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Diseno de una prueba diagnostica casera para la deteccion de anticuerpos tipo IgG contra el virus de la hepatitis C: incorporacion de la proteina de envoltura E2 y no estructural 2 (NS2).

Design of an in-house diagnostic test for IgG antibodies against hepatitis C virus detection: Incorporation of envelope protein E2 and non-structural protein 2 (NS2).

INTRODUCCION

El virus de la hepatitis C (VHC) es un ARN virus con tropismo por el higado (1). Se estima que, a nivel mundial, alrededor de 170 millones de personas muestran evidencia de infeccion cronica por el VHC y que anualmente alrededor de 700.000 personas mueren a consecuencia de la infeccion por el VHC (2). Los sintomas durante la infeccion aguda son usualmente leves o puede ser asintomatica, por lo que comunmente pasa desapercibida y no es diagnosticada durante las fases iniciales de la infeccion. La eliminacion espontanea o control de la infeccion ocurre solo en un 15-45% de los individuos infectados durante los 6 primeros meses, el resto de los individuos expuestos al virus, progresan hacia una infeccion cronica (3, 4). La infeccion cronica a su vez puede evolucionar hacia la fibrosis, cirrosis y el carcinoma hepatocelular (5). Las principales vias de trasmision son las transfusiones sanguineas, hemodialisis, uso de drogas endovenosas por compartir jeringas contaminadas, hombres que tiene relaciones sexuales con hombres (6), la ruta materno-fetal (7) y la cosmetica tal como el uso de tatuajes (8). La seroprevalencia a nivel mundial se ha clasificado en regiones de alta (>5%), mediana (2-4%) y baja prevalencia (<2%). Las zonas de alta prevalencia incluyen: Egipto 4,4-15,0% (9), Gabon 4,9-11,2% (10), entre otros paises de bajos ingresos economicos, mientras que en los paises con alto indice per capita la prevalencia de la infeccion por VHC es baja (4). En America Latina la prevalencia se ha estimado entre 0,5% al 3,4% (11, 12).

Los inmunoensayos para el diagnostico de VHC han evolucionado a traves del tiempo mediante la incorporacion de nuevas proteinas del virus. El primer ensayo disenado denominado de primera generacion, contenia solo a la proteina no estructural 4 (NS4; (c100-3)), proteina que representa solo el 12% del genoma viral, en consecuencia, la sensibilidad fue muy baja, con un porcentaje de falsos positivos del 60% y una ventana serologica entre 12 a 26 semanas despues de la exposicion (13), lo que indica que NS4 por si solo no es un buen marcador serologico.

Posteriormente, se desarrollaron los ensayos de segunda generacion, que incorporaron peptidos sinteticos del core (c22) del VHC y a la proteina NS3 (c33c, c100-3), lo que mejoro la especificidad y sensibilidad de la prueba y redujo la ventana serologica entre 11 a 25 semanas. Posteriormente, con los de tercera generacion que incorporaron la proteina NS5, se redujo aun mas la ventana serologica, entre 9 a 20 semanas (13). Mas recientemente, los ensayos de cuarta generacion incorporaron varias regiones de NS5 (NS5a y NS5b) mejorando la sensibilidad y especificidad y reduciendo entre 8 a 18 semanas la ventana serologica(14), esto sugiere que los anticuerpos anti-NS5 son los que aparecen en los estadios mas tempranos posterior a la exposicion, mientras que los anti-NS4 son mas tardios en aparecer y estan presentes en un bajo porcentaje de los individuos expuestos, por lo que su utilidad diagnostica aun no esta bien determinada (15). A pesar de los avances en el diagnostico de la infeccion por el VHC, se requieren nuevos ensayos que incorporen distintos antigenos, a fin de mejorar las herramientas diagnosticas actualmente disponibles.

