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Diseno de vacunas recombinantes en las enfermedades de Gumboro, Newcastle y Laringotraqueitis Infecciosa Aviar.

Design of recombinant vaccines for Gumboro, Newcastle and Avian Infectious Laryngotracheitis ***

Desenho de vacinas recombinantes nas doengas de Gumboro, Newcastle e Laringotraqueite infecciosa aviar

Introduccion

Desde hace mas de 60 anos, la produccion avicola mundial ha experimentado un crecimiento de manera rapida y constante. Entre los anos 2000 al 2010, la tasa de crecimiento anual en produccion de carne de pollo y de huevo fue en promedio de 3,9 (Figura 1) y 2,1% (Figura 2), respectivamente (97). En Colombia, el inicio de la avicultura comercial se presento entre los anos 1940 a 1960, epoca en la cual solo existian producciones de traspatio. Desde este periodo el progreso en el sector se ha presentado gracias a que los avicultores han implementado estrategias de desarrollo, enfocadas principalmente en la comercializacion, la integracion vertical de la cadena productiva y la renovacion tecnologica de las explotaciones (80). Algunas zonas del pais como Cundinamarca, Santander, Valle, Antioquia y Tolima poseen caracteristicas aptas para la produccion y la distribucion de los productos avicolas, es por esto que estas regiones se han consolidado en las areas de mayor productividad para los avicultores (3, 56).

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La avicultura desempena un papel fundamental en la economia colombiana, generando cerca de 240.000 empleos (80) y una alta participacion en el producto interno bruto nacional (PIB) (Figura 3) (3). En los ultimos 20 anos el sector avicola se ha consolidado en la produccion pecuaria mas dinamica dentro del pais, con un crecimiento promedio del 6% entre los anos 2006 a 2009 (81), 4,6% en el ano 2010 y 3,8% en el 2011, posicionando al pollo como el tipo de carne con el mayor consumo per capita de Colombia (Figura 4). En el 2012 se reporto un encasetamiento de 633.399 pollos de engorde y 32.628.184 de ponedora comercial (6,90,97), demostrando que en las ultimas decadas Colombia ha seguido la tendencia mundial de crecimiento constante de la industria (4, 86).

El crecimiento del sector se ha visto condicionado por dos aspectos de importancia: la sanidad de la produccion aviar y la inocuidad de los productos avicolas. Dentro del tema de sanidad cabe resaltar tres enfermedades de control oficial: la influenza aviar (el pais fue declarado libre por el Instituto Colombiano Agropecuario--ICA, que efectuo la autodeclaracion por medio de la Resolucion 1610 de 2011), la enfermedad de Newcastle (endemica declarada de prioridad sanitaria en la Ley 1255 de 2008) y la Salmonelosis aviar (zoonotica). Tambien existe el grupo de enfermedades que representan perdidas economicas para los productores, tales como la enfermedad de Gumboro, la Micoplasmosis aviar, la Bronquitis Infecciosa, la Laringotraqueitis Infecciosa Aviar, entre otras. En cuanto a la inocuidad de los productos, los datos son inciertos; el ICA cuenta con una normatividad vigente para el control de los residuos quimicos, sin embargo no es comun el uso de la caracterizacion de estos productos o de posibles patogenos, exceptuando a la Salmonella spp. en pollo crudo, la cual en algunos estudios se ha determinado una prevalencia cercana al 7% (89).

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Entre las estrategias empleadas para la prevencion y el control de las enfermedades infecciosas en la industria avicola estan la bioseguridad y la vacunacion; esta ultima es importante dado que diversas enfermedades infecciosas tienen una distribucion mundial o en el caso de algunos patogenos se transportan a traves del aire ("airborne pathogens"), lo que dificulta su control incluso con medidas de bioseguridad 21. Adicionalmente, se debe considerar que las caracteristicas de algunos virus pueden modificar la respuesta a los desinfectantes utilizados en las granjas. Los derivados fenolicos poseen un efecto limitado sobre virus desnudos, mientras que se ha demostrado que la cetrimida, el cloruro de benzalconio, la clorhexidina y el yodo povidona si son efectivos contra virus como el de la inmunodeficiencia humana y el Herpes Virus tipo 1 (95). En el caso del virus de la enfermedad de Gumboro se ha reportado la baja sensibilidad a procesos de eliminacion con eter, cloroformo y fenol y a desinfectantes como amonios cuaternarios. La formalina al 0,5% y los yodados son capaces de reducir la infectividad del virus pero no lo elimina, lo cual ha favorecido su persistencia en las granjas (58).

A pesar de la continua implementacion de las estrategias mencionadas anteriormente, se siguen presentando brotes de algunas enfermedades infecciosas en las aves comerciales. Es por esto que el estudio de los agentes infecciosos y su neutralizacion o atenuacion ha continuado a traves de los anos. Los recientes avances en la biologia molecular, la ingenieria genetica recombinante y la inmunologia han generado un cambio en el diseno de vacunas empleadas en medicina veterinaria, mejorando de forma significativa la seguridad, la eficacia y el costo de las mismas (8, 98). Es asi como actualmente se reconocen tres generaciones en el diseno de inmunogenos. Las vacunas de primera generacion son aquellas que requieren el cultivo de los agentes patogenos, los cuales son administrados en forma atenuada (vacunas vivas atenuadas) o inerte (vacunas muertas o inactivadas). Las vacunas de segunda generacion se producen utilizando solo la parte especifica del patogeno que estimula la respuesta inmune, mientras que las de tercera generacion utilizan el ADN de los agentes de manera directa o indirecta en un virus o una bacteria recombinante.

