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Distribucion de beta-catenina en lesiones displasicas de colon en ratas alimentadas con leche de bufala.

INTRODUCCION

Mediante estudios clinicos se ha demostrado una reduccion de la hiperproliferacion de la mucosa intestinal despues del consumo de acidos grasos poliinsaturados omega-3 derivados del aceite de pescado, en individuos con elevado riesgo de cancer de colon debido a la presencia de adenomas colonicos esporadicos (1, 2).

Aunque algunos investigadores describieron mecanismos a traves de los cuales los acidos grasos omega-3 tienen una participacion en la carcinogenesis actuando en la biosintesis de eicosanoides en la peroxidacion lipidica y en alguna via de transduccion de senal, en la actualidad aun son escasos los datos que relacionen todos estos mecanismos (13).

En referencia al acido linoleico conjugado (ALC), se le han atribuido numerosas propiedades biologicas como agente anticarcinogenico, antiarteroesclerotico, antiadipogenico, y antidiabetogenico. Ademas, el ALC modula la inmunidad y los mecanismos de trombosis, asi como la bioquimica de los acidos grasos, el metabolismo lipidico y la expresion genetica en el higado, musculo y tejido adiposo (3).

La concentracion de ALC en la leche bovina es variable, alternando desde 2,4 a 21,8 mg de ALC/g de grasa (24). Por otra parte, un estudio demostro que en la leche de los rumiantes su concentracion podria aumentar por la adicion dietaria de aceite de girasol (rico en acido linoleico) y aceite de lino (alto en acido linolenico) (9).

Como otros acidos grasos poliinsaturados, el ALC puede modular la carcinogenesis mediante mecanismos que afectan los estadios del cancer conocidos como iniciacion, promocion, progresion y/o regresion (7).

Un biomarcador intermedio utilizado para detectar cancer de colon son los focos de criptas aberrantes (FCA), lesiones ampliamente usadas para detectar sustancias promotoras y supresoras. Se postula que los FCA son lesiones pre-malignas. La displasia se define como un "cambio pre-carcinomatoso" y como "una alteracion neoplasica inequivoca del epitelio colonico" (23). Tambien, se han incluido a las criptas que acumulan [beta]-catenina como nuevos biomarcadores de la carcinogenesis colonica en ratas, por su fuerte predisposicion al cancer de colon (10, 16).

Las cateninas son elementos necesarios para el establecimiento de las adhesiones intercelulares, constituyendo factores importantes para la regulacion de los complejos de adhesion. Una de ellas, la catenina beta, actua como intermediaria para la union entre las moleculas de adhesion y el citoesqueleto celular. En los mamiferos se localiza en el citoplasma y nucleo de la celula, participando en la formacion de uniones adherentes de epitelios, siendo ademas un componente importante en la regulacion transcripcional, en particular durante el desarrollo del embrion (28, 30).

Existen mutaciones que inactivan la [beta]-catenina y/o el gen APC (adenomatous polyposis coli); este ultimo es un supresor tumoral que codifica una proteina inhibidora del cancer colorrectal. Por su parte, las vias de senalizacion WNT (wingless type) son un grupo de proteinas transductoras que transfieren senales del exterior al interior de una celula. La estimulacion de la via WNT conduce a la acumulacion de [beta]-catenina (10, 16).

La perdida de la funcion APC imposibilita la disminucion de [beta]-catenina, la cual consecuentemente se acumula en el citoplasma y se traslada al nucleo donde se complementa con factores de transcripcion y activa genes que representan una via oncogenica potencial (10, 12, 16).

La expresion aberrante de [beta]-catenina en tumores de colon y el descubrimiento de mutaciones de [beta]-catenina en pequenos adenomas, sugieren que tales alteraciones son eventos tempranos en la carcinogenesis colorrectal en seres humanos. Las celulas epiteliales colonicas normales adyacentes a los FCA muestran fuerte expresion membranosa de [beta]-catenina y falta de expresion citoplasmatica y nuclear. En FCA displasicos, la expresion membranosa reducida de [beta]-catenina estuvo asociada al aumento de la expresion citoplasmatica y nuclear. La expresion membranosa de [beta]-catenina fue reducida y la expresion citoplasmatica y nuclear aumentada en FCA acorde a sus grados de displasia. Estos datos sugieren que los FCA y su expresion aberrante de [beta]-catenina participan en la tumorigenesis colonica (8).