Durante la infeccion por el VHC, se activan tanto la respuesta inmune humoral como la celular del hospedador; sin embargo, su papel en la proteccion y control de la replicacion viral aun no esta del todo esclarecido. Los anticuerpos contra las proteinas del virus aparecen varias semanas posterior a la exposicion (16). Se ha reportado que los anticuerpos contra E2 estan presentes en elevado porcentaje en la fase aguda de la infeccion (17, 18), razon por la cual en la actualidad son un foco de atencion en el diseno de vacunas, debido a que algunos tienen actividad de neutralizacion (19). Adicionalmente, se ha reportado la estructura cristalografica de E2 y la amplia posibilidad de anticuerpos neutralizantes que pudieran utilizarse con fines terapeuticos (20, 21). En adicion a la envoltura, existe otra region NS2, poco explorada a pesar de ser un inmunogeno potente (22); sin embargo, su utilidad diagnostica ha sido poco evaluada. En este trabajo se decidio disenar un estuche diagnostico casero que incorpora las proteina E2 y NS2 del VHC, ademas de NS3, NS5a, NS5b y el core, en sustitucion de NS4, a fin de evaluar su capacidad diagnostica en comparacion con un estuche comercial de cuarta generacion.

MATERIALES Y METODOS

Seleccion de los pacientes

Se reclutaros 129 individuos para el estudio, 61 individuos seronegativos y 68 pacientes seropositivos, con diagnostico previo de infeccion por el VHC. En el grupo control se incluyeron 5 pacientes con infeccion cronica por hepatitis B, 3 positivos a anticuerpos anti-nucleares (AAN) y 2 en hemodialisis por insuficiencia renal cronica y en el grupo de pacientes, 3 individuos con un periodo de exposicion aproximado de 100 dias (1 por tatuaje y los otros dos por transfusiones sanguineas). Todas las muestras fueron reevaluadas serologicamente mediante el uso del estuche comercial de la casa BioelisaHCV 4.0 (Biokit[R] S.A. Barcelona, Espana) de cuarta generacion para la deteccion de IgG anti-VHC y mediante RT-PCR en tiempo real.

Expresion y purificacion de proteinas recombinantes

Las secuencias del core, E2, NS2, NS3, NS5A y NS5B fueron clonadas en diferentes vectores de expresion (pET30a-core, pQE31-E2, pQE30-NS2, pET30a-NS3,pQE60-NS5a, pQE60-NS5b),y analizadas mediante secuenciacion, con el fin de corroborar la presencia de las secuencias codificantes de cada una de las proteinas virales en los diferentes plasmidos, que luego fueron utilizadas para transformar las E. coli mediante shock termico. Las bacterias transformadas fueron cultivadas en medio liquido Luria Bertani Broth (LB, Sigma-Aldrich Co. LLC) (0,5% de NaCl, 1% de peptona, 0,5% de extracto de levadura, pH 7) suplementado con glucosa (0,1%), magnesio (1mM) y ampicilina/cloramfenicol (50[micron]g/mL) para el caso de pQE31-E2, pQE30NS2, pQE60-NS5a, pQE60-NS5b) y kanamicina/cloranfenicol para el caso de pET30a-core y pET30a-NS3), hasta alcanzar una densidad optica de 600nm, momento en que se le anadio isopropil-[beta]-D-tiogalactosido (IPTG100ug/mL). Las bacterias fueron tratadas con buffer de lisis (1% de Triton X100, 50mM de Tris pH 8, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de PMSF, 1 mM de DTT, y 2 [micron]g/mL de leupeptina, 2 [micron]g/ mL de aprotinina y 500 [micron]g/mL de lisozima) y el homogenado bacteriano se sometio a sonicacion, centrifugacion y, finalmente, el sobrenadante clarificado a purificacion por cromatografia de afinidad. La columna de afinidad al niquel fue lavada extensivamente con el fin de eliminar posible contaminacion con proteinas de E coli. Las muestras resultantes de la expresion y purificacion, fueron sometidas a electroforesis en un gel discontinuo de poliacrilamida al 10% bajo condiciones de desnaturalizacion (SDS-PAGE).

