatica in vivo evidencia
mezcla de begomovirus en muestras de tomate colectadas en
diferentes departamentos de Colombia. Para la restriccion
enzimatica in vivo, los fragmentos de 1100 pb del componente
A fueron amplificados por PCR y digeridos con las enzimas de
restriccion HincII, PstI, SspI y RsaI. Los fragmentos obtenidos
fueron separados en un gel de poliacrilamida al 6%. El tamano de
cada fragmento fue calculado utilizando el marcador de peso
molecular 1 Kb Plus DNA Ladder[R] (ver Figura 1). Para la
restriccion enzimatica in silico se utilizaron secuencias de
nucleotidos parciales de begomovirus reportados en el GenBank,
las cuales se digirieron virtualmente con el programa MapDraw[R]
(software DNASTAR[R]) (ver metodologia).

                Hinc II (b)          Pst I (b)          Rsa I (b)

PYMV-Pa      1 (1200)            1 (1200)             2 (734, 566)
PYMV-TT      4 (680, 389, 100,   1 (1200)             3 (766, 430,
             100)                                     100)
PYMV-Valle   4(680, 389, 100,    2 670, 630)          2 (1200,100)
             100)
PYMV-To Gu   4 (680, 389, 100,   2 670,630)           2 (1200,100)
             100)
6TuV (a)     1 (850)             2 (670, 630)         1 (1100)
26SiC (a)    5 (860, 850, 640,   1 (630)              4 (1150, 1100,
             500, 350)                                700, 680)
27SiC (a)    4 (850, 640, 500,   1 (1100)             3 (680, 380,
             350)                                     370)
28SiC (a)    3 (850, 500, 350)   3 (1100, 670, 630)   2 (1100, 700)
29SiC (a)    2 (860, 640)        3 (1100, 670, 630)   3 (680, 380,
                                                      370)
30SiC (a)    5 (950, 870, 850,   3 (850, 820, 670)    3 (1200, 1150,
             640, 500)                                1100)
59PdCS (a)   2 (640, 620)        2 (670, 630)         1 (1100)
61PdCS (a)   2 (640, 620)        2 (670, 630)         1 (1100)
66CeS (a)    5 (640, 620, 600,   2 (670, 630)         1 (700)
             300, 250)

                      Ssp I (b)            R. E. (c)

PYMV-Pa      3 (646, 389, 253)             in silico
PYMV-TT      3 (646, 389, 253)             in silico

PYMV-Valle   2 (911, 389)                  in silico

PYMV-To Gu   3 (750, 389, 161)             in silico

6TuV (a)     2 (850, 350)                  in vivo
26SiC (a)    3 (850, 750, 350)             in vivo

27SiC (a)    4 (850, 750, 600, 350)        in vivo

28SiC (a)    2 (850, 350)                  in vivo
29SiC (a)    3 (850, 750, 350)             in vivo

30SiC (a)    5 (850, 750, 400, 380, 350)   in vivo

59PdCS (a)   4 (850, 750, 600, 350)        in vivo
61PdCS (a)   4 (850, 750, 600, 350)        in vivo
66CeS (a)    2 (600, 350)                  in vivo

(a) Para ver descripcion de los fragmentos begomovirales analizados
ver tabla 1.

(b) El numero indica el numero de fragmentos obtenidos con la enzima
de restriccion. Entre parentesis se indica el tamano aproximado de
los fragmentos obtenidos con la enzima de restriccion en pares de
bases.

(c) Se define como Restriccion enzimatica.

Tabla 3. Los begomovirus aislados de tomate en Colombia estan
relacionados con Potato yellow mosaic virus y Tomato venezuela
virus. La secuencia de acidos nucleicos de los clones que portan
un fragmento asociado al componente A y B fue comparada en la base
de datos Genbank empleando la herramienta blastn. Se muestran las
secuencias de begomovirus depositadas en la base de datos Genbank
que obtuvieron el mayor valor de % de identidad con los begomovirus
aislados en este trabajo.