Cuando los genes para [beta]-catenina o APC estan mutados o la via de senalizacion WNT esta activada, la [beta]-catenina se acumula en el citosol, liga proteinas de la familia de factor de celulas T y de transcripcion y se mueve al nucleo (14). La activacion de la via APC/[beta]-catenina participa de manera importante en la tumorigenesis colonica y las mutaciones de APC (18) y [beta]-catenina (27) ocurren de manera temprana en este proceso.

Estos datos sugieren que, ademas de la estabilidad proteica alterada (que ocurre cuando las serinas 33 y/o 45 se encuentran mutadas), la exposicion al carcinogeno tambien resulta en aumento de transcripcion o estabilizacion de [beta]-catenina. Por otra parte, mutaciones de [beta]-catenina se han encontrado en el higado (5, 17), colon (29), tumores de vejiga (25) y en criptas colonicas aberrantes de ratones (30) y tumores de ratas (11, 28).

La presencia de [beta]-catenina en LD de colon de ratas podria coadyuvar en la deteccion temprana de lesiones pre-carcinomatosas.

MATERIAL Y METODOS

Para la experiencia se utilizaron ratas Wistar machos de 6 semanas (160 g) que recibieron diferentes dietas lacteas durante 123 y 240 dias (21). Se utilizaron dos tipos de dietas lacteas, una estandar, obtenida de bufalas alimentadas con pasturas naturales, y otra dieta lactea mejorada proveniente de bufalas suplementadas con aceite de pescado, con alto contenido en ALC y Omega-3. Se conformaron tres lotes experimentales de la siguiente manera:

Lote 1: ratas con agua y alimento balanceado comercial ad-libitum durante 123 y 240 dias + inyecciones de 1,2-dimetilhidrazina (DMH).

Lote 2: ratas con alimento balanceado comercial y leche ad-libitum de bufalas alimentadas con pasturas naturales durante 123 y 240 dias + inyecciones con DMH.

Lote 3: ratas con dieta y leche ad-libitum de bufalas suplementadas con maiz y aceite de pescado, durante 123 y 240 dias + inoculacion con DMH.

La induccion de lesiones displasicas se realizo mediante inyecciones subcutaneas de DMH a la dosis de 20 mg/kg, a partir de los 15 dias del suministro de la dieta lactea, y se prolongo durante 35 dias, totalizando 5 inyecciones, una por semana. Luego del periodo de inyeccion, las ratas continuaron alimentandose con leche, hasta completar 123 y 240 dias de experiencia, luego de los cuales se realizo el sacrificio.

Posteriormente al sacrificio, el intestino grueso se fijo en formol bufferado al 10% para luego ser procesados segun la tecnica clasica para bloques parafinados, cortados en 5 [micron]m y coloreados con hematoxilina-eosina. En tales cortes coloreados, las lesiones displasicas fueron clasificadas de acuerdo al grado de severidad de la displasia en leves, moderadas y severas (26).

Mas adelante se procedio a efectuar cuatro cortes seriados de las lesiones displasica observadas con dichos colorantes. Los cortes se colocaron en portaobjetos previamente tratados pon poly-l-lisyne a fin de evitar que se despeguen durante el procesamiento.

Con cada una de las muestras obtenidas se procedio de la siguiente manera: desparafinado e hidratacion; recuperacion antigenica en microondas con las muestras sumergidas en buffer citrato pH 6; inactivacion de la peroxidasa endogena con metanol y peroxido de hidrogeno; bloqueo de uniones inespecificas con suero normal de cabra diluido 1/20 con phosphate buffered saline (PBS) a pH 7,4; incubacion con "anticuerpo primero" (anti-beta catenina: Purified Mouse Anti-Beta Catenin Transduction Laboratories, utilizado en dilucion 1/200) en camara humeda a 4[grados]C, durante toda la noche.

Luego se realizo incubacion con "anticuerpo segundo" (biotinilado policlonal anti- IgG de raton conjugado con biotina, codigo AM-B1). Este anticuerpo es elaborado en el Laboratorio de Endocrinologia y Tumores Hormonodependientes de la Facultad de Bioquimica y Ciencias Biologicas de la Universidad Nacional del Litoral (Argentina).

La dilucion optima de uso fue 1/100. La incubacion se realizo en camara humeda a temperatura de 25[grados]C durante 30 minutos, y el revelado se hizo con ExtrAvidin [R] (peroxidase buffered aqueous solution, Sigma-Aldrich) diluido 1/200 con PBS esteril. Se dejo 30 minutos en camara humeda a 25[grados]C.

