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Diagnostico genetico preimplantacion: una alternativa hacia el futuro en el presente.

Resumen

El diagnostico genetico preimplantacion (DGP) es una tecnica novedosa que se promueve como una alternativa al diagnostico prenatal y a la terminacion voluntaria del embarazo para parejas con riesgo elevado de transmision de enfermedades geneticas a su descendencia. Tras la aplicacion de tecnicas de reproduccion asistida se realiza la biopsia en embriones evolutivos con la extraccion de dos blastomeras para su analisis genetico. Los embriones que se demuestran libres de la enfermedad genetica son transferidos al utero materno. El DGP ha permitido estudiar varios aspectos del desarrollo temprano del embrion y la genetica reproductiva, sin embargo tambien ha suscitado debates eticos en diferentes paises a cerca de las tecnicas en reproduccion humana asistida. [Serrano CJ. Diagnostico genetico preimplantacion: una alternativa hacia el futuro en el presente. MedUNAB 2005; 8(2):82-88].

Palabras clave: Diagnostico genetico preimplantacion, Tecnicas de reproduccion asistida, Biopsia embrionaria.

Summary

Preimplantational genetic diagnosis: an actual alternative with future implications. Preimplantational genetic diagnosis (PGT) is a new technique, promoted as an alternative for prenatal diagnosis and eventually for the voluntary termination of pregnancy when the couple is willing . Essentially, they are afraid that a genetic disease may be transmitted to their descendents. After the assisted reproduction techniques have been applied, an embryo biopsy is conducted, extracting two of the blastomeres, which are genetically analyzed. Those embryos free from genetic diseases are implanted in the mother uterus. PGT has also allowed the medical community to study different aspects of the early embryo development and the comprehension of reproductive genetics. However these new techniques have given rise to many ethical questions and debates about the moral consequences of routinely practicing PGT.

Key Words: Preimplantational genetic diagnosis; Assisted reproduction techniques.

Introduccion

El diagnostico genetico preimplantacion (DGP) es un procedimiento diagnostico clinico que aparece gracias a los avances en las tecnicas de reproduccion asistida (TRA), biologia molecular y el desarrollo del proyecto genoma humano. El DGP es una forma muy temprana de diagnostico prenatal: los oocitos o los embriones en su tercer dia de desarrollo son biopsiados en cultivo in vitro y estas celulas (cuerpo polar en el caso de oocitos y dos blastomeras en el caso de embriones) son analizadas para alteraciones geneticas especificas. (1, 2) Tras el diagnostico, solo los embriones libres de enfermedad son transferidos a la madre. Recientemente esta misma tecnologia ha sido aplicada para mejorar las tasas de embarazo en parejas con perdida recurrente de la gestacion o fallas repetidas de implantacion realizando un tamizaje de las aneuploidias mas frecuentemente relacionadas a edad materna o aborto (DGP-SA screening aneuploidias). (1) Requiere de tecnologia de punta y personal altamente calificado lo que lo hace costoso y tecnicamente dificil. (3)

La primera aplicacion clinica del DGP utilizando TRA, biopsia de embriones en desarrollo y analisis genetico de una unica celula fue reportado ya hace mas de una decada por Allan Handyside (1990). Se realizo para la seleccion de embriones femeninos libres de enfermedad en parejas con condiciones ligadas al sexo. (4) Modernas tecnologias han sido implementadas en el desarrollo de nuevas aplicaciones para el DGP. En 1992 se reporto el primer nacimiento vivo y sano tras DGP para fibrosis quistica. (1) Lucena y colaboradores en 1994 realizan el primer DGP en Colombia para una pareja con hemofilia A. Staessen y colaboradores (1999) introdujeron la hibridacion in-situ .uorescente (FISH) en el DGP para determinar el sexo embrionario en condiciones ligadas al sexo demostrando mejores resultados que con la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). (5, 6) Se establecen criterios para calificar y evaluar las alteraciones numericas en embriones analizados por FISH disminuyendo la probabilidad de error. (7) Con el advenimiento comercial de diferentes sondas de FISH (8) Munne y colaboradores (1999,2000) desarrollan protocolos para deteccion de translocaciones. (5, 9) Asimismo, ocurren mejoras con la PCR, aparece la PCR-fluorescente y PCR-multiplex facilitando el diagnostico de nuevas enfermedades monogenicas y mejorando la seguridad de las pruebas. Asi pues, en la actualidad se recomienda la PCR como tecnica para diagnosticar enfermedades monogenicas y el FISH para la determinacion de alteraciones en numero o estructura de los cromosomas asi como para la determinacion del sexo. (2, 6, 10, 11) El DGP se ha venido implementado en un mayor numero de paises (20 hasta la fecha) (50 y es asi como en 1997 se crea el consorcio de DGP de la Sociedad Europea de Reproduccion Humana y Embriologia (ESHRE - European Society of Human Reproduction and Embriology) con el fin de realizar un estudio a largo plazo para evaluar eficacia y los resultados clinicos del DGP. (4, 5)

