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Diferentes pre-inoculos, temperaturas e tempos de incubacao na producao aflatoxina [B.sub.1] em arroz.

INTRODUCAO

Micotoxinas sao metabolitos secundarios produzidos por algumas especies de fungos filamentosos que podem ocorrer em alimentos, como resultado do crescimento fungico (GONCALVEZ et al., 2001; GQALENI et al., 1997 SWEENEY & DODSON, 1998).

Os fungos mais comuns encontrados em alimentos e produtos estocados pertencem ao genero Aspergillus ou Penicillium (GARCIA et al., 2002; NGUYEN et al., 2007). Algumas especies de fungos podem produzir micotoxinas, ocasionando significativas perdas economicas e serios problemas a saude humana e animal (HUSSEIN & BRASEL, 2001; IARC, 2002). No entanto, o simples isolamento e a confirmacao de fungos micotoxigenicos em alimentos nao indicam a presenca de micotoxinas (HUSSEIN & BRASEL, 2001; GUITAKOU et al., 2006).

Mais de 20 especies de Aspergillus produzem micotoxinas, sendo as mais comuns as da divisao flavi, que incluem tres especies: A. flavus, A. parasiticus,, A. nomius (VAAMONDE et al., 2003; SALEEMULLAH et al., 2006). As quatro aflatoxinas naturalmente produzidas sao [B.sub.1], [B.sub.2], [G.sub.1], [G.sub.2; sendo que a [B.sub.1] e usualmente encontrada em grandes concentracoes, contaminando alimentos (D'MELLO & MACDONALD, 2002; GUITAKOU et al., 2006; MOSS, 2002).

A aflatoxina [B.sub.1] possui potencial hepatotoxico, carcinogenico e teratogenico tanto em homens como em animais (SWEENEY & DOBSON,1998; MARKLINDER et al.,2005; MOSS, 2002; PILDAIN et al., 2004). Em 1993, a International Agency for Research on Cancer (IARC) (WHOIARC, 1993) considerou as aflatoxinas como carcinogenicas para humanos (grupo I) (HUSSEIN & BRASEL, 2001; IARC, 2002).

As circunstancias que promovem a producao de aflatoxinas sao geralmente mais restritas que aquelas que promovem o crescimento fungico (GONCALVEZ et al., 2001). Composicao do substrato, temperatura, teor de agua, umidade relativa do ar, atividade de agua, pH e linhagem do fungo contaminante sao fatores que governam a producao de aflatoxinas, sendo que a temperatura, a umidade e o tipo de substrato sao os fatores mais importantes (MALLOZZI & CORREA, 1998; GQALENI et al., 1996 TANIWAKI & SILVA, 2001; MOLINA & GIAMUZZI, 2002; GQALENI et al., 1997).

Tendo em vista os aspectos mencionados, o presente estudo teve por objetivos avaliar a capacidade produtora de aflatoxina [B.sub.1] de tres cepas de Aspergillus flavus no substrato em que foram isolados (arroz) e observar o efeito de diferentes pre-inoculos (meios de cultura sinteticos) nestas cepas conhecidamente aflatoxigenicas.

MATERIAL E METODOS

Isolados utilizados

Para realizacao deste trabalho, foram utilizados tres isolados de Aspergillus flavus, produtores de aflatoxina [B.sub.1], encontrados e identificados por HOELTZ (2005) em amostras de arroz com casca. Esses isolados foram denominados A21, A43 e A46 pela fungoteca do Laboratorio de Toxicologia (ICTA/ UFRGS).

Delineamento experimental

Para realizacao deste experimento, foi realizado um teste previo com os tres isolados em meios sinteticos (dados nao publicados), em que foram testadas temperaturas de 20, 25, 30, 35 e 40[grados]C e tempos de incubacao de sete, 11, 14, 18 e 21 dias. As melhores combinacoes desses dias e as temperaturas encontradas (25[grados]C/11 dias, 20[grados]/14 dias e 25[grados]C/18 dias) foram aplicadas nos testes com arroz.