Dentro de estas nuevas generaciones de biologicos se incluyen vacunas de peptidos sinteticos (secuencias de aminoacidos de proteinas antigenicas), vacunas antiidiotipo (anticuerpos que reproducen la morfologia del antigeno), vacunas de proteinas y peptidos recombinantes (a traves de la produccion de proteinas por insercion del ADN en sistemas de expresion como bacterias) y vacunas genicas (material genetico del patogeno como ADN desnudo o en vectores viricos o bacterianos) (57,65.67) En la industria avicola se han empleado de forma rutinaria las vacunas de primera generacion; sin embargo, en la actualidad se esta implementado el uso de los biologicos de tercera generacion como las vacunas de ADN recombinante.

En algunos estudios realizados en paises como China, Belgica, Italia, Francia y Estados Unidos, se presentan resultados relacionados con los porcentajes de cobertura de aves vacunadas con este tipo de biologicos. En el estudio de Rong et al. en el 2007 se utilizo una vacuna recombinante con la proteina VP2 contra la enfermedad de Gumboro, donde la tasa de proteccion medida a traves de la deteccion de anticuerpos oscilo entre 72 y 95%. De la misma manera, otro estudio en campo en el que se comparo la efectividad de una vacuna recombinante comercial contra la misma enfermedad (Vaxxitek[R]) frente a vacunas tradicionales elaboradas con cepas intermedias, se evidencio que los titulos de anticuerpos se mantuvieron altos (>6.000) en los grupos que recibieron la vacuna recombinante. En contraste, los titulos de anticuerpos fueron bajos (<4.000) en aves vacunadas con las cepas intermedias, los cuales solo aumentaron despues del dia 42 77. Este tipo de investigaciones no han sido exclusivas para la enfermedad de Gumboro, en estudios similares se obtuvieron seroconversiones y respuestas inmunes efectivas frente a retos en el 75 al 92% de las aves para el caso de vacunas recombinantes contra laringotraqueitis infecciosa aviar 91 y del 70% cuando se emplearon vacunas recombinantes para el control de la enfermedad de Newcastle 80.

El uso de este tipo de vacunas se ha extendido en el pais, sin embargo aun se desconocen algunos aspectos relacionados con la tecnologia utilizada y con los resultados de estos productos en campo. Por lo anterior, el objetivo de esta revision de literatura es describir los principios y las aplicaciones de las vacunas de ADN recombinante disenadas para el control de las enfermedades infecciosas en avicultura, haciendo enfasis en los estudios realizados con los virus de Gumboro, Newcastle y laringotraqueitis infecciosa aviar.

Principios de la vacunacion en avicultura

Para contrarrestar y disminuir la morbilidad y la mortalidad de las diferentes enfermedades infecciosas, existen diferentes metodos de intervencion dentro de los cuales uno de los mas exitosos ha sido la vacunacion. Esta se fundamenta en estimular la respuesta inmune natural que genera un microorganismo dentro del hospedero. La inoculacion de estos agentes no debe causar enfermedad pero debe ser potente y eficaz. El conocimiento inmunologico es la base para la produccion de diferentes tipos de vacunas, cada una con ventajas y desventajas ante los patogenos que combate (98). Convencionalmente se consideraban vacunas aquellos biologicos elaborados a partir de patogenos atenuados (convertido en no patogenicos por pasajes simultaneos en huevos embrionados o cultivo de tejidos) o patogenos muertos (inactivados por calor o por desnaturalizacion quimica).

Las vacunas con agentes muertos son las menos utilizadas en el control de las enfermedades de origen viral en avicultura, ya que presentan una menor efectividad haciendose necesarias dosis repetidas para estimular correctamente al sistema inmune, a pesar de su alto nivel de seguridad (entendida como la probabilidad de generar enfermedad por la vacunacion). Sin embargo, las vacunas atenuadas tambien pueden presentar desventajas como el riesgo de revertir su patogenicidad, especialmente en individuos con compromiso inmunologico (97, 91, 98).

Este evento se ha relacionado con la restitucion de las mutaciones generadas durante el proceso de atenuacion del virus parental, lo cual puede resultar en cambios del genotipo mutante al original (18). Tambien se ha reportado la reversion de la virulencia de cepas vacunales durante el proceso de replicacion en el individuo o durante la diseminacion del virus en la poblacion vacunada (59). En el caso de los virus ARN se reportan tasas altas de mutacion por ciclo de replicacion asociadas a la ARN polimerasa dependiente de ARN, lo cual se evidencio en los virus causantes de la estomatitis vesicular (24) y la enfermedad de Gumboro (79).

En la industria avicola se hacen necesarios metodos efectivos de vacunacion masiva con el fin de atenuar o disminuir los efectos de un patogeno especifico que pueda afectar la produccion de un lote de aves. Las vacunas con virus atenuados son las mas utilizadas en el sector, ya que presentan la versatilidad de diferentes medios de administracion individual o colectiva (97). Entre los metodos de administracion individual se encuentran la gota ocular o nasal, la administracion oral y la inyeccion subcutanea, intramuscular o in ovo. En los metodos masivos se destacan la administracion en el agua de bebida y la aplicacion por aspersion (spray) (97).

Como se menciono anteriormente, uno de los ultimos avances en el campo de la vacunacion en medicina humana y veterinaria corresponde al diseno de las vacunas de ADN recombinante. Este tipo de agentes inmunizantes presenta algunas de las caracteristicas que son deseadas en un inmunogeno; entre estas se destacan la generacion de memoria inmunologica y la produccion de inmunidad adaptativa. Otra caracteristica relevante es la seguridad, debido a que no producen la enfermedad y los efectos secundarios generados por la vacunacion son minimos. Tambien esta la eficacia, debido a que protegen al individuo contra la enfermedad producida por el patogeno especifico, y la practicidad ya que el costo de la vacuna es relativamente asequible, su estabilidad durante el almacenamiento es mayor y son consideradas de facil administracion (26). En resumen, las vacunas de ADN recombinante tienen la ventaja de la seguridad de las vacunas inactivadas combinada con la eficacia de los inmunogenos vivos atenuados (21). Con estas vacunas tambien se han probado otras formas de inmunizacion como la vacunacion in ovo, especialmente para el control de las enfermedades de Marek y Gumboro, administrando el agente en huevos fertiles a traves de la membrana corioalantoidea entre los dias 17 y 19 (80, 92, 98).