Diseno del ensayo inmunoenzimatico

Las placas de microtitulacion se sensibilizaron con 2 [micron]g/mL de cada una de las proteinas recombinantes, resuspendidas en 50 mM de Buffer [Na.sub.2]C[O.sub.3] (1M, pH 9,6). La incubacion se llevo a cabo a 4[grados]C durante toda la noche. La placa se bloqueo con PBS-BSA al 0,5 % a 4[grados]C durante toda la noche. Los sueros se diluyeron 1:20 en solucion bloqueante y se incubaron durante 45 minutos a 37[grados]C. Los lavados (6 en total), se realizaron con TBS-TWEEN 20 al 0,05%. El anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa de rabano (HRP) dirigido contra la IgG humana diluido 1:5000 en solucion bloqueante, se incubo durante 45 min a 37[grados]C; luego de 6 lavados, el revelado de la placa se realizo con TMB y la reaccion se detuvo con 100 [micron]L de H2SO4 1N. La densidad optica se midio con un espectrofotometro KAyToRT-2100C empleando una longitud de onda de 450 nm.

Determinacion de la carga viral mediante RT-PCR en tiempo real

Las muestras de suero de los pacientes evaluadas en el estudio fueron almacenadas en -80[grados]C hasta el momento de su analisis. Para la extraccion del ARN del VHC, se utilizo el metodo de columnas utilizando un estuche comercial para purificacion de ADN y ARN Viral (AxygenScientific, Inc. San Francisco, CA. USA) y el ARN eluido de la columna fue sometido a RT-PCR en tiempo real, utilizando el estuche RT-PCRKAPASYBR[R] FASTOne-StepqRT-PCR Universal (KapaBiosystems, Wilmington, MA USA). La amplificacion en tiempo real se llevo a cabo en un sistema detector de fluorescencia en tiempo real de cuatro colores Chromo4[TM] (BioRad). En paralelo se utilizo un estandar de concentracion conocida (ACURRUN 325, BBIDiagnostic, Boston USA) para establecer una curva de regresion lineal y obtener la concentracion expresado en Unidades/mL.

Analisis estadistico

El analisis estadistico, asi como los de correlacion lineal y los graficos se realizaron con los programas SPSS version 21 (IBM Corporation, New York, US), Excel 2010 (Microsoft Corporation, Redmond, US) y Graph Pad Prism version 5 & Quickcalcs (Graph Pad Software Inc, La Jolla, USA). La valoracion diagnostica del inmunoenzimatico, se realizo mediante la determinacion de los parametros de validez y seguridad para pruebas diagnosticas tales como sensibilidad, especificidad y valores predictivos, los que se calcularon estableciendo inicialmente puntos de corte a partir de la evaluacion de las curvas operador-receptor (ROC), esto permitio, ademas determinar el area bajo la curva como indicador de la capacidad diagnostica del test utilizado y los multiples pares sensibilidad, 1-especificidad. Se determino el punto de corte con el indice de Youden bajo la formula IY=sensibilidad+especificidad-1 y se tomo el valor mas cercano a 1; se clasificaron los resultados obtenidos con el inmunoensayo para cada una de las muestras segun el indice de Youden en positivo y negativo.

RESULTADOS

Obtencion de E2, NS2, NS3, NS5A, NS5B y core

Las 6 proteinas recombinantes fueron purificadas mediante cromatografia de afinidad al niquel. En la Fig. 1 se muestra una imagen representativa de un lisado total de un homogenado bacteriano, a partir del cual se procedio a realizar la purificacion de las proteinas recombinantes con 6 residuos de histidina (Fig. 1a), las imagenes de las 6 proteinas posterior a su purificacion (Fig. 1b-g) y el producto de la purificacion de un vector vacio (Fig. 1h) como control de la pureza del proceso de purificacion. Las proteinas obtenidas mostraron estar acordes con el peso molecular estimado, basados en el analisis de cada una de las secuencias obtenidas (ver Tabla I) E2 y NS3 (Fig. 1b y 1d) muestran bandas adicionales de menor tamano asociado un nivel de proteolisis durante su purificacion. Las concentraciones de cada una de ellas se calcularon mediante la aplicacion del coeficiente de extincion molar ([M.sup.-1]. [cm.sup.-1]).

