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Diagnostico in vitro de la deficiencia LCHAD.

In vitro diagnosis of LCHAD deficiency

Introduccion

La [beta]-oxidacion mitochondrial, es el proceso mayoritario de oxidacion de los acidos grasos, siendo una fuente energetica muy importante tanto para el musculo esqueletico como para el musculo cardiaco, principalmente durante los periodos de ejercicio prolongado y durante el ayuno. Una vez al interior de la mttocondria, los esteres acil-CoAde los acidos grasos son degradados a traves de cuatro reacciones secuenciales a saber: a. Reduccion en la posicion a-b del acit-CoA produciendo 2,3,-enoil-CoA. b. Hidratacion del doble enlace dando lugar a especies estereosespecificas, L-3-hidroxiacilCoA. c. Oxidacion en la posicion 3-hidroxi dando lugara 3-cetoacil-CoA. d. Rotura tiolitica del 3-cetoac!l-CoA a acetil-CoA y acil-CoA, cuya cadena carbonada es ahora dos atomos de carbono mas corta. Este acil-CoA puede voiver a entraren el ciclo de la fi-oxidacion, tantas veces como sea necesario, hasta su completa oxidacion a acetil-CoA. Se ha descrito un complejo de la membrana interna mitocondrial (llamado "proteina trifuncional" TFP) que realiza las tres actividades enzimaticas enoil-CoA hidratasa, hidroxiacil-CoA deshidrogenasa, y cetoacilCoAtiolasa, pasos b, c, y d de la |3-ox!dacion mitocondrial, para los acidos grasos de cadena larga (1). La deficiencia de 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa de cadena larga (LCHAD) sola, o como parte de la deficiencia de proteina trifuncional (TFP), se manifiesta tipicamente durante los episodios de ayuno o enfermedad, como hipoglicemia hipocetocica. Las complicaciones agudas o cronicas de la deficiencia de LCHAD, pueden ser manejadas evitando el ayuno y consumiendo una dieta baja en acidos grasos de cadena larga y muy larga, asi como suplementado a los pacientes con acidos grasos de cadena media y corta?. La deficiencia de LCHAD es rara y puede ser causada por mutaciones en la subunidad affa {OMIM # 600890), o en la subunidad beta (OMIM #143450), de !a TFP, siendo la mutacion de cambio de sentido c.1528G>C en la subunidad alfa la mas preval ente (3,4). El presente estudio analizo la oxidacion de sustratos deuterados en fibroblastos de pacientes con deficiencia de LCHAD como herramienta diagnostica para este tipo de alteraciones metabolicas.

Materiales y metodos

El presente estudio es de tipo experimental descriptivo. El material biologico empleado en el presente estudio ha sido fibroblastos de 2 pacientes con deficiencia de LCHAD. Esta deficiencia fue confirmada por estudios enzimaticos, moleculares, o ambos. Como controles se utilizaron 20 cultivos diferentes de fibroblastos normales.

Como sustrato fue empieado el Acido (2) [H.sub.3]-metil-palmitico (Cambridge Isotope Laboratories). Fueron utilizados los siguientes compuestos deuterados para fa preparacion de la curva de calibracion (Ten Brinx-Free University Amsterdam): [8,8,8-[d.sub.3]]octanoil-L-carnitina.HCI, [10,10,10-[d.sub.3]]decanoil-L-carnitina. HCI, [12,12,12-[d.sub.3]]dodecanoil-L-carnitina.HCI, [14,14,14-[d.sub.3]]tetradecanoil-L-carnitina.HCI, [16,16,16-[d.sub.3]]hexadecanoil-L-carnitlna.HCI.

Como estandar interno fue adicionado acido undecanodioico (Fluka), durante el proceso de extraccion de las muestras.