A nivel mundial hasta el 2005, este tipo de vacunas solo estaba autorizado para prevenir el virus del oeste del Nilo en los caballos y el virus de la necrosis hematopoyetica infecciosa del salmon (89). Hoy en dia se encuentran diferentes estudios enfocados a las vacunas de ADN recombinante en varias areas y sobre diferentes enfermedades infecciosas. En avicultura se destaca su utilidad en la prevencion y el control de los virus de la enfermedad de Gumboro, Newcastle y laringotraqueitis infecciosa aviar (89, 98).

Sin embargo, estos estudios demuestran que los resultados para el control de patogenos son prometedores mas no concluyentes, debido a que existen otros factores que pueden influenciar su efectividad. Lo anterior, justifica la realizacion de estudios que validen la forma como se realiza la evaluacion de la eficiencia de este tipo de vacunas, debido a que cada inmunogeno recombinante posee una estructura diferente, asi como una composicion variable de los adyuvantes y diversas rutas de administracion generando una respuesta inmune la cual no es predecible facilmente (85). Entre los factores que pueden influenciar su efectividad tambien se destaca el estado inmunologico de las aves en casos que exista inmunidad previa contra el vector viral, fallas humanas en la administracion debido a que este tipo de vacunas comunmente se aplican in ovo mediante procedimientos intensivos y el diseno del inmunogeno puesto que se reportan problemas de seguridad relacionados con la replicacion del vector viral que pueden generar respuestas inmunologicas potentes similares al genotipo de origen y eventos de recombinacion y/o reversion de la virulencia (47).

Vacunas de ADN recombinante y su aplicacion en la industria avicola

Las vacunas de ADN recombinante estan compuestas por organismos vivos los cuales han sido modificados, es decir los genes virulentos han sido eliminados y reemplazados por genes de otros patogenos contra los cuales se desea inmunizar. Este tipo de vacunacion se conoce tambien como "carrier system" debido al uso de un virus o una bacteria para llevar o transportar el antigeno del cual se quiere generar inmunidad (89,97). El proceso para la realizacion de las vacunas de ADN recombinante consiste en una amplificacion inicial del genoma del agente infeccioso a traves de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) con el reconocimiento del gen que codifica la proteina inmunogenica, luego este fragmento se inserta dentro de un plasmido eucariota o en un virus apropiado para la expresion, la replicacion o el clonaje de esta proteina en una bacteria. Por ultimo se realiza la purificacion de los plasmidos con las proteinas, las cuales se inoculan y generan una respuesta inmune al tener contacto con las celulas del hospedero (Figura 5) (81,89,94).

Cada microorganismo usado como vector para la creacion de vacunas de ADN recombinante posee caracteristicas especificas que le permiten comportarse de diferentes maneras dentro del organismo. El herpesvirus de pavo (HVT por sus siglas en ingles Herpesvirus of Turkey) es uno de los virus mas utilizados para la elaboracion de estos biologicos, teniendo como particularidad la latencia y la habilidad de reactivarse sin importar la respuesta adaptativa inmunologica especifica del hospedero. Asi mismo todos los virus de la familia Herpesviridae poseen un genoma de tamano grande, con la opcion de ampliarse mediante la inclusion de fragmentos de otros agentes. Adicionalmente estos virus poseen genes de virulencia que no son esenciales para su replicacion in vitro e in vivo, los cuales son importantes para convertirlos en potenciales vectores para las vacunas (11,12). Es por esto que el HVT se replica constantemente expresando el antigeno y re-estimulando al sistema inmunitario (98).

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Entre las ventajas que presenta este tipo de vacunacion se encuentran:

1. La disminucion de la presentacion de reacciones posvacunales. Lo anterior se evidencio posterior a la aplicacion de una vacuna recombinante contra la enfermedad de Gumboro, la cual no genero lesiones en la bursa de Fabricio en comparacion con las vacunas vivas atenuadas (44).

2. La disminucion en la interferencia inmunologica que se puede presentar al inocular otras vacunas; esta es una consecuencia de la liberacion constante del virus vacunal cuando se usan vectores como el HVT.

En algunos casos, se evita la necesidad de revacunacion (97).

3. La induccion de respuestas de tipo humoral y celular con la produccion sistemica de celulas T y celulas CD4 y CD8 (47). En vectores virales como Vaccinia y poxvirus la respuesta inmune es de tipo celular con la produccion LT citotoxicos (LTc) y ayudadores (LTh). En el caso del Adenovirus se presenta respuesta inmune de tipo humoral con formacion de anticuerpos y celular con LTh; los Alfavirus y Poliovirus estimulan la produccion de anticuerpos y LTc, mientras que los herpesvirus solo estimulan la generacion de anticuerpos (87).

Dentro de las desventajas de este tipo de vacunas se incluyen:

1. Una menor proteccion inicial, por tener una respuesta inmunologica lenta adicional a una duracion de inmunidad desconocida.

2. En algunos casos, biologicos generados contra la laringotraqueitis infecciosa aviar/viruela, pueden llegar a causar neumonia en los animales a los cuales se les administra la vacuna (97).

3. La respuesta inmune de tipo adaptativo puede reducir o bloquear la generacion de la respuesta contra el antigeno vacunal (47).