Esta revision pretende describir el estado actual del DGP y sus aplicaciones. Incluye algunas tecnicas clinicas y moleculares pertinentes para el mejor entendimiento del lector. Ademas se revisa la recomendacion etica de la aplicacion de DGP realizada por el grupo de trabajo de etica de la ESHRE. (12)

Procedimientos clinicos y embriologia

Estimulacion ovarica y captacion de oocitos. La estimulacion controlada de los ovarios con gonadotropinas exogenas lleva al reclutamiento de varios foliculos y este proceso es monitoreado por ultrasonido. Cuando el tamano y numero de los foliculos es el adecuado se induce la maduracion hormonal de los mismos. Posteriormente, entre 34 y 38 horas mas tarde, los oocitos son aspirados bajo guia ecografica con el liquido folicular. (13) Los oocitos son recuperados y transferidos a un medio adecuado para ser inseminados o fertilizados por microinyeccion con espermatozoides (ICSI). (14) El ICSI esta indicado en pacientes con espermiograma anormal, fallos previos con TRA y en aquellos casos de DGP en los que la PCR sea la tecnica empleada (enfermedades monogenicas) para impedir contaminacion con ADN paterno proveniente de espermatozoides atrapados en la zona pelucida evitando asi un diagnostico errado. (14) En los casos de DGP-SA o translocaciones se puede utilizar la fertilizacion in-vitro,2 sin embargo en algunos centros se prefiere el ICSI para evitar fallos de fertilizacion. El dia siguiente a la captacion de los oocitos se evaluan los embriones en busca de dos pronucleos que indiquen fertilizacion normal. Los embriones continuan en cultivo in vitro y en tercer dia de desarrollo aquellos morfologicamente normales y en evolucion son biopsiados.

El patron de herencia de las enfermedades monogenicas heredables, la calidad de los oocitos, la tasa de fertilizacion y el procedimiento de la biopsia embrionaria mejor influyen en la proporcion de embriones no afectados a transferir por lo que un ciclo de DGP exitoso esta relacionado con el numero de oocitos captados. (15) Se estima que el 70-80% de los oocitos captados son fertilizados. De estos, el 80-90% evolucionan adecuadamente para ser biopsiados y en el 95% de los casos se obtiene un resultado inequivoco. Si ademas tenemos en cuenta por ejemplo, que en enfermedades con herencia autosomica dominante el 50% de los embriones estan afectados, el numero de embriones candidatos a transferir es muy bajo. Vandervorst y cols15 reportan que aproximadamente el 20% de los oocitos captados dara lugar a embriones transferibles y que la posibilidad de un DGP exitoso aumenta si se captan mas de 9 oocitos.

Biopsia de cuerpo polar. El oocito maduro se caracteriza por la presencia de un primer cuerpo polar que contiene el complemento de 23 cromosomas maternos bivalentes. Esta estructura permite analizar el oocito para aneuploidias y translocaciones maternas antes de la fertilizacion. Esta tecnica presenta desventajas como; (2) (l) tecnicamente es dificil porque son estructuras muy pequenas y fragiles; (2) solo evalua la contribucion materna al genoma del embrion, y (3) su aplicacion es limitada ya que exclusivamente se podria utilizar cuando la madre es portadora de una enfermedad autosomica dominante, una translocacion o para DGP-SA. (16, 17)