Ensamblaje del ensayo de ELISA

Como fase inicial del estudio se determino el porcentaje de individuos que presentaban anticuerpos especificos contra las proteinas E2 y NS2. Para ello fueron previamente analizados 26 pacientes y 10 controles, evidenciandose que un mayor numero de individuos seropositivos presentaron anticuerpos contra E2 (50%: 13/26) en comparacion con NS2 (23%: 6/26). Dos de los 6 individuos positivos para NS2, no presentaron anticuerpos contra E2, lo que indica que en conjunto ambas proteinas son capaces de identificar al 57,6 % de individuos seropositivos para el VHC. Ninguno de los individuos seronegativos mostro anticuerpos contra ninguna de estas proteinas.

Posteriormente se procedio a establecer la validez, especificidad y sensibilidad del ensayo serologico casero a traves del analisis de muestras en paralelo con el estuche comercial Bioelisa de cuarta generacion. Tal y como se muestra en la Fig. 2, el ensayo casero logro diferenciar entre los individuos expuestos y no expuestos al VHC (Fig. 2a). El punto de corte determinado con el indice de Youden fue de 0,2385 para el ensayo comercial y de 0,4890 para el ensayo casero, con un nivel de especificidad del 100% y sensibilidad del 98% para el estuche comercial, comparado con una especificidad de 97 % y 100% de sensibilidad para el estuche casero. Adicionalmente, se obtuvo un valor predictivo positivo de 100% y valor predictivo negativo de 96% para el estuche comercial, mientras que para el estuche casero se obtuvo un valor predictivo positivo de 97% y un valor predictivo negativo de 100% (Tabla II).

Se evaluo la capacidad diagnostica de la prueba determinando parametros de validez y seguridad como sensibilidad, especificidad y valores predictivos; para ello, se determino el punto de corte a traves del analisis de discriminacion de senales con curvas ROC y del indice de Youden y se estimo el area bajo la curva como un indicador adicional de la capacidad diagnostica de ambas pruebas (Figs. 2b y 2c), se evidencio que el area bajo la curva (ABC) de ambas pruebas es cercana a 1, ABC=0,994 (0,81-1) para el estuche comercial y ABC=0,999 (0,997-1) para el estuche casero, indicando que la prueba casera tiene una elevada capacidad discriminatoria para diferenciar entre los individuos expuestos y no expuestos al virus, comparable al estuche comercial de cuarta generacion.

La concordancia entre los resultados obtenidos con la prueba casera y el estado serologico conocido de los individuos, se comparo con el indice Kappa y con la prueba chi cuadrado. La evaluacion de la concordancia entre la prueba comercial y los valores conocidos mostro un indice Kappa de 0,965 asociado a un valor de chi cuadrado estadisticamente significativo (p<0,001) (IC95%: intervalo de confianza del 95%.); de igual modo, para la prueba casera el Indice Kappa fue de 0,969 asociado a un valor de chi cuadrado estadisticamente significativo (p<0,001) (IC95%: intervalo de confianza del 95%). Ninguno de los individuos con infeccion por hepatitis B, positivos a AAN o en dialisis, mostraron reactividad a la prueba (resultados no mostrados). Los titulos de anticuerpos detectados no se correlacionaron con los niveles de carga viral de los pacientes (R= 0,0045; p= 0,3).

