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Diagnostico e estudo sorologico da infeccao pelo parvovirus canino em caes de Passo Fundo, Rio Grande do Sul, Brasil.

Diagnosis and serological study of canine parvovirus infection in dogs from Passo Fundo, Rio Grande do Sul, Brazil

INTRODUCAO

A parvovirose canina e uma das mais importantes infeccoes virais de caes jovens. Clinicamente, a enfermidade manifesta-se por febre, vomitos, diarreia, frequentemente hemorragica, rapida desidratacao e alta mortalidade. O agente etiologico da parvovirose canina e um virus DNA, nao-envelopado, pertencente a familia Parvoviridae, genero Parvovirus (MURPHY et al., 1999), denominado parvovirus canino Ciencia Rural, v.38, n.2, mar-abr, 2008. (CPV). Atualmente, existem dois parvovirus de caes: o CPV tipo 1, tambem denominado parvovirus diminuto dos caes (CnMV), sem importancia clinica definida nas gastrenterites, e o CPV-2, que apresenta tres subtipos -- CPV2a, CPV2b e CPV2c. O CPV2b e o mais prevalente na populacao canina e, consequentemente, utilizado em vacinais (TRUYEN, 2006).

Os sinais clinicos da infeccao sao tipicos e o diagnostico clinico da infeccao e apoiado por exames sanguineos nos quais predomina intensa leucopenia. No entanto, existem outros agentes causadores de gastrenterite e que frequentemente induzem erro no diagnostico e, consequentemente, podem sub ou superestimar a prevalencia da parvovirose em relacao a outras enfermidades com sinais clinicos semelhantes.

O diagnostico definitivo da parvovirose consiste na identificacao do CPV nas fezes de caes infectados, por meio de testes como a hemaglutinacao, o ensaio imunoenzimatico, a aglutinacao em latex (VEIJALAINEN et al., 1986), a reacao em cadeia da polimerase (PCR) (MOCHIZUKI et al., 1993; UWATOKO et al., 1995) e o isolamento viral (VI) em cultivo celular (MOCHIZUKI & HASHIMOTO, 1986). Embora o isolamento em cultivo celular seja considerado o teste padrao, a PCR e a HA tem sido amplamente utilizadas principalmente pela alta especificidade e praticidade destes testes.

As gastrenterites de caes jovens sao comuns em todas as regioes do Brasil (GARCIA et al., 2000). No entanto, na cidade de Passo Fundo e regiao, nao se tem conhecimento de dados relativos ao diagnostico, a soroprevalencia e ao genotipo prevalente do CPV. O presente trabalho teve como objetivo identificar o CPV em fezes de caes jovens com diarreia, utilizando as tecnicas de HA e PCR, comparar a sensibilidade e a praticidade de utilizacao dessas tecnicas de diagnostico, verificar variacoes fenotipicas entre o CPV vacinal e isolados de campo e avaliar a prevalencia de anticorpos anti-CPV em caes sem historico de vacinacao na cidade de Passo Fundo, RS.

MATERIAL E METODOS

Foram analisadas 30 amostras fecais de caes com diarreia, coletadas entre dezembro de 2004 e marco de 2005, diluidas (1:10 v/v) em solucao de Hank's (pH 7,3). Apos centrifugacao (1500 x g/10 minutos), o sobrenadante foi removido e tratado com cloroformio (1:10 v/v) a 4[grados]C, por dez minutos. Apos nova centrifugacao, o sobrenadante foi aliquotado e estocado a -10[grados]C ate o momento das analises. Amostras de sangue de 185 caes de diferentes idades e racas, sem historico de vacinacao, foram coletadas em 14 diferentes bairros do municipio de Passo Fundo, durante a campanha de vacinacao anti-rabica de agosto de 2005. Anteriormente a coleta, aplicou-se um questionario epidemiologico e animais com historico de vacinacao contra CPV foram excluidos da amostragem. O sangue foi armazenado sob refrigeracao ate o momento da centrifugacao (3000 x g, 10 minutos) para remocao do soro, que foi armazenado a -20[grados]C ate ser testado.