En el ambito mundial, existen diversos grupos de investigacion que se dedican al estudio de las aplicaciones y la eficacia de las vacunas recombinantes elaboradas con diferentes cepas del mismo patogeno. Las pruebas realizadas en Australia, Brasil, China, Europa, Norte America y otros lugares del mundo demuestran las ventajas e intentan encontrar los posibles efectos adversos que estos nuevos biologicos pueden causar en los individuos en los que se administran. Los resultados de estos estudios han permitido el desarrollo de diversas combinaciones de vectores y agentes para la generacion de vacunas de ADN recombinante eficaces y seguras. El estudio de las vacunas basadas en ADN ha evolucionado desde la vacuna contra la hepatitis B creada con plasma humano en 1976 hasta lograr la disponibilidad comercial de vacunas recombinantes seguras en vectores como los Poxvirus (89, 89, 97).

En avicultura algunas de estas mezclas geneticas se han disenado para la prevencion de diferentes enfermedades como la enfermedad de Gumboro, la laringotraqueitis infecciosa aviar y la enfermedad de Newcastle. Igualmente se han desarrollado vacunas de ADN recombinante para el control de dos agentes etiologicos en un mismo biologico como es el caso de la vacuna de ADN recombinante para la influenza aviar combinada con la laringotraqueitis infecciosa aviar, y la enfermedad de Marek junto a la influenza aviar. Estas vacunas han sido disenadas en agentes replicadores donde los mas comunes son Salmonella enterica, el adenovirus y el HVT (80,89, 96).

La entrada de estos biologicos a Colombia fue autorizada despues de una extensa revision por los entes de control. Luego de pasar las pruebas de bioseguridad comprobando que tienen minimas probabilidades de reversion a un estado virulento del agente, se les permitio la entrada y posterior comercializacion previa solicitud de las companias farmaceuticas y de biologicos solicitantes (89,90). Actualmente Colombia cuenta con la comercializacion de ocho vacunas recombinantes, de las cuales tres son para uso avicola y estan indicadas en el control de las enfermedades de Gumboro, laringotraqueitis infecciosa aviar, Newcastle y Marek usando como vector el HVT 81. A continuacion se realiza una descripcion de tres de estos agentes infecciosos y del uso de vacunas de ADN recombiante para la prevencion de los mismos.

Enfermedad de Gumboro

La enfermedad de Gumboro (IBD por sus siglas en ingles Infectious BursalDisease) es causada por un virus de la familia Birnaviridae, genero Avibirnavirus el cual posee dos serotipos (1 y 2); los miembros de esta familia poseen un genoma que consiste en dos segmentos de una doble cadena de RNA (2, 80, 81). Es un virion sin envoltura (desnudo) con nucleocapside de simetria icosaedrica y un diametro que varia entre 55--5 nm (1, 84), caracteristicas que confieren resistencia al medio ambiente y una alta variabilidad genetica y antigenica del virus (84). El genoma viral posee dos segmentos (A y B); el segmento A tiene 2 marcos de lectura abierta (ORF), codificando el primer fragmento para las proteinas estructurales entre las que se encuentran las proteinas virales VP2 (por sus siglas en ingles viral protein), VP3, VP4 y otras proteinas precursoras como la VPX, y el segundo para la proteina VP5 (84, 81). La VP2 se reconoce como la principal proteina antigenica del virus (89, 94).

Este agente es de gran importancia economica para la industria avicola, debido a que afecta al sistema inmunologico de las aves generando una tasa alta de mortalidad causada por infecciones secundarias (90). El virus de la enfermedad de Gumboro (IBDV por sus siglas en ingles Infectious Bursal Disease Virus) tiene tropismo por linfocitos B, principalmente en la bursa de Fabricio, lo cual genera un estado de inmunosupresion predisponiendo al hospedero a infecciones por microorganismos oportunistas y a respuestas deficientes ante los planes profilacticos vacunales (89, 89, 90). La infeccion con el IBDV en aves menores de tres semanas de edad puede causar dano severo en la bursa de Fabricio,, caracterizado por la deplecion de celulas B que expresan IgM lo cual afecta la respuesta primaria de anticuerpos. En pollitos de un dia de edad se reporto la disminucion de celulas B en el bazo 83. La bursa de Fabricio puede regenerarse por proliferacion de linfocitos, en contraste con la respuesta primaria de anticuerpos la cual permanece disminuida durante 7 semanas post infeccion y es dependiente de la edad de las aves y la virulencia de la cepa (93). Se ha reportado que la regeneracion de este organo se relaciona con el desarrollo de foliculos formados despues de la recuperacion del ave (83).

Desde hace mas de treinta anos se han utilizado las vacunas vivas atenuadas para el control del IBDV (89, 98, 98). Sin embargo, el surgimiento de nuevas cepas del agente con mayor potencial patogenico como lo son las de tipo muy virulento (vv por sus siglas en ingles very virulent), descubiertas en Europa y Reino Unido en 1987, sumado a la continua aparicion de cepas variantes no han permitido una proteccion completa ante los brotes de campo con las vacunas convencionales permitiendo la introduccion y el uso de las vacunas de ADN recombinante en la practica (84,89). En Colombia, la enfermedad de Gumboro es considerada endemica, presentandose brotes con cepas de tipo muy virulento (vvIBDV), las cuales pueden generar mortalidades entre el 60 y 100% (10,68,78). Norte de Santander ha sido una de las regiones mas afectadas por cepas muy virulentas, donde el laboratorio regional del ICA reporto 26 casos de virus muy virulento en el ano 2003 y 25 casos en el ano 2004, con una mortalidad promedio del 17 y 14% respectivamente (60,68).