Se ha reportado que el tiempo promedio de deteccion de anticuerpos para el VHC es alrededor de 80-100 dias post infeccion, tiempo determinado a traves del seguimiento de individuos sometidos a transfusiones sanguineas (23). En el presente trabajo, tres de los individuos estudiados se encontraban en fase aguda. Uno de ellos fue infectado posterior a la colocacion de tatuaje, (13 semanas previas a la toma de la muestra) y los otros dos, posterior a la colocacion de hemoderivados contaminados con un tiempo de incubacion aproximado de 14 semanas. En todos los casos, tanto el estuche casero como el comercial lograron detectar anticuerpos en cada uno de estos individuos en la muestra inicialy luego de 6 meses de la exposicion (segunda muestra) (Fig. 3). La presencia de anticuerpos fue detectada en todos los individuos dentro de los 100 dias post-exposicion, tanto en la prueba casera como en la comercial, lo que podria sugerir que la ventana serologica en ambas pruebas es similar; sin embargo, se requieren estudios adicionales para determinar con precision la ventana serologica de la prueba casera propuesta en este estudio.

DISCUSION

En este estudio se desarrollo y valido una prueba casera para el diagnostico serologico de la hepatitis C, constitutivo de 6 proteinas recombinantes, dentro de las cuales se destacan la proteina de envoltura rE2; las no estructurales rNS2, rNS3, rNS5A, y rNS5B y rCore del VHC. La validacion de la prueba casera demostro especificidad y sensibilidad similares a las obtenidas con el estuche comercial, con un indice kappa igual a 0,969, al compararse con un estuche comercial de Biokit[c], esto sugiere que la misma pudiera utilizarse de manera segura para la deteccion de anticuerpos VHC especificos de tipo IgG, para el diagnostico de la hepatitis C, y constituirse como una alternativa nacional mas economica que los estuches comerciales importados.

El genoma del VHC codifica para al menos 10 diferentes proteinas: E1, E2/NS1, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B y el core (24). En la actualidad las pruebas inmunoenzimaticas (ELISAS) de tercera y cuarta generacion son ampliamente utilizadas para el diagnostico serologico en muchos laboratorios. Las primeras utilizan peptidos sinteticos de regiones conservadas del core, NS3, NS4 y NS5; la sensibilidad estimada de este ensayo es del 98,9% y la especificidad del 100%, mientras que las de cuarta generacion han incorporado a NS4B y NS5A, con el fin de mejorar su sensibilidad y especificidad (24). Una de las caracteristicas resaltantes de la prueba casera es el uso de proteinas recombinantes en sustitucion de peptidos sinteticos para conservar los determinantes antigenicos conformacionales y la deteccion de anticuerpos dirigidos contra estas porciones fundamentales en el reconocimiento antigenico y que predominan en la respuesta inmune humoral (25), y son los que, de manera predominante, se han caracterizado durante la infeccion por VHC (26). El punto de corte del estuche casero fue mayor al estuche comercial; sin embargo, logro diferenciar a los individuos seropositivos de los controles con la misma eficiencia, sensibilidad y especificidad del estuche comercial. Un punto de corte mayor pudiera estar asociado a condiciones menos astringentes de los buferes utilizados en el estuche casero o a trazas de contaminacion con proteinas de E coli.

La proteina No structural 2 (NS2) del VHC es requerida para el procesamiento de la poliproteina y la formacion de la particula infecciosa (27), maduracion viral del VHC y posterior egreso del virus de la celula infectada (28, 29). NS2 posee una porcion que se ancla a la membrana (aminoacidos[aa] 1 a 93) y sirve de andamio para el ensamblaje de las proteinas estructurales y no estructurales, mientras que la porcion citosolica (NS2 pro; aa 94 a 217) es donde se ubica el dominio de proteasa (30). Aunque no ha sido del todo explorado, los anticuerpos contra NS2 se han detectado durante la fase aguda (31), por lo que pudiera ser uno de los candidatos para acortar la ventana serologica de los estuches diagnosticos. En este estudio se detectaron anticuerpos contra NS2 en 6 de 26 individuos analizados, sin embargo, son necesarios nuevos estudios para evaluar la cinetica de aparicion de los anticuerpos anti NS2 durante la fase aguda de la infeccion y asi determinar con exactitud su utilidad para el diagnostico de la infeccion por el VHC en fases tempranas.