Meios de cultivo

Meios sinteticos: YES- Yeast Extrat Sucrose (2g extrato de levedura, 150g de sacarose, 20g de agar, 0.5g de sulfato de magnesio e 100mL de agua destilada); CYA- Czapeck Yeast Extrat (5,0g de extrato de levedura, 30g de sacarose, 15,0g de agar, 10,0m[L.sup.-1] de Czapeck concentrado, 1,0g de [H.sub.2]HP[O.sub.4] e 100mL de agua destilada); Agar Sabouraud (neopeptona 10,0g, dextrose 40,0g e agar 20,0g (MERCK, Darmastadt, Alemanha). Meio Natural: arroz parboilizado, livre de micotoxina, com umidade inicial de 12,89%.

Analise do potencial toxigenico dos tres isolados conhecidamente aflatoxigenicos

As tres cepas produtoras de aflatoxina B1 foram testadas em arroz parboilizado. A partir de cada cepa selecionada, uma suspensao de esporos foi preparada em Tween 80%. Os esporos foram contados em uma Camara de Neubauer e o volume necessario para obter-se [10.sup.6][ml.sup.-1] esporos foi inoculado em erlenmeyers (125mL) com 15g de arroz esteril a 73% de umidade (atividade de agua de 0,99), em duplicata (PARK & BULLERMAN, 1983). Estes foram tampados com algodao e incubados em estufa BOD em uma combinacao de tempo e temperatura referentes a melhor producao de aflatoxina [B.sub.1] obtida a partir de experimentos em meios sinteticos (dados nao publicados). Apos este periodo, 30[ml.sup.-1] de metanol a 80% foram adicionados aos erlenmeyers e as toxinas foram extraidas sob forte agitacao por 5 minutos. Apos a filtracao, os extratos obtidos foram aplicados com capilares sobre placas de silica gel 60G (MERCK, Darmastadt, Alemanha) e eluidos com tolueno: cloroformio: acetato de etila: acido formico (35:25:25:10). Apos desenvolvimento do cromatograma, as placas foram visualizadas sob luz ultravioleta de comprimento de onda longo (365nm) para deteccao da fluorescencia caracteristica de aflatoxina [B.sub.1] (SMEDSGAARD, 1997; GQALENI et al., 1996; VAAMONDE et al., 2003; BELLI et al., 2004; ABRANSON & CLEAR, 1996; LEONTOPOULOS et al., 2003; PARK & BULLERMAN, 1983; GUITAKOU et al., 2006).

RESULTADOS E DISCUSSAO

As melhores condicoes de temperatura e tempo de incubacao encontradas para producao de aflatoxina testada com os meios sinteticos foram aplicadas nos testes com arroz (25[grados]C/11 dias, 25[grados]/18 dias e 20[grados]C/14 dias). Inicialmente, os fungos produtores foram retirados de pre-inoculos feitos em agar sabouraud (Tabela 1). De acordo com estes testes, [B.sub.1], no tempo de 18 dias, em temperatura de 25[grados]C. Em apenas a cepa A43 mostrou-se produtora de aflatoxina virtude destes resultados nao serem satisfatorios, realizou-se um novo experimento, em que as cepas produtoras foram inoculadas nos meios CYA e YES por sete dias (pre-inoculo). Neste teste, a contagem de esporos (provenientes dos pre-inoculos em CYA e YES) foi realizada para uma concentracao de [10.sup.6] l [ml.sup.-1] e, em seguida, as cepas foram inoculadas nos erlenmeyers contendo as amostras de arroz (15g) a serem analisadas. A partir desse teste, verificou-se que todas as cepas retiradas do pre-inoculo em meio YES e inoculadas no arroz, em temperatura de 25[grados]C/18 dias e 20[grados]C/14 dias, produziram aflatoxina [B.sub.1] (Tabela 1).