Biopsia embrionaria. Es esencial determinar el momento del desarrollo embrionario que permita la remocion del mayor numero de blastomeras sin afectar el desarrollo futuro del embrion ni el potencial de embarazo. A partir del estadio de 16 celulas (Morula--dia 4) se empiezan a desarrollar uniones intercelulares (tight junctions) causando compactacion celular haciendo imposible la separacion de celulas individuales. (18-20) Ademas, las celulas han perdido su totipotencialidad y no se reconoceria el tejido embrionario del extraembrionario. La biopsia en el estadio de 2-4 celulas produce una reduccion notable de la masa celular interna del embrion causando efectos adversos en su potencial desarrollo. (19) Sin embargo, en el estadio de 8- 12 celulas (dia 3) las celulas son totipotenciales y tienen la capacidad de remplazar 1 o 2 blastomeras. (19, 20) En humanos la biopsia de 1 de 4, 2 de 8 o 3 de 8 blastomeras (21) no afecta el desarrollo in vitro hasta blastocisto siendo esta de 40%, sin embargo se desconoce la capacidad de implantacion de embriones con masa celular reducida. En las figura 1 y 2 se observa un embrion en su tercer dia de desarrollo y su evolucion hasta blastocisto. Van de Velde y cols (22) en su estudio retrospectivo demuestran que la remocion de dos celulas de un embrion en estadio >7 celulas no disminuye la tasa de embarazo (29.1%) ni la tasa de implantacion (18.6%) despues del DGP. Las tasas fueron similares a las obtenidas tras la remocion de una celula aunque aclaran que los ciclos no se pueden comparar ya no fueron aleatorizados. Asi pues, abogan por la biopsia y analisis de dos blastomeras para mejorar las limitaciones de la PCR y FISH y ofrecer un diagnostico mas seguro y confiable, ya que solo hay transferencia cuando el resultado es concordante en ambas celulas. (23- 25) Existen diferentes tecnicas para realizar la biopsia. (26- 30) La perforacion de la zona pelucida para la remocion de las blastomeras se realiza por medios quimicos, mecanicos o laser. En la figura 3 se observa la zona pelucida perforada y la extraccion de una blastomera. Joris et al (31) realizan un estudio comparando el uso de acido tyrodes vs. laser en el tratamiento de la zona pelucida. Concluyen que el uso del laser para DGP es un procedimiento mas sencillo y resulta en mas blastomeras intactas. Se obtienen tasas similares de embarazo, sin embargo se requiere de mas estudios para evaluar los efectos termicos del laser.

[FIGURA 1-3 OMITIR]

Criopreservacion embrionaria despues de la biopsia.

La criopreservacion de los embriones no transferidos y de buena morfologia es en la actualidad rutina en los centros de reproduccion asistida. Sin embargo, la congelacion de embriones biopsiados no es tan sencilla ya que la zona pelucida ha sido perforada. (32, 33) En la actualidad existen reportes en la literatura de tecnicas que permiten tasas de embarazo e implantacion similares a las del DGP, aun asi faltan mas estudios que lo corroboren. (34)

Aplicaciones clinicas del DGP

Segun los datos recolectados por el consorcio de DGP de la Eshre, las causas mas frecuentes de remision para DGP son el riesgo genetico elevado y objecion a la interrupcion voluntaria del embarazo. Aproximadamente el 25% de las parejas que realizan ciclos con TRA lo combinan con DGP. Otras causas de remision fueron la perdida recurrente de la gestacion o fallo repetido de implantacion con TRA. (4, 5)

Enfermedades monogenicas. El DGP supone varias

dificultades tecnicas para realizar el diagnostico ya que a diferencia del diagnostico prenatal convencional la cantidad de ADN es limitada y muy poca (una unica celula), no se pueden confirmar las pruebas ni repetir y el tiempo, los resultados se deben obtener en 12-48 horas ya que la transferencia debe realizarse en el dia 5 de desarrollo en el estado de blastocisto. En la actualidad existen mas de 30 enfermedades monogenicas que se pueden diagnosticar por DGP utilizando PCR. En la tabla 1 se exponen las enfermedades mas frecuentes segun los datos de ESHRE.