Fibroblastos de pacientes y controles: (4-20 pasajes) fueron cultivados en bicarbonateHEPES-buffered Eagle's minimal essential medium (MEM), suplementado con 10% (v/v) newborn calf serum, y 1% (v/v) de antibiotico (gentamicina) a 37CC, en estufa con 5%C[O.sub.2]/95% de aire. Despues de alcanzar el punto de confluencia (80-100%), las celulas fueron lavadas dos veces con PBS y la solucion se tripsinizo (1 mi de tripsina-EDTA a 37[grados]C), y posteriormente se neutralizo mediante la adicion de 3-5 mi de MEM (Minimun Esential Medium). Las celulas fueron transferidas y centrifugadas a 337 X g (5 mtn, 20[grados]C) en tubos conicos de 10 mi (0,8-1,2 mg proteina), quedando listas para ser incubadas en presencia de sustratos deuterados. Se utilizo el metodo de Lowrry y Col. (5), para la determinacion de la proteina. Para la oxidacion (2) [H.sub.3]-palmitato en fibroblastos fue utilizada la tecnica disenada por Osorio y cois (6); se preparo una solucion de medio de cultivo con una concentracion final de 0.15 mM de acido 16-2H3 palmitico, 1mM BSA, y 0.2 mM L-carnitina. La incubacion por los fibroblastos se llevo a cabo de la siguiente manera: despues de la tripsinizacion, las celulas fueron resuspendidas en MEM enriquecido en frascos falcom de 2,5 mi (2 frascos por caso). Despues de 72 horas de incubacion, el medio de cultivo fue recogido mediante centrifugacion y almacenado a -20[grados] hasta su analisis. Las celulas se resuspendieron en 1 mi de PBS1 para procedera ia determinacion de proteinas.

El analisis cuantitativo se baso en el metodo del estandar interno. Se prepararon curvas de calibracion para los acidos grasos [C.sub.8], [C.sub.10], [C.sub.12], y [C.sub.14], en un rango de 0 a 150 nM, y [C.sub.16] en un rango de 0-1000 nM, utilizando acllcarnitinas deuteradas en el ultimo carbono, diluidas en MEM (p< 0.00001 para cada curva de calibracion). El analisis de los acidos grasos de ios medios enriquecidos {curvas de calibracion y productos de la incubacion) fue realizada despues de la hidrolisis con KOH. Las curvas de calibracion se obtuvieron mediante el analisis de la regresion lineal, representando la relacion de concentraciones de cada acido respecto al estandar interno frente a la relacion de areas. Las condiciones de la cromatografia gas-liquido fueron las siguientes: flujo de gas portador (He): 1 ml/min; division de flujo: 1:30; tiempo de spitless: 1min 5 segundos; temperatura del inyector: 250[grados]C; temperatura dei horno y programacion de temperaturas: T1 70[grados]C a 6[grados]C/ min, T2 250[grados]C a 20[grados]C/min hasta T3 300[grados]C; volumen de inyeccion: 1 [micron]l; tiempo total: 38,5 min. Las condiciones de la espectrometria de masas fueron las siguientes: el analisis cualitativo se realizo por cromatografia de gases-espectrometria de masas, con impacto electronico y monitorizacion selectiva de iones. Para cada acido se monitorlzo el !on MM5, ya que es el ion selectivo y uno de los mas abundantes; la ionizacion se realizo por impacto electronico a 70 eV y la fuente de iones se mantuvo a una temperatura de 200[grados]C. La temperatura del analizador fue de 100[grados]C; para la adquisicion de datos, el instrumento utilizo un scanning repetitivo en un rango de 40 a 600 unidades de masa atomica. Fue utilizado un cromatografo de gases 5890 Series II Plus--Espectrometro de masas 5972 Series (Hewlett Packard).

De acuerdo con el articulo 11 literal a. de la Resolucion No. 8430 de 1993 del Ministerio de Salud de Normas Cientificas, Tecnicas, y Administrativas para la Investigacion en Salud, el presente estudio es considerado sin riesgo.