El cromogeno (Sigma-Aldrich) se utilizo en una dilucion final de 0,05% con diaminobenzidina tetrahidrocloruro + 0,015% de peroxido de hidrogeno en PBS 0,01 M pH 7,2. Se incubaron las muestras durante 2 1/2 minutos a temperatura ambiente, luego se efectuo la deshidratacion de los cortes y montaje con balsamo de Canada (Biopack). Una vez obtenidas las muestras coloreadas con inmunohistoquimica (IHQ) se procedio a su analisis microscopico evaluando:

a) diferencias en la cantidad de proteina [beta]-catenina de las lesiones en comparacion con las criptas normales circundantes (a mayor coloracion, mayor cantidad de proteina).

b) distribucion de las proteinas en citoplasma o nucleo. Normalmente las proteinas se localizan en la membrana citoplasmatica.

c) posibilidad de poder determinar diferencias entre focos displasicos leves, moderados o severos con inmunohistoquimica de [beta]-catenina.

d) diferencias entre focos displasicos dependiendo del tipo de leche ingerida por los animales.

Todos los analisis efectuados se llevaron a cabo teniendo en cuenta como control interno la mucosa normal circundante a las lesiones displasicas.

RESULTADOS

Las celulas epiteliales colonicas de la mucosa intestinal histologicamente normal, claramente mostraron predominio de expresion membranosa de [beta]-catenina. En las celulas superficiales mas diferenciadas se pudo identificar a la proteina tambien en el citoplasma, con coloracion mucho mas leve que en la membrana celular.

No sucedio lo mismo en las celulas de la profundidad de las glandulas, en las que el citoplasma resulto negativo para la presencia de [beta]-catenina, quedando solamente en la membrana citoplasmatica. Los enterocitos proximos a la capa muscular de la mucosa presentaron coloracion membranosa mucho mas clara que las celulas superficiales. No se observo [beta]-catenina en los nucleos de celulas normales.

En las lesiones displasicas la distribucion de [beta]-catenina se modifico sustancialmente acorde a la severidad de la displasia. En las displasias leves (Figura 1), se observo distribucion de [beta]-catenina en membrana semejante a las glandulas normales, pero con notable acumulo en citoplasma, cuando las displasias afectaban a la profundidad de las criptas.

En las lesiones displasicas de grado moderado (Figura 2), con inmunohistoquimica se observo claramente mayor acumulo de proteina en las glandulas displasicas al compararlas con las glandulas normales circundantes. La marcacion de [beta]-catenina fue intensa en las membranas de celulas displasicas, que ademas presentaron acumulacion de [beta]-catenina en los nucleos.

Las lesiones displasicas inducidas y encontradas en todos los animales experimentales de este estudio fueron clasificadas como leves y moderadas, no habiendose observado lesiones de tipo severas o carcinomas in situ, por lo que no se obtuvieron datos de distribucion de [beta]-catenina en este tipo de lesiones. Tampoco hubo diferencias en la distribucion de [beta]- catenina entre los diferentes lotes experimentales.

DISCUSION

En seres humanos, el descubrimiento de la expresion aberrante de [beta]-catenina en una proporcion significativa de focos de criptas displasicas, sugiere que la disfuncion de la [beta]-catenina es un evento muy temprano en el desarrollo de tumores colonicos. El hecho de que las alteraciones fenotipicas aumentaron significativamente a medida que el grado de displasia aumentaba, indica que cada una de estas alteraciones fenotipicas refleja el rol de la [beta]-catenina en la progresion de las LD (8).

Estos hallazgos son coincidentes con nuestra experiencia en la cual encontramos que las LD mostraron marcacion de [beta]-catenina diferente a las glandulas normales, y su distribucion vario de acuerdo al grado de displasia. En celulas normales, bien diferenciadas, la [beta]-catenina se localiza en la membrana para cumplir su funcion de adherencia a las celulas vecinas, mientras que en celulas menos diferenciadas, como ocurre en las LD, se reduce la expresion membranosa, asociandose con mayor expresion en citoplasma y posteriormente en el nucleo, acorde va aumentando la severidad de la displasia.