Clona      Identidad         Descripcion de la secuencia con
                                     mayor identidad

6TuV-A     99%         Tomato yellow mosaic virus isolate Valle
                       del Cauca
7CaV-A     99%         Tomato yellow mosaic virus isolate Valle
                       del Cauca
27SiC-A    83%         Venezuela tomato geminivirus
28SiC-A    96%         Tomato yellow mosaic virus isolate Valle
                       del Cauca
29SiC-A    83%         Venezuela tomato geminivirus
30SiC-A    96%         Tomato yellow mosaic virus isolate Valle
                       del Cauca
58PdCS-A   93%         Potato yellow mosaic virus from Martinique
59PdCS-A   94%         Potato yellow mosaic virus from Martinique
61PdCS-A   93%         Potato yellow mosaic virus from Martinique
66CeS-A    84%         Venezuela tomato geminivirus
5PrV-B     92%         Potato yellow mosaic Panama virus
                       segment B, complete sequence
7CaV-B     91%         Potato yellow mosaic Panama virus
                       segment B, complete sequence
8BaV-B     81%         Potato yellow mosaic Panama virus
                       segment B, complete sequence
26SiC-B    83%         Potato yellow mosaic Panama virus
                       segment B, complete sequence
27SiC-B    82%         Potato yellow mosaic Panama virus
                       segment B, complete sequence
28SiC-B    81%         Potato yellow mosaic Panama virus
                       segment B, complete sequence
29SiC-B    83%         Potato yellow mosaic Panama virus
                       segment B, complete sequence
59PdCS-B   82%         Potato yellow mosaic virus from
                       Puerto Rico movement protein
61PdCS-B   82%         Potato yellow mosaic Trinidad virus
                       -[Trinidad & Tobago] strain
                       PYMV/TT movement protein (BV1) and
                       movement protein (BC1)

Clona          No. de        Acronimo
           accesion en el
              Genbank

6TuV-A       AY126610.1     PYMV-Valle

7CaV-A       AY126610.1     PYMV-Valle

27SiC-A      AF026464.1     ToVEV
28SiC-A      AY126610.1     PYMV-Valle

29SiC-A      AF026464.1     ToVEV
30SiC-A      AF026553.1     PYMV-Valle

58PdCS-A     AY126610.1     PYMV-To
59PdCS-A     AY126610.1     PYMV-To
61PdCS-A     AY126610.1     PYMV-To
66CeS-A      AF026464.1     ToVEV
5PrV-B        Y15033.1      PYMPV

7CaV-B        Y15033.1      PYMPV

8BaV-B        Y15033.1      PYMPV

26SiC-B       Y15033.1      PYMPV

27SiC-B       Y15033.1      PYMPV

28SiC-B       Y15033.1      PYMPV

29SiC-B       Y15033.1      PYMPV

59PdCS-B     AY126613.1     PYMV-To

61PdCS-B     AF039032.1     PYMV-TT

Tabla 3. Los begomovirus aislados de tomate en Colombia estan
relacionados con Potato yellow mosaic virus y Tomato venezuela
virus. La secuencia de acidos nucleicos de los clones que
portan un fragmento asociado al componente A y B fue comparada
en la base de datos Genbank empleando la herramienta blastn.
Se muestran las secuencias de begomovirus depositadas en la
base de datos Genbank que obtuvieron el mayor valor de % de
identidad con los begomovirus aislados en este trabajo.

Clona      Identidad          Descripcion de la secuencia con
                                      mayor identidad

6TuV-A     99%         Tomato yellow mosaic virus isolate Valle
                       del Cauca
7CaV-A     99%         Tomato yellow mosaic virus isolate Valle
                       del Cauca
27SiC-A    83%         Venezuela tomato geminivirus
28SiC-A    96%         Tomato yellow mosaic virus isolate Valle
                       del Cauca
29SiC-A    83%         Venezuela tomato geminivirus
30SiC-A    96%         Tomato yellow mosaic virus isolate Valle
                       del Cauca
58PdCS-A   93%         Potato yellow mosaic virus from Martinique
59PdCS-A   94%         Potato yellow mosaic virus from Martinique
61PdCS-A   93%         Potato yellow mosaic virus from Martinique
66CeS-A    84%         Venezuela tomato geminivirus
5PrV-B     92%         Potato yellow mosaic Panama virus segment B,
                       complete sequence
7CaV-B     91%         Potato yellow mosaic Panama virus segment B,
                       complete sequence
8BaV-B     81%         Potato yellow mosaic Panama virus segment B,
                       complete sequence
26SiC-B    83%         Potato yellow mosaic Panama virus segment B,
                       complete sequence
27SiC-B    82%         Potato yellow mosaic Panama virus segment B,
                       complete sequence
28SiC-B    81%         Potato yellow mosaic Panama virus segment B,
                       complete sequence
29SiC-B    83%         Potato yellow mosaic Panama virus segment B,
                       complete sequence
59PdCS-B   82%         Potato yellow mosaic virus from Puerto Rico
                       movement protein
61PdCS-B   82%         Potato yellow mosaic Trinidad virus-
                       [Trinidad & Tobago] strain PYMV/TT movement
                       protein (BV1) and movement protein (BC1)