Las tasas de embarazo e implantacion varian de acuerdo a la enfermedad y al tipo de herencia. De acuerdo a los datos recolectados por el consorcio de DGP durante tres anos (1998-2000), en los casos de DGP el 65% de los oocitos fueron fertilizados, el 99% de los embriones fueron biopsiados y en el 82% de ellos se obtuvo un diagnostico claro. La tasa de embarazo fue 25% por embrion transferido. Se han reportado cinco diagnosticos errados utilizando PCR, de los cuales dos fueron por seleccion de sexo por lo que esta tecnica es considerada obsoleta para este fin. (24, 35)

Condiciones ligadas al sexo. Cuando no existe un protocolo especifico de PCR se considera apropiado hacerlo a traves de la seleccion de sexo, se eligen embriones femeninos sanos o portadores de la enfermedad a traves de FISH. Las condiciones mas frecuentemente reportadas por la ESHRE estan detalladas en la tabla 1. En promedio, el 50% de los embriones en un ciclo de DGP-seleccion de sexo no seria apto para ser transferido sobre la base del sexo solamente. Es importante tener en cuenta que sobre esta misma base el 50% de los embriones masculinos seria sano pero descartado, un hecho que suscita critica y controversia. La tasa de embarazo es similar a la de enfermedades monogenicas, 23% por embrion transferido. (5, 36, 37)

Translocaciones balanceadas. Las translocaciones reciprocas, en las que ocurre intercambio de dos segmentos terminales entre dos cromosomas diferentes, son la alteracion cromosomica mas comun y se presenta en 1 de cada 500 nacidos vivos. (380 Con muy pocas excepciones, la translocacion es propia de la familia o el individuo que la presenta. Las translocaciones Robertsonianas, (39) fusion centrica de dos cromosomas acrocentricos, ocurren en 1 de cada 1.000 individuos. Munne y colaboradores9 reportan una incidencia de 0,6% en parejas infertiles, 3,2% en parejas con >10 ciclos fallidos con TRA y aumenta hasta 9,2% en parejas con >3 abortos consecutivos en el primer trimestre. La mayoria de estos individuos son fenotipicamente normales y consultan por infertilidad, perdida recurrente de la gestacion o el nacimiento de un nino con anomalias congenitas. El DGP para translocaciones reduce significativamente la tasa de aborto espontaneo en estos pacientes de 25% al 9%;9 sin embargo, el problema es la cantidad de embriones disponibles para transferir ya que en la mayoria de los casos mas del 50% de estos son anormales. La tasa de embarazo por embrion transferido puede llegar al 38%. (23,36,37) En la actualidad existen diferentes sondas de FISH disponibles comercialmente para analizar practicamente cualquier translocacion.

Deteccion de aneuploidias - DGP-SA. Esta es la principal indicacion para DGP en el mundo sin embargo su verdadera utilidad clinica esta por definirse. (40- 42) Los estudios cromosomicos clasicos realizados en material de aborto espontaneo muestran una incidencia de anomalias cromosomicas que oscila entre el 50% y 70%. Asi pues, los casos de edad materna avanzada, perdida recurrente de la gestacion y fallos repetidos en TRA podrian indicar que la infertilidad es causada por la produccion aneuploide de gametos. Los embriones biopsiados son analizados con FISH para siete cromosomas (13,16,18,21,22, X y Y) en busca de alteraciones numericas. (43) Gianaroli y colaboradores36 reportan una tasa de embarazo de 29% por embrion transferido y 23% de bebe sano en casa por paciente en 828 ciclos de DGP-SA. El porcentaje de embriones anormales aumenta proporcionalmente a la edad materna, desde 63% en mujeres de 36-37 anos hasta 81% en aquellas de 43 anos y mayores. Asimismo, las tasas de bebe sano en casa disminuyen, de 25% a 7% en mujeres de 43 anos. Las trisomias fueron la anormalidad mas frecuente representando el 22% de ellas. La frecuencia de aneuploidia en los cromosomas 13,15,

16, 21 y 22 aumenta en relacion con edad materna a diferencia de los cromosomas 18,X y Y que no guardan relacion con la edad. (44) Las parejas con perdida recurrente de la gestacion evaluadas por Gianarolli mostraron 59% de sus embriones anormales y la distribucion de las anormalidades cromosomicas fue diferente a el grupo de edad materna avanzada, con monosomias y defectos complejos que sugieren disfuncion en los procesos o estructuras al inicio de la division del ciclo celular. Munne 37 concluye en su revision que el DGP-SA reduce el riesgo de hijos trisomicos, aumenta las tasas de implantacion y disminuye los abortos espontaneos. En el primer estudio randomizado y controlado de DGP por edad materna avanzada realizado por Staessen y cols45 en 400 parejas demuestra que no existe beneficio claro del DGP-SA en mujeres mayores de 37 anos cuando no existe restriccion en el numero de embriones a transferir, no encontraron diferencias significativas en las tasas de bebe sano en casa ni reduccion en las tasas de aborto espontaneo.