Resultados

En todas las curvas de calibracion se obtuvo un coeficiente de correlacion superior al 0.99. (C8: y=0.9762x + 10.6; C10: y=1.0129x + 8.6; C12: y=0.9885x + 9.5; C14: y=0.985x + 10.4; C16: y=1.015x + 10.61). La Figura 1 muestra los espectros de masas def acido [sup.2][H.sub.3]-palmitico (A) y det estandar interno (IS) acido undecanodioico (B).

La Figura 2, muestra el cromatograma de la mezcla de acidos grasos deuterados de la curva de calibracion, producto de la hidrolisis de las acilcarnitinas deuteradas.

[FIGURA 1 OMITIR]

[FIGURA 2 OMITIR]

Se obtuvo un perfil caracteristico en los cromatogramas en !a deficiencia de LCHAD y en los controles (Figura 3).

[FIGURA 3 OMITIR]

Las concentraciones observadas para los diferentes acidos grasos, permiten diferenciar los fibroblastos de pacientes con deficiencia de LCHAD de los fibroblastos controles (tablal). Al realizar analisis estadistico mediante la prueba i de student se encontro diferencia significativa (P<0,05) entre los pacientes y los controles, para el totaf de acidos grasos acumulados, con incrementos significativos de C12, C14 y C16:OH.

Discusion

El diagnostico de la deficiencia de hidroxiacilCoA deshidrogenasa de cadena larga se basa en las manifestaciones clinicas, tales como hipoglicemia, hepatomegalia, cardiomiopatia, trastornos del ritmo cardiaco, debilidad muscular o miopatia, principalmente (7). Tambien se han reportado sindrome de muerte subita del lactante, retinitis pigmentosa, neuropatia periferica, y mioglobinuria (8,9). Las investigaciones bioquimicas demuestran niveles bajos de carnitina en sangre, asi como niveles elevados de [C.sub.14.1n-9] en suero, y elevacion de hidroxiacilcarnitinas en sangre ([C.sub.16:OH], [C.sub.18:0H], C13:10H) (10). Los estudios "in vitro" ue estos pacientes incluyen la utilizacion de fibroblastos y linfocitos entre otros". En la deficiencia de LCHAD encontramos elevacion en los niveles de C12, C14 y niveles de C16:1; ademas se detecto C16:OH. Todo esto concuerda con otros trabajos que hacen referencia al perfil de acilcarnitinas para estas dos deficiencias (12,13,14). En la deficiencia LCHAD un porcentaje de intermediarios hidroxilados (entre C12 y C18) es retenido intracelularmente en mayor cantidad que los intermediarios no hidroxilados de similar longitud en la cadena de atomos carbono, debido a que en esta deficiencia, existen suficientes cantidades de SCHAD para metabolizar desde C10, hasta C12 parcialmente, pero no para metabolizar cadenas de mayor longitud completamente a (15,16). Esto implica que las hidroxiacilcarnitinas de cadena larga son substratos menos eficientes que los intermediarios no hidroxilados para salir de la mitocondria, o de la celula, o de ambos (12).

Literatura citada

(1.) Chegary M, Brinke H, Ruiter JP, Wijburg FA, Sioll MS: Minkler PE, et al. Mitochondrial long chain fatty acid beta-oxidation in man and mouse. Biochim BiophysActa 2009; 1791(8):806-15.

(2.) Gillingham M, Van Calcar SC. Ney DM. Wolv J. Harding CO. Dietary Management of long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase deficiency (LCHADD). A case report and survey. J inher Metab Dis 1999; 22:123-31.

(3.) Saudubray JM, Martin D, de Lonlay P, Touati G, Poggi-Travert F, Bonnet D, et ai. Recognition and management of fatty acid oxidation defects: a series of 107 patients. J Inherit Metab Dis 1999; 22:488-502.

(4.) Eskelin PMA, Laitinen KA, Tyni TA. Elevated hydroxy acylcarnitines in a carrier of LCHAD deficiency during acute liver disease of pregnancy - A common feature of the pregnancy complication? Mol Genet Metab 2010; 100(2);204-06.

(5.) Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Pro tein measurement with the Folin phenol reagent J Biol Chem 1951; 193:265-75.