Para el diseno de las vacunas de ADN recombinante para el control del IBDV se ha utilizado de forma comun el HVT como vector de la proteina VP2 (80, 90 84) Tambien se ha utilizado el poxvirus como vector de la misma, desarrollando la vacuna de ADN recombinante fpIBD1 (84). En estudios realizados por Villegas et al. en 2008, se utilizo la levadura Pichia pastoris como vector de la proteina VP2 obtenida de la cepa Edgar de la enfermedad de Gumboro. En este trabajo se emplearon aves libres de patogenos especificos (SPF por sus siglas en ingles Specific Patogen Free) las cuales fueron vacunadas con diferentes productos y desafiadas con la cepa homologa (cepa Edgar), para evaluar la proteccion desarrollada frente al agente. En el grupo inmunizado con la vacuna de ADN recombinante no se observo morbilidad o mortalidad, obteniendo un mejor resultado comparada con el 30% de mortalidad obtenido en las aves vacunadas con la region hipervariable de la proteina (hvVP2) y con el 90% de mortalidad observado en los controles no vacunados y desafiados (80, 94).

En otra investigacion en aves SPF se comprobo la efectividad de otra vacuna de ADN recombinante utilizando el HVT como vector de la VP2 proveniente de una cepa estandar del IBDV (cepa Faragher 52/70).

Para la evaluacion de la efectividad de este biologico, se analizaron los valores de la proporcion entre el peso corporal y el peso de la bursa, y los hallazgos histopatologicos en los principales organos linfoides. Despues de la inmunizacion, las aves fueron infectadas con la variante E del IBDV. Las aves vacunadas demostraron una adecuada proteccion e inmunocompetencia por los indices de la bursa significativamente mayores a los del grupo control, indicando que la infeccion no indujo danos tisulares ni involucion de la bolsa de Fabricio. Adicionalmente no se observaron signos clinicos postdesafio en las aves que se vacunaron a los 18 y 28 dias de edad. Estos resultados demuestran que incluso usando una vacuna recombinante con un segmento del genoma (VP2) que pertenece a una cepa estandar del patogeno, se confiere proteccion contra variantes especificas de la enfermedad (variante E) (97). En el estudio realizado por Villegas et al. (2008) se obtuvieron resultados similares a los de las investigaciones realizadas por Perozo et al. (2009), donde el grupo de aves vacunadas con la proteina VP2 completa alcanzaron indices de la bursa significantemente mayores que las aves no vacunadas o vacunadas con la porcion hipervariable hvVP2 del agente (94).

En el estudio realizado por Le Gros et al. en el 2009 se probo la efectividad de las vacunas de ADN recombinante para el control de la enfermedad de Gumboro utilizando dos grupos de pollos de engorde. En el primer grupo se administro una vacuna recombinante via subcutanea a pollitos de un dia, mientras que en el segundo se suministro una vacuna viva atenuada a los 17 y 24 dias de edad via oral. En los dias 26 y 45 se realizo la titulacion de anticuerpos contra el virus de la enfermedad de Gumboro mediante el uso de dos kits comerciales de ELISA. En los dias seleccionados, los titulos de anticuerpos en el primer grupo fueron significativamente mayores a los del segundo (98).

Asi mismo se ha evaluado la eficacia de la proteina VP2 expresada en Escherichia coli para proteger del IBDV En un ensayo realizado por Omar et al. en el 2006 solo el 10% de los pollos que no recibieron ninguna medida preventiva sobrevivio a la exposicion al agente. Este estudio tambien comparo diferentes tipos de inmunizacion para conocer los porcentajes de supervivencia de los individuos, obteniendo como resultado que la totalidad de las aves inmunizadas con IBDV inactivado con calor sobrevivio, el 57% de los animales vacunados con 150 pg de proteina VP2 cruda lograron combatir la infeccion y el menor porcentaje de sobrevivencia lo obtuvo el grupo vacunado con proteina recombinante de E. coli con una efectividad reportada del 28% (92). De la misma forma algunas pruebas realizadas previamente sobre la proteina VP2 en vacunas recombinantes usando como vector E. coli, confirman la capacidad de inducir sintesis de anticuerpos contra IBDV. Sin embargo, estos anticuerpos generados por la inmunizacion reaccionan especificamente con partes virales desnaturalizadas y no contra el virus completo o intacto (92,98).

A pesar de que la proteina virica VP2 del IBDV ha sido expresada en diferentes agentes (E. coli, virus de la viruela aviar o poxvirus, vaculovirus, levaduras, virus de la enfermedad de Marek, entre otros), aun no existe una vacuna recombinante lider en el ambito comercial 81, (84). Esto se debe posiblemente a su efectividad variable, lo cual hace necesario la aplicacion en conjunto con vacunas vivas atenuadas.

Laringotraqueitis Infecciosa Aviar

El virus de la Laringotraqueitis Infecciosa Aviar (ILTV por sus siglas en ingles Infectious Laryngotracheitis Virus) pertenece al orden Herpesvirales, familia Herpesviridae, subfamilia Alphaherpesvirinae, genero Iltovirus, especie Gallid Herpesvirus I, el cual afecta a ponedoras y pollos de engorde principalmente, causandoles graves afecciones respiratorias que pueden terminar con la muerte (9, 97, 81). La fase inicial de la enfermedad dura de 1 a 2 semanas donde se pueden observar problemas con el crecimiento, asi como en la produccion de huevo o signos relacionados a las vias respiratorias como el jadeo, la tos, la expectoracion de moco con sangre y otros como la depresion y la conjuntivitis. Luego de esta fase el hospedero pasa a ser un portador latente asintomatico (90,97).

El genoma del virus esta conformado por una doble cadena lineal de ADN con dos regiones unicas ([U.sub.L] y [U.sub.S]) y dos secuencias repetidas inversas (IR y TR). Estas estructuras permiten la formacion de dos isomeros del genoma con diferente orientacion; la region [U.sub.S] se ha encontrado y reconocido en diferentes alphaherpesvirus. Adicionalmente la codificacion y la sintesis de glicoproteinas homologas como gB, gC, gH, gJ, gN, gM, gD, gE, gI, gG, gK y gL ocurren en la region especifica [U.sub.S] de genes conservados del ILTV (81).