Embarazos y resultado perinatal

El numero total de embarazos registrados durante el ano 2000 por la ESHRE es 309, con 406 sacos gestacionales. (5) Reportan una tasa de aborto clinico de 11% durante el primer trimestre. Tres embarazos fueron terminados por error en el diagnostico confirmado durante estudios prenatales. Se presentaron complicaciones en el 33% de los embarazos y como era de esperar en mayor proporcion en los multiples. Las complicaciones mas frecuentes fueron el parto Pretermino y prematuro y la ruptura prematura de membranas (RPM). La mortalidad perinatal fue del 16 por 1.000 nacimientos, se explica tan elevada probablemente por los embarazos multiples (30%). No existe un incremento de malformaciones congenitas, la incidencia fue de 3% comparable con la poblacion general. Se confirmaron errores diagnosticos en el 1.8% de los casos, con una mayor incidencia en aquellos donde se empleo PCR (3.4%) que donde se utilizo FISH (0,9%).

Consideraciones eticas del DGP

Dadas las dificultades en definir adecuadamente "enfermedad" y "anormalidad" y determinar lo que constituye un verdadero riesgo genetico, la ESHRE recomienda un manejo multidisciplinario de esta tecnologia, en donde la consejeria genetica debe ser parte integral de la misma. (12)

Principios eticos fundamentales. Bienestar del nino.

Esta nueva tecnologia puede justificarse refiriendose al bienestar del nino, ya que se va a evitar una enfermedad discapacitante. Principio de Autonomia. La aplicacion del DGP aumenta la autonomia de los padres ya que les ofrece una opcion adicional, elegir una tecnica que se ajuste mejor a sus principios morales y a sus necesidades disminuyendo la carga psicologica de otras opciones, y favoreciendo el bienestar y la salud de su futuro hijo. Los pacientes deben ser informados y recibir una asesoria adecuada previo a cualquier procedimiento, debe incluir las posibilidades de exito y fracaso, tasas de embarazo y complicaciones.

Problemas especificos. Existen diferencias sustanciales en el control y regulacion del DGP a nivel mundial. Estas estan relacionadas con las diferentes posturas frente a la reproduccion asistida, procedimientos invasivos en embriones humanos y la eugenesia en la seleccion de embriones sanos. El DGP apenas recientemente fue aprobado en Francia mientras que esta prohibido en Alemania, Italia, Suiza y Taiwan, entre otros. (46) En los apartados siguientes se evaluan diferentes situaciones.

1. Deteccion de portadores y transferencia embrionaria. El argumento crucial para no transferir embriones portadores de enfermedad no es la eugenesia, es el deseo de evitarle al futuro hijo la toma decisiones complejas como la que en el momento toman sus padres. (47) El riesgo para el nino depende del tipo de enfermedad. Si el nino es portador de una enfermedad autosomica recesiva, el riesgo de que sus hijos vayan a estar afectados es de 1%, a diferencia de los hijos hombres de mujeres portadoras de condiciones ligadas al sexo que es del 50%. En ultimas, la recomendacion es que debe ser la pareja quien decida en caso de existir embriones portadores y sanos que embriones se transfieren. En todas las ocasiones los embriones portadores no transferidos deben ser criopreservados al igual que los sanos.

2. Enfermedades de inicio tardio. El DGP es aceptable para este tipo de enfermedades aunque existen dudas acerca del desarrollo de nuevas terapias en el futuro y durante el lapso de tiempo entre el nacimiento del nino y el comienzo de la enfermedad. Es importante tener en cuenta la severidad de la enfermedad y los efectos sobre la calidad de vida en el futuro.

3. DGP-SA. El objetivo de esta tecnica es mejorar las tasas de embarazo en mujeres con fallos repetidos de TRA, en mujeres mayores de 37 anos y aquellas con abortos a repeticion. Sin embargo, se requiere de estudios aleatorizados y controlados que demuestren claramente sus beneficios.