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(7.) Martinez-Ouintana E, Pena-Quintana L, Artiles-Vizcaino JA, Rodriguez-Gonzalez F. Long-chain 3-hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase deficiency and cardiogenic shock. International. J Cardiol 2009; 136:e1-e2.

(8.) Spiekerkoetter, U. Mitochondrial fatty acid oxidation disorders: clinical presentation of longchain fatty acid oxidation defects before and after newborn screening. J Inherit Metab Dis 2012; 33(5): 527-32.

(9.) Fletcher AL, Pennesi ME, Harding CO, Weleber RG, Gillingham MB. Observations regarding retinopathy in mitochondrial trifunctional protein deficiencies. Mol Genet Metab 2012; 106(1):18-24.

(10.) Gillingham MB, Scott B, Elliott D: Harding CO. Metabolic control during exercise with and without medium-chain triglycerides (MCT) in children with long-chain 3-hydroxy acyl-CoAdehydrogenase (LCHAD) or trifunctional protein (TFP) deficiency. Mol Genet Metab 2006; 89:58-63.

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(12.) Shen JJ, Matern D, Millington DS, Hillman S, Feezor MD, Bennett MJ, et al. Acylcarnitines in fibroblasts of patients with lonhg-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase deficiency and other fatty acid oxidation disorders. J Inher Metab Dis 2000; 23:27-44.

(13.) Ventura FV, Costa CG, Struys EA, Ruiter J, Allers P, Ijlst L, et al. Quantitative acylcarnitine profile in fibroblasts using [U-.sup.13] Cpalmitic acid: an improved tool for the diagnosis of fatty acid oxidation defects. Clin Chem Acta 1999; 281:1-17.

(14.) Roe CR, Roe DS. Recent developments in the investigation of inherited metabolic disorders using cultures human cells. Mol Genet Metab 1999; 68:243-257.

(15.) Costa CG, Struys EA, Bootsma A, Brink HJ, Dorland L, Tavares de Almeida I, et al. Quantitative analysis of plasma acylcarnitines using gas chromatography chemical ionization mass fragmentography. J Lipid Res 1997; 38:173-182.

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Jose Henrv Osorio * PhD

[1] Profesor Titular, Departamento de Ciencias Basicas de la Salud, Universidad de Caldas. Correo: jose.osorio_o@ ucaldas.edu.co

Recibido para publicacion: 17-09-2012--Version corregida: 21-03-2013--Aprobado para publicacion: 07-05-2013

Osorio J.H. Archivos de Medicina (Manizales). Volumen 13 No. 1. Enero-Junio 2013. ISSN version impresa 1657-320X.

ISSN version en linea 2339-3874. Universidad de Manizales. Manizales (Colombia).
Tabla 1. Produccion de acidos grasos deuterados en
fibroblastos control y de pacientes con deficiencia
de LCHAD, posterior a la Incubacion con acido
[sup.2][H.sub.3]-palmitico.

Linea       Acidos grasos intermediarios
Celular     (nmol/mg proteina/72 h)

                CS          C10         C12;1

Controles      16,7         10,4         0,6
hiervalo    (5,8-28,6)   (7,8-14.3!   (0,3-1,3)
LCHAD           18          12,3         0,8

Linea       Acidos grasos intermediarios
Celular     (nmol/mg proteina/72 h)

               C12         C14:1       C14

Controles      5,2          4,1        9,2
hiervalo    (1,0-17,6)   (2,8-5,7)   (2.8-25)
LCHAD          38,6         3,9        32,9

Linea       Acidos grasos intermediarios
Celular     (nmol/mg proteina/72 h)

               C16:1      C16:oh      Total

Controles      16,9        nti         63.3
hiervalo    (11,1-28,6)            (31.6-121.1)
LCHAD          38,6         97        232.1

Abreviaturas: nd, no detectado
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Title Annotation:Articulo de Investigacion
Author:Henry Osorio, Jose
Publication:Archivos de Medicina
Date:Jan 1, 2013
Words:2400
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