Os isolados A43 e A21 retirados do preinoculo CYA se mostraram produtores, porem, em apenas uma condicao de cultivo (25[grados]C em 18 dias). O isolado A46 mostrou-se deficiente em relacao a producao de aflatoxina quando inoculado no meio CYA. Este dado foi similar ao encontrado por PARK & BULLERMAN (1983), que concluiram que a producao de AF[B.sub.1] depende acima de tudo da linhagem isolado fungico.apos estudarem inoculo de Aspergillus flavus e parasiticus em arroz.

O meio YES utilizado como pre-inoculo apresentou maior desempenho, quando comparado com meio CYA, uma vez que houve producao de aflatoxina [B.sub.1] pelos tres isolados testados (Tabela 1), alem de mais de uma condicao (25[grados]/18 dias e 20[grados]C/14 dias). LEONTOPOULOS et al. (2003) concluiram que YES Agar e um otimo meio para biossintese de aflatoxina [B.sub.1] e que, alem de ser de facil preparacao, e relativamente barato.

Varios substratos ja foram testados para verificar o potencial toxigenico fungico. Um exemplo foi o estudo realizado por KOKKONEN et al. (2004), que, apos analisarem varios substratos para examinar a capacidadedo fungo em produzir micotoxinas, verificaram que linhagens de Penicillium produziram varias micotoxinas diferentes, dependendo do meio e da linhagem. A partir deste dado, os autores concluiram que existe uma grande necessidade de se utilizar mais de um meio de cultura para verificar e identificar os metabolitos fungicos.

O arroz se mostrou um meio utilizavel para testes de potencial toxigenico devido ao fato de que todos os isolados conhecidamente aflatoxigenicos utilizados neste experimento produziram aflatoxina. PARK & BULLERMAN (1983) inocularam esporos de duas especies de Aspergillus flavus e parasiticus, em arroz e queijo, e analisaram o efeito da variacao de temperatura nestes substratos (25[grados]C, 18[grados]C, 5-25[grados]C, 15[grados]C e 5[grados]C). Tais autores concluiram que o queijo nao e um bom substrato para producao de aflatoxinas, ao contrario do arroz.

De acordo com RAYBAUDI et al. (2000), em um estudo de potencial toxigenico, realizado com isolado de Aspergillus flavus e parasiticus, cerca de 37% dos isolados apresentaram producao de aflatoxinas em arroz, enquanto que somente cerca de 4% dos testados produziram aflatoxinas em agar coco. Ja BRESLER et al. (1995) inocularam especies de Aspergillus em arroz e constataram que quatro de 34 isolados de A. flavus foram produtores de aflatoxinas e seis de um total de 12 A. parasiticus se mostraram aflatoxigenicos neste meio. Tais autores concluiram que fungos toxigenicos podem ser facilmente encontrados, mas a producao de micotoxinas pode aparecer somente durante uma prolongada estocagem de produtos contaminados.

As temperaturas de 20[grados]C e 25[grados]C mostraramse boas para producao de aflatoxina B1 nas amostras de arroz analisadas neste trabalho. Para OSWEILER (1998), a faixa de temperatura para formacao de aflatoxinas e de 25[grados]C a 32[grados]C, contudo, a temperatura de 13[grados]C por dois ou mais dias ainda permite a formacao de aflatoxina. SAMAPUNDO et al. (2007), ao inocularem A.flavus em graos de pipoca, verificaram que os isolados testados tiveram otimo crescimento a 30[grados]C.

PARK & BULLERMAN (1983)

demonstraram que a producao de aflatoxinas pode ser afetada por flutuacao de temperatura. A exposicao de A. parasiticus a temperaturas altas (entre 40 e 50[grados]C), por um curto periodo de tempo, reduz o crescimento e a producao de aflatoxinas.