Las proteinas de envoltura E1 y E2 juegan un papel importante en el tropismo viral y la entrada al hepatocito, a traves de la union a sus receptores SR-B1, CD81, Claudina y Occludina (32) y son inmunogenos potentes, evidenciado por el hecho de activar respuesta de memoria, caracterizada por la presencia de linfocitos B de memoria inducidos por la proteina E2 identificado en mas del 90% de los individuos evaluados, lo que se correlaciona con la presencia de anticuerpos especificos contra E2 (33). Asimismo, los estudios demuestran que mientras mas temprano sea el inicio de la respuesta humoral (34) y contra diversos epitopes con actividad contra la proteina de envoltura 2 (E2), existe mayor probabilidad de un mejor control de la replicacion viral, incluso en aquellos individuos con infeccion cronica (35).

Los anticuerpos contra E2 han sido a su vez clasificados como no-neutralizantes, con limitada capacidad de neutralizacion y con amplia capacidad de neutralizacion (36), y de mediar ADCC(17), estos ultimos se han detectado tanto en la fase aguda como en la fase cronica; de ahi la importancia de incorporarlos como una herramienta serologica, con utilidad para el diagnostico y pronostico de la infeccion. Asi, la presencia de los anticuerpos dirigidos contra la envoltura, en especial contra la proteina E2, con funcion de neutralizacion y con una amplitud de respuesta elevada contra diversos epitopes, no se asocia con reduccion de la carga viral, pero si con una menor probabilidad a desarrollar cirrosis o fibrosis hepatica (37).

Estudios recientes indican que los antigenos de envoltura pueden detectar la presencia de anticuerpos de manera eficiente y comprable con los estuches comerciales en individuos expuestos a la infeccion por el VHC (38-40), este reconocimiento es independiente del genotipo, y estan presentes en mas del 80% de los individuos en fase cronica (18, 41), lo que sugiere su importancia tanto en la deteccion, control y progresion de la infeccion por el VHC.

La amplificacion molecular del ARN del VHC por PCR es uno de los indicadores mas sensibles durante de infeccion aguda, sin embargo, las pruebas serologicas para la deteccion de la infeccion por VHC corresponden a la primera linea de pruebas que se utilizan para el tamizaje y diagnostico de la infeccion por VHC, ya que la presencia de anticuerpos en el suero es el reflejo de una infeccion aguda, cronica o curada (24). La infeccion cronica, a su vez, puede progresar de manera silente hacia la cirrosis o carcinoma hepatocelular, y la deteccion de anticuerpos con fines diagnosticos, es una herramienta fundamental para definir estrategias terapeuticas que permitan detener la progresion de la enfermedad en este grupo de pacientes (4, 42). Es por ello que el diseno de herramientas diagnosticas eficientes es indispensable para el manejo de estos pacientes, de ahi la importancia de disponer de herramientas confiables. Los resultados de este estudio validan la aplicacion de un nuevo ensayo serologico con una concordancia del 100% con los ELISAS de cuarta generacion.

Son necesarios estudios adicionales para determinar con precision la ventana serologica de esta prueba con respecto a los ensayos tradicionales, asi como tambien la utilidad de nuevos antigenos que pudieran contribuir a la deteccion mas temprana de la exposicion al virus, en especial porque la presencia de IgM anti VHC es muy variable y no ha mostrado ser de utilidad para determinar exposicion temprana al VHC (43). Finalmente, es necesario ampliar la evaluacion hacia otros grupos de individuos tales como los pacientes inmunocomprometidos con el fin de evaluar su desempeno y, de esta manera, proponerlo como una alternativa valida y de utilidad para nuestro pais.

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Guillermo Teran-Angel, Melisa Colmenares, Nubia Silva Gutierrez, Fabiola Silva, Alexandra Paredes, AH Calderon, Nathalie Araujo Linares, Darrell L. Peterson y Sham Salmen.

Instituto de Inmunologia, Universidad de Los Andes, Merida, Venezuela.