Dentro de las vacunas mas usadas para la inmunizacion en granjas, se encuentran las vacunas con virus vivo atenuado. Estos preparados son altamente eficaces pero poco seguros, debido al potencial de latencia del ILTV, por lo que se han asociado con una serie de efectos adversos, como es la diseminacion de cepas vacunales a galpones no vacunados (virulencia residual). Para evitar estas posibles complicaciones con las vacunas convencionales, se ha propuesto la eliminacion de la glicoproteina B (gB) en los virus atenuados, ya que se ha identificado como la principal proteina con potencial de virulencia expresada luego de la inmunizacion. Otras proteinas que se expresan con la administracion de vacunas vivas atenuadas son gJ, gD, gI y gN (81, 84, 97).

En cuanto a las vacunas de ADN recombinante desarrolladas para el control de esta enfermedad, se ha utilizado comunmente como vector el HVT, con el cual la accion de la respuesta inmune celular y humoral es generada por la glicoproteina B (gB) altamente conservadas en los herpesvirus, otorgando una mejor respuesta antigenica contra el gen de ILTV insertado en este vector. Tambien se han generado mezclas de gB e interleucina--18 de pollo con el genoma del ILTV en mezclas conocidas como vectores de expresion bicistronicos para aumentar la respuesta de celulas T, siendo de mayor eficiencia por promover una respuesta inmunologica sinergica (97).

Entre las ventajas del uso de inmunogenos recombinantes en el control del ILTV se encuentran la expresion simultanea de dos genes de glicoproteinas (gI y gD), dando como resultado una proteccion del 97% de las aves vacunadas con una sola dosis administrada via in ovo (97). Tambien se ha demostrado que las vacunas recombinantes no afectan el rendimiento de las aves, no causan reacciones posvacunales y no hay posibilidad de reversion de la virulencia. Adicionalmente estas vacunas pueden ser administradas in ovo a los 18 dias en los embriones o al nacimiento por via subcutanea 80, 97.

En un estudio realizado para evaluar la forma de administracion de las vacunas de ADN recombinante para contrarrestar el ILTV se disenaron tres experimentos con una vacuna que usa como vector el HVT y que contiene las glicoproteinas I y D; en el experimento 1 se utilizaron aves SPF a las cuales se les inoculo via in ovo el biologico; en el experimento 2 la aplicacion de la vacuna se realizo el primer dia de vida de las aves SPF, por ultimo en el experimento tres se siguio el procedimiento de vacunacion de la misma manera que en el grupo experimental anterior pero con aves comerciales. Los resultados que presento esta investigacion fueron variables, debido a que la deteccion del ADN de la vacuna (rHVT-LT) en tejidos de los animales sacrificados estuvo entre el 80 y 100% en el caso de las aves de los experimentos 1 y 2, a diferencia del experimento tres en el cual las muestras positivas no supero el 50% pudiendose atribuir a la interaccion con anticuerpos maternos (97, 81).

En otro estudio se conformaron cuatro grupos experimentales cada uno con 10 aves SPF y 20 aves comerciales, los cuales recibieron los siguientes tratamientos: grupo 1 no vacunado (grupo control), grupo 2 vacunados con rFPV-ILTVgB (vacuna recombinante con vector poxvirus), grupo 3 inmunizados con vacuna comercial contra ILTV y grupo 4 vacunados con FPV 017 (cepa vacunal de viruela aviar). De la semana 1 a la 6 las aves no presentaron signos clinicos respiratorios. A la semana 6 todos los grupos fueron desafiados con una dosis letal de ILTV, encontrandose una mortalidad del 100% en las aves SPF sin importar el biologico usado, aunque en los animales comerciales la efectividad del inoculo comercial fue de 85% y de la vacuna vectorizada del 100% (90).

Asimismo, en otras investigaciones se compararon dos vacunas vivas atenuadas aplicadas a dosis completa con una vacuna vectorizada administrada a dosis media en aves comerciales. Las vacunas tradicionales se administraron a los 14 dias de edad por medio de gota ocular y la vacuna recombinante se aplico via in ovo y subcutanea al nacimiento. Los animales fueron desafiados con el ILTV (cepa virulenta aislada de campo 63140) a los 35 y 57 dias de edad. Se analizaron diferentes variables observandose que la ganancia de peso diario fue menor en los animales vacunados in ovo en comparacion con las aves inmunizados tradicionalmente, asi como los anticuerpos especificos contra la proteina gI y gB fueron mejor expresados en los animales inmunizados con vacunas de ADN (75-92%) en comparacion con los animales vacunados tradicionalmente (8%) (91). Los resultados a pesar de ser positivos exigen un mayor analisis y posiblemente un mayor numero de estudios que evaluen los metodos de inmunizacion y los planes vacunales con los cuales se optimice el uso de este tipo de biologicos.

Enfermedad de Newcastle

El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV por sus siglas en ingles Newcastle Disease Virus) posee un genoma RNA y pertenece al orden Mononegavirales, familia Paramyxoviridae, subfamilia Paramyxovirinae, genero Avulavirus. El NDV contiene seis genes principales los cuales codifican para las proteinas estructurales y dos proteinas no estructurales W y V generadas por la modificacion transcripcional de RNAm que codifica para una proteina estructural; es un virus de morfologia casi esferica con un diametro entre 100 a 500 nm en el cual en ocasiones es posible observar particulas de filamentos con un tamano cercano a los 100 nm. El virion esta envuelto con una membrana de bicapa lipidica integrada con dos glicoproteinas diferentes: una hemaglutinina--neuroaminidasa (HN) la cual posee actividades tanto de hemaglutinina (HA) a causa de la absorcion del virus por receptores especificos en los globulos rojos (permite identificacion del agente), como de neuroaminidasa (NA) generada por la hidrolisis de la union entre los acidos neuroaminicos en el hospedero.