No que se refere ao crescimento fungico no arroz analisado, pode-se perceber que a partir do 2o dia de incubacao em qualquer uma das temperaturas testadas ja houve um crescimento superficial destes bolores. Estes dados novamente sao similares com os obtidos por PARK & BULLERMAN (1983), que tambem notaram um crescimento de Aspergillus flavus a partir do segundo dia de incubacao, na temperatura de 25[grados]C. GQALENI et al. (1997) demonstraram em seu estudo que as especies de Aspergillus flavus estudadas tiveram uma otima temperatura para colonizacao do substrato na faixa de 25 a 30[grados]C. Segundo TANIWAKI & SILVA (2001), o A. flavus apresenta temperatura minima de crescimento por volta de 12[grados]C, maxima proxima de 48[grados]C e otima entre 30 e 42[grados]C.

No 110 dia, o crescimento atingiu seu maximo. A esporulacao dos isolados foi notada a partir do 70 dia. Para LEONTOPOULOS et al. (2003), o maximo crescimento do micelio de um isolado de Aspergillus flavus foi ao 6o dia apos a inoculacao. Depois deste periodo, uma moderada desaceleracao do crescimento do micelio foi observada. Tais resultados indicam tambem a importancia que o meio YES exerce sobre os isolados fungicos em relacao a esporulacao fungica. PARK & BULLERMAN (1983) constataram que o crescimento de Aspergillus flavus e A. parasiticus em agar BDA nao foi bom, pois nao houve esporulacao suficiente. A partir deste resultado, antes de inocularem os esporos desses isolados em arroz, esses pesquisadores fizeram o crescimento destes isolados em meio YES, sendo que a esporulacao foi notoriamente boa para contagem de esporos e inoculacao no meio natural.

BU'LOCK (1965) afirma que o mecanismo de esporulacao tem uma conexao com metabolitos secundarios. Para PARK & BULLERMAN (1983), o tempo requerido para iniciar o crescimento e a esporulacao de Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus em amostras de arroz foi afetado pela temperatura, pelo substrato e pela linhagem do fungo. O inicio do crescimento ocorreu mais rapido a 25[grados]C, seguido de 18[grados]C da temperatura ciclica (5-25[grados]C) e 15[grados]C. Esses autores concluiam que a temperatura foi um fator determinante para o crescimento e a esporulacao fungica.

A atividade de agua de 0,99 do arroz mostrou-se boa para producao de aflatoxinas, conferindo com os resultados encontrados por GQALENI et al. (1997), em que a atividade de agua do substrato (CYA e YES) de 0,99 foi considerada otima para producao de aflatoxinas. No mesmo, estudo a producao de aflatoxina foi afetada por diferentes substratos, tempos de incubacao e presenca de outras micotoxinas produzidas por A. flavus. Samapundo et al (2007) observaram que isolados de Aspergillus, quando inoculados em graos de pipoca, nao cresceram em atividade de agua de 0.801. Em geral, as aflatoxinas sao produzidas a valores de aw de 0,95 a 0,99 com um valor minimo de 0,82 para A.flavus (ICMSF,1996; NIELSEN, et al., 2004).

CONCLUSAO

Os resultados deste estudo sugerem que os meios sinteticos CYA e, principalmente, YES servem como um execelentes substratos (pre-inoculo) para producao de aflatoxinas, pois demonstram que sao capazes de ativar a producao das mesmas. O arroz, quando incubado em um periodo de 14 ou 18 dias em temperaturas de 20 e 25[grados]C, tambem mostrou-se um bom substrato natural para deteccao de aflatoxina B1. Estes dados revelam tambem que temperatura e umidade devem ser evitadas nos silos de armazenamento de arroz. A quantificacao de aflatoxina B1 e os fatores que levam os meios CYA e YES utilizados como pre-inoculos a promoverem uma melhor producao de aflatoxinas refletem a necessidade de novos estudos.