Autor de Correspondencia: Siham Salmen Halabi, Instituto de Inmunologia, Universidad de Los Andes. Avenida 16 de Septiembre, Edificio Louis Pasteur, Sector campo de Oro, Merida 5101, Venezuela. Correo Electronico: salmensiham9@gmail. com. Fax: +58 2742403187.

Leyenda: Fig.1. Proteinas purificadas del VHC utilizadas en el inmunoensayo. La figura muestra el lisado total de la E coli (a) y las proteinas recombinantes rE2 (a), rNS2 (c), rNS3(d), rNS5A(e), rNS5B(f), rCore(g)y el producto obtenido de un vector vacio (h),una vez purificadas mediante columnas de afinidad al niquel, dializadas y liofilizadas, sometidas a electroforesis y tenidas con azul de Coomassie.

Leyenda: Fig.2a. Muestra la dispersion de las densidades opticas de las muestras analizadas con el estuche comercial (puntos rojos) y el estuche casero (puntos azules),de los individuos no expuestos (panel izquierdo) y expuestos (panel derecho) al VHC.

Leyenda: Fig.2b y 2c. Muestran la curva operador-receptor de las densidades opticas producto de la deteccion de los niveles de anticuerpos de tipo IgG anti-VHC, para el diagnostico de la infeccion por el virus de la hepatitis C (2b kit comercial y 2c kit casero). ABC: area bajo la curva.

Leyenda: Fig.3. Presencia de anticuerpos posterior a la exposicion al VHC. Tres individuos fueron analizados dentro de los 100 dias posterior a la exposicion y 6 meses despues, con el estuche casero (cuadros) y con el comercial (circulos). Individuo 1 (naranja) exposicion posterior a tatuaje y los otros dos (azul y verde) recibieron transfusiones sanguineas.
TABLA I

CARACTERISTICAS FISICOQUIMICAS DE LAS PROTEINAS RECOMBINANTES DEL VHC

                       E2      NS2     NS3    NS5A    NS5B    Core

PM (KDa)aproximado     40      27      54      40      66      25
CEM (M-1. cm-1)       2,255   2,191   0,873   1,555   1,429   1,344
Concentracion final    990     900     801     733     915    1000
  ([micron]g/mL)

PM: peso molecular; CEM: coeficiente de extincion molar.

TABLE II

CUADROS DE CONTINGENCIA PARA LA EVALUACION DE LAS PRUEBAS
IGG ANTI-VHC DEL ESTUCHE CASERO Y EL ESTUCHE COMERCIAL

Prueba comercial ELISA IgG anti VHC

Evaluacion de la prueba IgG anti-VHC

               Hepatitis C +   Hepatitis C -     Total

Positivo            67               0             67
Negativo             1              61             62
Total               68              61            129

Prueba casera ELISA IgG anti VHC

               Hepatitis C +   Hepatitis C -     Total

  Positivo          68               2             70
  Negativo           0              59             59
   Total            68              61            129

Validez y Seguridad de la prueba IgG anti-VHC (IC95%)

                                   Valor         Valor
Sensibilidad   Especificidad    predictivo     predictivo
                                 positivo       negativo

98%                100%            100%           96%
(87-100%)        (85-100%)       (92-100%)     (77-100%)

                                   Valor         Valor
Sensibilidad   Especificidad    predictivo     predictivo
                                 positivo       negativo

    100%            97%             97%          100 %
 (95-100%)       (89-100%)       (90-100%)     (94-100%)

IC95%: intervalo de confianza del 95%.

La evaluacion de la concordancia entre la tecnica y los valores
conocidos mostro un indice Kappa de 0,965 asociado a un valor de
chi cuadrado estadisticamente significativo (p<0,001).

La evaluacion de la concordancia entre la tecnica y los valores
conocidos mostro un indice Kappa de 0,969 asociado a un valor de
chi cuadrado estadisticamente significativo (p<0,001).
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Author:Teran-Angel, Guillermo; Colmenares, Melisa; Silva Gutierrez, Nubia; Silva, Fabiola; Paredes, Alexand
Publication:Investigacion Clinica
Date:Jun 1, 2017
Words:6016
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