La segunda glicoproteina es la de fusion (F) encargada de determinar la virulencia del agente (cepas de alta y baja virulencia). Luego de la membrana lipidica esta ubicada una proteina relativamente hidrofoba y no glicosilada llamada de matriz (M) la cual desempena un papel importante en el ensamblaje del virus mediante la interaccion con la nucleocapside, la bicapa lipidica y las regiones de las glicoproteinas de superficie que se encuentran en la parte interna de la membrana (96). Las proteinas no estructurales pueden resultar de una diferencia en la iniciacion o la transcripcion del gen P del RNAm. Segun la severidad de la presentacion, la enfermedad se clasifica en 3 patotipos: lentogenica o respiratoria, mesogenica y velogenica (viscerotropico-Forma Doyle; Neurotropico--Forma Beach) (1, 88).

Este virus es de importancia economica en la avicultura mundial por su elevada morbilidad y mortalidad, las bajas tasas en la produccion asi como por los altos costos que representa su prevencion y tratamiento derivado de las enfermedades concomitantes que se pueden presentar (80), por estas razones se requiere un estricto control a traves de la vacunacion o el establecimiento de protocolos de cuarentena al presentarse los brotes (89). La enfermedad se ha detectado en todo el mundo, aunque actualmente esta controlada en aves domesticas en paises como Canada, Estados Unidos y parte de Europa occidental, con una continua presentacion en partes de Africa, Asia y Sudamerica (90). No obstante, segun esta misma fuente, paises como Chile, Argentina y Brasil no presentan brotes de Newcastle al menos desde enero de 2005. Las cepas velogenicas son endemicas en Asia, Medio Oriente, Africa, America Central, America del Sur y algunas regiones de Mexico, en contraste con las cepas virulentas que se encuentran en EEUU y Canada las cuales estan endemicas solo en animales silvestres. Asi mismo las cepas lentogenicas se encuentran en aves de corral en todo el mundo, al igual que las cepas mesogenicas siendo poco frecuentes (98). En Colombia, los primeros casos de la enfermedad de Newcastle fueron reportados en junio de 1950, desde entonces la enfermedad se considera endemica, presentando focos que alcanzan un total de 394 casos en todo el territorio nacional desde el 2006 hasta el 2009 (80, 89). En el 2008 el Congreso de Colombia declaro el control y la erradicacion del NDV como prioridad sanitaria, convirtiendose en una patologia de interes social-nacional (80).

La vacunacion contra la enfermedad de Newcastle ha tenido un impacto positivo desde 1940, por lo que se considera la primera medida para el control y la erradicacion de la enfermedad. La mayoria de las vacunas se elaboran con las cepas lentogenicas (LaSota o B1) o mesogenicas (Beaudette o VG/GA) producidas en huevos SPF. En pollos de engorde frecuentemente se administra una vacuna antes de que el individuo sea expuesto a una cepa de campo, debido a que estas pueden ser mas agresivas y los titulos de anticuerpos que se generan pueden interferir con la inmunidad que provee la vacuna (7, 90). En Colombia existen tres vacunas de ADN recombinante contra la enfermedad de Newcastle aprobadas para la administracion en aves comerciales (81).

A lo largo de los anos se han realizado varios estudios con el fin de conocer las ventajas y las desventajas del uso de las vacunas de ADN recombinante contra el NDV (97, 98), (80, 81). En un estudio en el que se administro una vacuna de ADN recombinante disenada con el virus de viruela como vector, se observo que el 90% de los pollos que fueron inmunizados obtuvieron inmunidad protectiva; adicionalmente se establecio que la via intraocular fue la mejor alternativa para la administracion de este tipo de vacunas (7, 81, 89).

En otro estudio en pollos de engorde, se emplearon los virus de la influenza aviar y de la enfermedad de Newcastle para la creacion de un biologico vectorizado. Luego de una inmunizacion con este biologico se desafiaron las aves con virus de alta patogenicidad (influenza aviar) y de patotipo velogenico viscerotropico (enfermedad de Newcastle) conociendo previamente el nivel de los anticuerpos maternos. Luego del periodo de evaluacion se obtuvo como resultado la proteccion del 100% de las aves vacunados con rNDV-LS/AI-H5 (90, 82).

En otro estudio se diseno una vacuna recombinante a partir de la cepa LaSota de la enfermedad de Newcastle como vector para la expresion de la glicoproteina (G) del subgrupo C del metapneumovirus (MPV por sus siglas en ingles metapneumovirus--aMPV-C), generando asi una vacuna bivalente. La expresion de la proteina G se detecto por inmunofluorescencia en celulas infectadas in vitro. A los animales en los que se probo esta vacuna, se les administro una dosis unica de la vacuna rLS/aMPV-C G. Los resultados demostraron que la cepa LaSota del NDV es un vector seguro y eficaz para la expresion de la proteina G del aMPV-C. De igual forma luego de un desafio con un patotipo velogenico de la enfermedad de Newcastle se comprobo la proteccion completa contra el NDV y una proteccion parcial contra aMPV-C induciendo respuestas inmunes moderados pero especificas contra estos agentes (97; 99).

Rauw et al. en el 2010 no solo experimento con vacunas recombinantes, sino que propuso como coadyuvante las vacunas vivas atenuadas. El experimento se realizo con cuatro grupos organizados asi: un grupo fue inmunizado con la vacuna recombinante in ovo y el otro grupo se quedo sin tratamiento (grupo control). En el dia de la eclosion cada grupo se dividio en dos, los grupos 1 y 2 fueron los originalmente no tratados mientras que los grupos 3 y 4 fueron los vacunados via in ovo. A las aves de los grupos 2 y 4 se les administro una vacuna viva atenuada contra NDV via oculo-nasal. Luego del desafio con la cepa velogenica viscerotropica Chimalhuacan del NDV, los resultados mostraron que las aves no inmunizadas murieron al dia 6, mientras que las aves vacunadas con la combinacion rHVT-ND/vacuna atenuada estaban totalmente protegidas, sin evidenciar morbilidad ni mortalidad. El grupo inmunizado solo con la vacuna viva atenuada tuvo un porcentaje de sobrevivencia entre el 80 y el 90% mientras que los animales que recibieron el rHVT-ND solo el 70% obtuvo proteccion. A pesar de los resultados variables de las investigaciones que utilizan las vacunas de ADN recombinante para el control del NDV, es necesario realizar nuevos estudios que permitan evaluar la eficacia de este tipo de vacunas en el sector avicola.