4. Tipificacion de HLA. La tipificacion de HLA permitiria a los padres de un nino con una enfermedad hematopoyetica letal tener otro hijo donante para salvar la vida de su primer hijo. Esta solucion es moralmente aceptable si la unica razon para tener este otro hijo no es la de ser donante y siempre que la intervencion no ponga el riesgo la vida del donante.

5. Transferencia de embriones afectados. Existen casos de parejas que desean que su hijo tenga la misma condicion que ellos para que se adapte mejor al medio. Sin embrago, esto no es aceptable ya que la adaptacion a la sociedad se veria dificultada, ademas no cumple con el principio de beneficencia del nino ni con la finalidad del DGP.

6. Seleccion de sexo por razones no medicas. En este punto la ESHRE no ha logrado llegar a un acuerdo. Existen dos posiciones, una en contra que lo considera discriminacion sexual y otra posicion a favor, que lo considera una opcion para casos de balanceo familiar. (48, 49)

En conclusion, las tecnicas de reproduccion asistida y el DGP deben ser discutidos y la informacion debe ser dada al paciente para que sean ellos quienes tomen las decisiones. El DGP debe ser aplicado de forma segura y de acuerdo a las reglas de una practica clinica buena. (50) Existe aun el debate etico. En el mundo coexisten paises en donde no es permitido realizar DGP bajo ninguna condicion, otros en donde hay algunas restricciones (seleccion de sexo) y otros donde no hay restriccion o no hay legislacion al respecto. En Colombia aun no esta legislada la reproduccion asistida ni el DGP.

Conclusiones

El DGP es una forma muy temprana y especializada de diagnostico prenatal. El analisis de los ciclos de DGP realizados hasta la fecha demuestra el valor clinico del DGP en: (1) prevencion de enfermedades geneticas en parejas con riesgo de transmitir estas enfermedades a su descendencia; (2) reduccion del riesgo de aborto en parejas con translocaciones; (3) mejora el pronostico reproductivo con TRA en parejas de muy mal pronostico y edad ma- terna avanzada cuando existe restriccion en el numero de embriones a transferir, y (4) mejora el pronostico reproductivo con TRA. Parece evidente que el aumento en la demanda del DGP sera por parte de parejas infertiles que buscan aumentar sus posibilidades de embarazo con TRA, disminuyendo a la vez la probabilidad de un hijo con una aneuploidia relacionada con edad avanzada. Aun existen muchas limitaciones como el numero de cromosomas evaluados y la cantidad de ADN para realizar las pruebas, el mosaicismo embrionario y nuevas tecnicas de biologia molecular que disminuyan el riesgo de error en el diagnostico y mejoren las condiciones de los embriones en cultivo, entre otras. Es factible que en un futuro los avances en biologia molecular nos permitan evaluar todo el complemento de cromosomas. El gran reto sera poder regular las aplicaciones del DGP por razones medicas y limitar o prevenir su uso con propositos eugenesicos.

Articulo recibido: 17 de abril de 2005; aceptado: mayo 28 de 2005.

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* Directora cientifica, Genetix Laboratorio de Genetica Reproductiva. Correpondencia: Dra Serrano, Calle 123 # 8-30 Consultorio 402-403, Bogota, Colombia. E-mail: genetix@etb.net.co
Tabla 1. Indicaciones para DGP-PCR

Modo de herencia         Indicacion

Autosomica dominante     Distrofia miotonica
                         Enfermedad de Huntington
                         Charcot Marie Tooth 1A
                         Charcot Marie Tooth 2A
                         Neurofibromatosis
                         Esclerosis tuberosa
                         Sindrome de Stickler
                         Sindrome de Crouzon
                         Osteognesis imperfecta I y IV

Autosomica recesiva      Fibrosis quistica
                         Beta talasemia
                         Atrofia muscular espinal
                         Anemia de celulas falciformes
                         Enfermedad de Gaucher
                         Epidermolisis bullosa

Ligado al X              Distrofia muscular de Duchenne/Becker
                         Hemofilia A
                         Sindrome de X fragil
                         Sindrome de Alport
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Title Annotation:Revision de tema
Author:Serrano Serrano, Claudia Juliana
Publication:MedUNAB
Date:Aug 1, 2005
Words:5752
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