Investigadores han reportado un significativo aumento de la expresion nuclear y disminucion de la expresion membranosa de [beta]-catenina en carcinomas, comparados con sus adenomas adyacentes (8). La expresion citoplasmatica de [beta]-catenina tambien ha sido reportada en lesiones displasicas de ratas tratadas con azoximetano (19, 20). Los mecanismos que llevan a la acumulacion citoplasmatica y a la expresion de [beta]-catenina son inciertos.

Tambien se encontro sobreexpresion de [beta]-catenina en adenomas colonicos de ratas inducidas con azoximetano. La [beta]-catenina tambien se localizo en el nucleo de adenomas de este mismo modelo, en el cual la mayoria de los tumores habia demostrado tener APC intacto (4) sugiriendo que APC no es un objetivo comun del azoximetano.

Segun algunos autores la carcinogenesis experimental colonica en ratas puede ser inhibida alimentandolas con dietas con altas concentraciones de aceite de pescado (6, 22) o suplementadas con acidos grasos omega-3 (15). Por otra parte, ALC puede modular la carcinogenesis mediante mecanismos que afectan los estadios del cancer conocidos como iniciacion, promocion, progresion y/o regresion. Sin embargo, el mecanismo actual por el cual el ALC afecta la carcinogenesis todavia es incierto. Un estudio sugiere que el ALC podria actuar mediante mecanismos antioxidantes (7).

En nuestra experiencia, hemos observado menor frecuencia de LD en ratas que recibieron leche mejorada (22), sin embargo, la distribucion de [beta]-catenina en LD inducidas con DMH en ratas alimentadas con leche de bufala estandar y mejorada con mayor concentracion de ALC y omega-3, fueron semejantes. En el presente trabajo, la distribucion de [beta]-catenina en LD de colon de ratas fue coincidente con las LD halladas en colon de seres humanos. Estos hallazgos podrian ayudar en la deteccion temprana de lesiones pre-carcinomatosas.

REFERENCIAS

(1.) Anti M, Marra G, Armelao F. 1992. Effects of omega-3 acids on rectal cell proliferation in subjects at risk for colon cancer. Gastroenterology 103: 883-891.

(2.) Anti M, Armelao F, Marra G. 1994. Effects of different doses of fish oil on rectal cell proliferation in patients with sporadic colonic adenomas. Gastroenterology 107: 1709-1718.

(3.) Belury MA. 2002. Dietary conjugated linoleic acid in health: physiological effects and mechanisms of action. Ann Rev Nutr 22: 505-531.

(4.) Caderni G et al. 1997. APC mutations in aberrant crypt foci (ACF) and colonic tumors induced by azoximethane in F 344 rats. Proc Amer Assoc Cancer Res 38: 467.

(5.) Calvisi DF, Factor BM, Loi R, Thorgeirsson SS. 2001. Activation of [beta]-catenin during hepatocarcinogenesis in transgenic mouse models: Relationship to phenotype and tumor grade. Cancer Res 61: 2085-2091.

(6.) Deschner EE, Lytle JS, Wong G, Ruperto JF, Newmark HS. 1990. The effect of dietary omega-3 fatty acids (fish oil) on azoximethanol-induced focal areas of dysplasia and colon tumor incidence. Cancer 66: 2350-2356.

(7.) Ha YL, Storkson JM, Pariza MW. 1990. Inhibition of benzo(a)pyrene-induced mouse fore-stomach neoplasia by conjugated dienoic derivatives of linoleic acid. Cancer Res 50: 1097-1101.

(8.) Hao XP, Pretlow TG, Rao S, Pretlow TP. 2001. [beta]-Catenin expression is altered in human colonic aberrant cripta foci. Cancer Res 61: 8085-8088.

(9.) Kelly ML et al. 1998. Dietary fatty acid sources affect conjugated linoleic acid concentrations in milk from lactating dairy cows. J Nutr 128: 881-885.

(10.) Kinzler KW, Vogelstein B. 1996. Lessons from hereditary colorectal cancer. Cell 87: 159-170.

(11.) Koesters R et al. 2001. Predominant mutation of codon 41 of the [beta]-catenin proto-oncogene in rat colon tumors induced by 1,2-dimethylhydrazine using a complete carcinogenic protocol. Carcinogenesis 22: 1885-1890.

(12.) Lamlum H, Papadopoulos A, Llyas M. 2000. APC mutations are sufficient for the growth of early colorrectal adenomas. Proc Natl Acad Sci USA 95: 2225-2228.