Conclusiones

La avicultura es una industria de crecimiento constante, el cual esta sujeto a dos aspectos de importancia: la inocuidad de los productos avicolas y la sanidad de la produccion aviar. Uno de los principales factores que frena el desarrollo del sector son las perdidas economicas por brotes de enfermedades infecciosas, para las cuales entre las estrategias mas adecuadas para su control y prevencion se encuentran las medidas de bioseguridad y la vacunacion. Con la evolucion de las areas del conocimiento y sus diferentes aplicaciones, se han desarrollado nuevas tecnicas para la creacion y el mejoramiento de las vacunas disponibles en el mercado como las recombinantes, teniendo como meta una mayor eficacia, seguridad y practicidad. Actualmente Colombia cuenta con la comercializacion de ocho vacunas recombinantes, de las cuales cuatro son para uso avicola en el control de las enfermedades de Gumboro, laringotraqueitis infecciosa aviar, Newcastle y Marek. Aunque estos inmunogenos tienen la ventaja de la seguridad de las vacunas inactivadas combinada con la eficacia de las vacunas vivas atenuadas, requieren de estudios futuros que permitan evaluar y cuantificar sus ventajas y desventajas especialmente en el ambito colombiano.

Es necesario tener en cuenta que estos nuevos desarrollos en tecnologias vacunales, deben acompanarse de una infraestructura diagnostica que responda a la posibilidad de evaluar la efectividad de este tipo de biologicos debido a que en diversos contextos el estado inmunitario de los lotes no se evalua a satisfaccion, las coberturas vacunales son diversas y el concepto de riesgo no es claro. Luego del analisis de la informacion, se concluye que las vacunas recombinantes se proyectan para ofrecer una alta efectividad, sin embargo se siguen presentando incognitas al momento de usarlas, debido a que existen otros factores como la respuesta inmune y el diseno mismo de las vacunas, los cuales pueden influenciar el comportamiento y la efectividad de las mismas. Por ultimo, se hace evidente la necesidad de continuar la investigacion en el area avicola, para optimizar los metodos e inoculos que se usan para la prevencion de enfermedades infecciosas teniendo en cuenta los retos de campo, la normatividad del pais, los requerimientos de la industria y los costos de produccion.

Agradecimientos

Los autores agradecen al estudiante Victor Valencia Castano y a los Doctores Jaime Romero, Efrain Benavides y Diego Soler del Programa de Medicina Veterinaria de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de La Salle por el apoyo en el marco del proyecto titulado: "Evaluacion de la vacunacion como estrategia para el control de las enfermedades virales en explotaciones avicolas" financiado por Colciencias (Codigo 1243-521-28381).

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Andres Felipe Santander Torres [1], MV, MSc(c); Diana Claudia Marcela Alvarez Espejo [2], MV, MSc; Javier Andres Jaimes-Olaya [3], MV, MSc, MBA; Arlen Patricia Gomez Ramirez [4], MV, PhD; Luis Carlos Villamil Jimenez [5] *, MV, MSc, PhD.

[1] Estudiante Maestria en Ciencias Veterinarias. Grupo de Investigacion Epidemiologia y Salud Publica. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de La Salle. Bogota, Colombia. [2] Investigadora. Grupo de Investigacion Epidemiologia y Salud Publica. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de La Salle. Bogota, Colombia. [3] Docente asistente, Programa de Medicina Veterinaria, Grupo de Investigacion Epidemiologia y Salud Publica. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de La Salle. Bogota, Colombia. [4] Docente asociada, Programa de Medicina Veterinaria, Grupo de Investigacion Epidemiologia y Salud Publica. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de La Salle. Bogota, Colombia. [5] * Docente titular, Programa de Medicina Veterinaria, Grupo de Investigacion Epidemiologia y Salud Publica. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de La Salle, Cr. 7 No. 172-85 Bogota, Colombia.

Email: luvillamil@unisalle.edu.co

* Autor para correspondencia: Luis Carlos Villamil Jimenez. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de La Salle, Cr. 7 No. 172-85 Bogota, Colombia. E-mail: luvillamil@unisalle.edu.co

*** Para citar este articulo: Santander Torres AF, Alvarez Espejo DCM, Jaimes-Olaya JA, Gomez Ramirez AP, Villamil Jimenez LC. Diseno de vacunas recombinantes en las enfermedades de Gumboro, Newcastle y Laringotraqueitis Infecciosa Aviar. Rev CES Med Zootec. 2014; Vol 9(2): 262-280.

(Recibido: 22 de enero, 2014; aceptado: 10 de octubre, 2014)
Figura 4. Produccion de carnicos en Colombia (miles de toneladas) en
el ano 2010.

Carne Caprino   7
Carne Caballo   6
Carne Cerdo     180
Carne Conejo    4
Carne Ovino     7
Carne Vacuno    930
Carne Pollo     1.000

Fuente: adaptado de Faostat (2012).

Nota: Tabla derivada de grafico segmentado
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Author:Santander Torres, Andres Felipe; Marcela Alvarez Espejo, Diana Felipe; Andres Jaimes-Olaya, Javier;
Publication:Revista CES Medicina Veterinaria y Zootecnia
Date:Jul 1, 2014
Words:11072
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