O teste de hemaglutinacao (HA) foi utilizado para identificar e quantificar o CPV. Para isso, utilizaramse placas de 96 cavidades com fundo em "U", nas quais realizaram-se diluicoes seriadas (base 2) da suspensao fecal em igual volume de solucao salina tamponada de borato (BBS; [H.sub.3]B[O.sub.3] 0.5 M, NaOH 1.0M e NaCl 0.15 M, pH 9.0) contendo 2% de soro fetal bovino (SFB). Apos isso, acrescentou-se uma suspensao de eritrocitos de suino a 0,5% em diluente viral (VAD; NaCl 0.15 M, [Na.sub.2]HP[O.sub.4] 0.3M, Na[H.sub.2]P[O.sub.4].H2O 0.3M, pH 6.0) e incubouse a 4[grados]C durante duas horas (CARMICHAEL et al., 1980). Considerou-se como titulo viral da amostra a reciproca da maior diluicao onde ocorreu a hemaglutinacao.

O teste de inibicao da hemaglutinacao (HI) foi realizado para detectar anticorpos anti-CPV. Para tanto, realizaram-se diluicoes seriadas (base 10) do soro (inativado a 56[grados]C e tratado com caolin a 25% e hemacias de suino a 50%) em igual volume de BBS, contendo 2% de SFB. Posteriormente, acrescentaram-se oito unidades HA (UHA) da amostra viral e incubou-se a placa em camara umida a 37[grados]C, durante duas horas. Apos, adicionou-se uma suspensao de hemacias de suino a 0,5% em VAD, seguida de incubacao a 4[grados]C por duas horas (SENDA et al., 1986). O titulo de anticorpos foi considerado a reciproca da maior diluicao que inibiu a HA. A tecnica de HI tambem foi utilizada para confirmar a identidade do CPV nas amostras fecais.

O soro hiperimune anti-CPV foi produzido em cobaias (Cavia porcellus) utilizando-se uma amostra vacinal e duas amostras de campo (UPF-06 e UPF-10). A primovacinacao das cobaias foi realizada com uma mistura de virus (1ml) e adjuvante completo de Freund (1ml), inoculada pela via subcutanea em 10 pontos distintos no dorso do animal (0,2ml/inoculacao). Foram realizadas duas inoculacoes posteriores, com intervalo de 21 dias, sem adjuvante. As amostras sanguineas foram coletadas das cobaias, sob anestesia, por meio de puncao cardiaca, sete dias apos a ultima inoculacao. O soro hiperimune foi inativado (56[grados]C/30 min.), diluido (1:5 v/v) em BBS e tratado com caolin a 25% em BBS e hemacias de suino a 50% em VAD.

A Inoculacao em cultivo celular foi realizada em celulas CRFK (Crandell-Reese Feline Kydney; ATCC, CCL-94) cultivadas com meio essencial minimo (MEM), suplementado com 5% de SBF (soro bovino fetal) e gentamicina (50mg [L.sup.-1]). As amostras fecais suspeitas para CPV foram inoculadas imediatamente apos o repique das celulas, em placas de 24 cavidades. As celulas foram observadas por 96 horas para verificar a ocorrencia de efeito citopatico (ECP). Na ausencia de ECP apos a primeira inoculacao, as celulas foram repassadas mais duas vezes antes de se descartar o material e considera-lo negativo para CPV.

Na reacao em cadeia da polimerase, os primers CPV3 (5'-GGGTGGAAATCACAGCAAC-3') e CPV4 (5'-AAATGGCCCTTGTGTAGACG-3') foram utilizados para amplificar um fragmento de 887 pares de base do gene que codifica as proteinas VP1/VP2 do CPV (NC_001539, GenBank; REED et al., 1988). Para a PCR, as amostras fecais ja processadas foram diluidas (1:20 v/v) em agua destilada esteril. A reacao da PCR conteve 10pmol de cada primer, 2,5mM de Mg[Cl.sub.2], 1 mM de dNTPs, tampao (1x) para a enzima, 5 U de Taq DNA Polimerase e 5ul da amostra fecal, em um volume final de 50ul. A mistura foi levada ao termociclador (Minicycler[TM] MJ Research) programado para uma desnaturacao inicial (95[grados]C/5min) seguida de 30 ciclos de desnaturacao (94[grados]C/1 min), anelamento (54[grados]C/1 min.) e extensao dos primers (72[grados]C/1 min) e anelamento final (72[grados]C/10min). Como controle positivo, utilizou-se a amostra vacinal e, como controle negativo, utilizou-se agua destilada. A analise dos fragmentos de DNA foi realizada por eletroforese em gel de agarose (0,8% em TBE), sendo fragmentos corados com brometo de etideo e visualizados sob a luz ultravioleta.