(13.) Larsson S, Kumlin M, Ingleman M, Wolk A. 2004. Dietary long chain n-3 fatty acids for the prevention of cancer: a review. Am J Clin Nutr 79: 935-945.

(14.) Mann B et al. 1999. Target genes of [beta]-catenin-T cell-factor/lymphoid-enhancer-factor signaling in human colorrectal carcinomas. Proc Natl Acad Sci USA 96: 1603-1608.

(15.) Minoura T et al. 1998. Effect of dietary eicosapentaenoic acid on azoximethane induced colon carcinogenesis in rats. Cancer Res 48: 4790-4794.

(16.) Mollersen L, Vikse R, Andreassen A. 2004. Adenomatous polyposis coli truncation mutations in 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazol 4,5b pyridine (PhIP)-induced intestinal tumours of multiple intestinal neoplasia mice. Mutat Res 557: 29-40.

(17.) Ogawa K, Yamada Y, Kishibe K, Ishizaki K, Tokusashi Y. 1999. [beta]-catenin mutations are frecuent in hepatocellular carcinomas but absent in adenomas induced by diethylnitrosamine in B6C3F1 mice. Cancer Res 59:1830-1833.

(18.) Powel SM et al. 1992. APC mutations occur early during colorectal tumorigenesis. Nature 359: 235-237.

(19.) Pretlow TP, Bird RP. 2000. Frequent [beta]-catenin gene mutations and accumulations of the protein in the putative preneoplastic lesions lacking macroscopic aberrant crypt foci appearance, in rat colon carcinogenesis. Cancer Res 60: 3323-3327.

(20.) Pretlow TP, Bird RP. 2001. Sequential analysis of morphological and biological properties of [beta]-catenin-accumulated crypts, provable premalignant lesions independent of aberrant crypt foci in rat colon carcinogenesis. Cancer Res 61: 1874-1878.

(21.) Ramirez GV et al. 2012. Disminucion del desarrollo de cancer experimental del colon en ratas alimentadas con leche de bufala. Rev Vet 23: 15-19.

(22.) Reddy BS, Marayama H. 1986. Effects of dietary fish oil on azoximethane induced colon carcinogenesis in male F344 rats. Cancer Res 46: 3367-3370.

(23.) Riddell RH et al. 1983. Dysplasia in inflammatory bowel disease: standardized classification with provisional clinical applications. Hum Pathol 14: 931-966.

(24.) Riel RR. 1963. Physico-chemical characteristics of canadian milk fat. Unsaturated milk fatty acids. J Dairy Sci 46: 102-106.

(25.) Shiina H et al. 2001. Alterations of beta and gamma catenin in N-butyl-N-(-4-hydroxybutyl) nitrosamine-induced murine bladder cancer. Cancer Res 61: 7101-7109.

(26.) Siu IM, Pretlow TG, Amini SB, Pretlow TP. 1997. Identification of dysplasia in human colonic aberrant crypt foci. Am J Pathol 150: 1805-1813.

(27.) Sparks AB, Morin PJ, Vogelstein B. 1998. Mutational analysis of the APC/[beta]-catenin/Tcf pathway in colorrectal cancer. Cancer Res 58: 1130-1134.

(28.) Takahashi M, Fukuda K, Sugimura T, Wakabayashi K. 1998. [beta]-catenin is frequently mutated and demonstrates altered cellular location in azoximethane induced rat colon tumors. Cancer Res 58: 42-46.

(29.) Takahashi M, Nakatsugi S, Sugimura T, Wakabayashi K. 2000. Frecuent mutations of beta-catenin in mouse colon tumors induces by azoxymethane. Carcinogenesis 21: 1117-1120.

(30.) Yamada Y et al. 2001. Sequential analysis of morphological and biological properties of beta-catenin accumulated crypts, provable premalignant lesions independent of aberrant crypt foci in rat colon carcinogenesis. Cancer Res 61: 1874-1878.

Catuogno, M.S.; Montenegro, M.A.; S.Negrette, M.

Catedra de Patologia General y Sistematica, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNNE. Sargento Cabral 2139, Corrientes 3400, Argentina. E-mail: patgral@vet.unne.edu.ar

Recibido: 14 febrero 2018 / Aceptado: 6 abril 2018

http://dx.doi.org/10.30972/vet.2923269
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Author:Catuogno, M.S.; Montenegro, M.A.; S.Negrette, M.
Publication:Revista Veterinaria
Date:Dec 1, 2018
Words:3355
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