Recebido para publicacao 17.01.08

REFERENCIAS

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Ana Carolina Ritter (I) * Isa Beatriz Noll (I)

(I) Laboratorio de Toxicologia, Instituto de Ciencia e Tecnologia de Alimentos (ICTA), Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Av. Bento Goncalves, 9500, predio 43212, Campus do Vale, Agronomia, Porto Alegre, RS, Brasil. E-mail: anacarolina.ritter@gmail.com. * Autor para correspondencia.
Tabela 1--Tipos de neoplasias em ratos Wistar, provenientes do Centro
de Criacao de Animais de Laboratorio (CECAL), apresentados de
acordo com o sexo dos animais (periodo de agosto de 2002 a
janeiro de 2007).

Grupos e tipos de             No. de neoplasias   No. de neoplasias em
neoplasias                    em machos/            femeas/ ocorrencia
                              ocorrencia

  Neoplasias da
  glandula mamaria
  Carcinoma simples
  tubular                                    --              9 / 23,7%
  Carcinoma mucinoso                         --       [5.sup.b]/ 13,2%
  Fibroadenoma                               --              5 / 13,2%
  Adenoma                                    --               2 / 5,3%
  Carcinoma simples
  cistico-papilar                            --               2 / 5,3%

Neoplasias mesenquimatosas
da pele e dos tecidos moles
  Hemangiossarcoma                     2 / 5,3%               1 / 2,6%
  Fibrossarcoma                              --               2 / 5,3%
  Mesotelioma                   [1.sup.a]/ 2,6%                     --

Neoplasias das glandulas
endocrinas
  Glandula hipofise
  Adenoma                              2 / 5,3%       [1.sup.b] / 2,6%
  Glandula adrenal
  Ganglioneuroblastoma          [1.sub.a]/ 2,6%                     --

Neoplasias epiteliais
e melanociticas da pele                2 / 5,3%
  Epitelioma sebaceo                         --               1 / 2,6%
  Papiloma                             1 / 2,6%                     --

Neoplasias do osso e
articulacoes                           1 / 2,6%
  Osteossarcoma
  osteoblastico                              --               1 / 2,6%

Neoplasias do sistema
genital                                1 / 2,6%
  Leiomioma                                  --               1 / 2,6%

Neoplasias do sistema
respiratorio                           1 / 2,6%
  Adenocarcinoma
  papilifero pulmonar
  primario                                   --               1 / 2,6%

Grupos e tipos de             No. total de
neoplasias                     neoplasias/
                                ocorrencia

  Neoplasias da
  glandula mamaria              23 / 60,5%
  Carcinoma simples
  tubular                        9 / 23,7%
  Carcinoma mucinoso             5 / 13,2%
  Fibroadenoma                   5 / 13,2%
  Adenoma                         2 / 5,3%
  Carcinoma simples
  cistico-papilar                 2 / 5,3%

Neoplasias mesenquimatosas
da pele e dos tecidos moles      6 / 15,8%
  Hemangiossarcoma                3 / 7,9%
  Fibrossarcoma                   2 / 5,3%
  Mesotelioma                     1 / 2,6%

Neoplasias das glandulas
endocrinas                       4 / 10,5%
  Glandula hipofise
  Adenoma                         3 / 7,9%
  Glandula adrenal
  Ganglioneuroblastoma            1 / 2,6%

Neoplasias epiteliais
e melanociticas da pele
  Epitelioma sebaceo              1 / 2,6%
  Papiloma                        1 / 2,6%

Neoplasias do osso e
articulacoes
  Osteossarcoma
  osteoblastico                   1 / 2,6%

Neoplasias do sistema
genital
  Leiomioma                       1 / 2,6%

Neoplasias do sistema
respiratorio
  Adenocarcinoma
  papilifero pulmonar
  primario                        1 / 2,6%

(a) Um macho apresentou dois tipos de neoplasias.

(b) Uma femea apresentou dois tipos de neoplasias.
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Author:Ritter, Ana Carolina; Noll, Isa Beatriz
Publication:Ciencia Rural
Date:Dec 1, 2008
Words:3711
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