Clona          No. de        Acronimo
           accesion en el
              Genbank

6TuV-A     AY126610.1       PYMV-Valle

7CaV-A     AY126610.1       PYMV-Valle

27SiC-A    AF026464.1       ToVEV
28SiC-A    AY126610.1       PYMV-Valle

29SiC-A    AF026464.1       ToVEV
30SiC-A    AF026553.1       PYMV-Valle

58PdCS-A   AY126610.1       PYMV-To
59PdCS-A   AY126610.1       PYMV-To
61PdCS-A   AY126610.1       PYMV-To
66CeS-A    AF026464.1       ToVEV
5PrV-B     Y15033.1         PYMPV

7CaV-B     Y15033.1         PYMPV

8BaV-B     Y15033.1         PYMPV

26SiC-B    Y15033.1         PYMPV

27SiC-B    Y15033.1         PYMPV

28SiC-B    Y15033.1         PYMPV

29SiC-B    Y15033.1         PYMPV

59PdCS-B   AY126613.1       PYMV-To

61PdCS-B   AF039032.1       PYMV-TT

Tabla 4. Comparacion de secuencias parciales del gen
AV1 (151 nt del extremo 5' del gen de la proteina de
la capside, CP) y del gen AC1 (696 nt del extremo 5'
del gen de la proteina asociada a replicacion, Rep)
de los begomovirus aislados de tomate en Colombia
con begomovirus reportados en la base de datos de
Genbank. Los valores mas altos estan senalados en
negrilla.

Clona       PYMV-Valle     PYMV-Ma       PYMV-TT

           Rep    CP     Rep    CP     Rep    CP

6TuV-A     0,98   0,99   0,91   0,97   0,78   0,97
7CaV-A     0,99   0,99   0,91   0,96   0,78   0,97
27SiC-A    0,75   1,00   0,76   0,97   0,79   0,98
28SiC-A    0,96   0,99   0,91   0,97   0,78   0,97
29SiC-A    0,75   0,98   0,76   0,95   0,80   0,96
30SiC-A    0,96   0,97   0,91   0,94   0,78   0,95
58PdCS-A   0,92   0,94   0,93   0,92   0,77   0,93
59PdCS-A   0,92   0,92   0,93   0,91   0,77   0,92
61PdCS-A   0,92   0,95   0,93   0,94   0,77   0,94
66CeS-A    0,80   0,94   0,79   0,93   0,86   0,94

Clona        CdTVTo        ToVEV          BDMV

           Rep    CP     Rep    CP     REP    CP

6TuV-A     0,77   0,85   0,80   0,95   0,76   0,84
7CaV-A     0,77   0,84   0,80   0,96   0,76   0,83
27SiC-A    0,82   0,85   0,81   0,96   0,79   0,85
28SiC-A    0,76   0,85   0,79   0,97   0,75   0,84
29SiC-A    0,83   0,85   0,82   0,95   0,79   0,84
30SiC-A    0,76   0,85   0,79   0,97   0,75   0,83
58PdCS-A   0,76   0,83   0,79   0,98   0,76   0,83
59PdCS-A   0,75   0,81   0,79   0,97   0,76   0,84
61PdCS-A   0,76   0,84   0,79   0,99   0,76   0,84
66CeS-A    0,82   0,83   0,81   0,97   0,86   0,84
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Title Annotation:ARTICULO DE INVESTIGACION
Author:Vaca-Vaca, Juan Carlos; Betancur-Perez, Jhon Fredy; Lopez-Lopez, Karina
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Jul 1, 2012
Words:9834
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