RESULTADOS

Os resultados obtidos com a HA foram comparados com aqueles obtidos pela PCR. Dentre as 30 amostras de fezes analisadas, nove (30%) aglutinaram hemacias de suinos, com titulo igual ou superior a 64 UHA, e apresentaram-se especificas para CPV quando submetidas ao teste de HI com soro hiperimune anti-CPV. Todas as amostras com titulo superior a 32 foram tambem positivas na PCR, resultando em um fragmento de DNA de aproximadamente 887 pares de bases. A amostra vacinal utilizada como controle positivo apresentou titulos medios de 256 UHA e reacao positiva na PCR. Nove amostras (30%) apresentaram titulos hemaglutinantes entre 2 e 32 UHA e foram consideradas negativas pelo teste de HA. Destas, seis foram positivas ao PCR. Doze amostras (40%) foram negativas ao teste de HA e pela PCR. Nos testes para determinacao da sensibilidade da PCR, foram positivas todas as diluicoes da cepa vacinal ate a diluicao de 1:262.144.

Os titulos de anticorpos dos soros hiperimunes especificos contra CPV homologos variaram de 2.560 a 20.480 unidades inibidoras da hemaglutinacao (UHI). No entanto, ao se testar esses soros hiperimunes contra CPV heterologos, obteve-se uma reducao significativa nos titulos de anticorpos dos soros hiperimunes (Tabela 1). No soro de caes, os titulos de anticorpos anti-CPV variaram de zero a 20.480 UHI. A media geometrica dos titulos de anticorpos anti-CPV neste estudo foi de 892 UHI. Dentre os 185 soros de caes analisados, sete (3,8%) nao apresentaram titulos de anticorpos contra CPV e 178 (96,2%) foram positivos para anticorpos anti-CPV (Tabela 2). Os dados da prevalencia dos titulos de anticorpos anti-CPV estao apresentados na figura 1.

DISCUSSAO

Clinicamente, as gastrenterites de origem infecciosa apresentam um quadro clinico semelhante (HOMEM et al.,1999). Frequentemente, em caes com idade inferior a seis meses, a etiologia das gastrenterites hemorragicas e atribuida principalmente ao CPV em detrimento de outros microorganismos. Nessas circunstancias, sao frequentes as internacoes de caes jovens e com uma baixa imunidade materna, em isolamentos que possuem caes com suspeitas clinicas de cinomose, traqueobronquite infecciosa e/ou mesmo CPV. O diagnostico precoce e definitivo da etiologia das gastrenterites caninas torna-se essencial para o tratamento e controle da disseminacao do agente etiologico, principalmente se o CPV estiver envolvido, e para a alocacao adequada de caes com outras infeccoes gastroentericas. Nesse aspecto, a PCR vem sendo utilizada como metodo eficaz para o diagnostico de inumeras doencas de etiologia viral. Estudos anteriores demonstram que a PCR e mais especifica e sensivel para a deteccao de CPV em fezes de caes, quando comparada com HA, ELISA e isolamento viral (MOCHIZUKI et al., 1993). Os dados obtidos no presente estudo corroboram esses dados e indicam que tanto a PCR quanto a HA sao tecnicas especificas e rapidas para a deteccao de CPV em amostras fecais. Alem disso, utilizando-se a PCR, foi possivel detectar particulas virais ate a diluicao de 1: 262.144 de uma amostra vacinal contendo 256 UHA, o que evidencia a extrema sensibilidade da PCR em comparacao com a HA (dados nao apresentados).

No presente estudo, as mesmas amostras utilizadas para PCR foram tambem inoculadas em cultivo de celulas CRFK. Amostras fecais com alto titulo hemaglutinante apresentaram efeito citopatogenico (ECP) 24 a 36 horas apos a inoculacao. Amostras com baixo titulo viral necessitaram de passagens sucessivas e eventualmente nao foi possivel determinar a ocorrencia de ECP (dados nao apresentados). O insucesso no isolamento viral a partir de amostras com baixo titulo viral ocorre principalmente em razao de o CPV replicar somente em celulas mitoticamente ativas, ou seja, logo apos o repique celular. Consequentemente, apos a formacao do tapete celular, e possivel que nao se obtenha mais um numero suficientemente grande de celulas em replicacao para suportar a replicacao viral, possibilitando a perda do inoculo por diluicao.

Uma ocorrencia de HA nas diluicoes de fezes abaixo de 1:64 pode eventualmente indicou que estas sejam negativas para CPV, devido a possibilidade da ocorrencia de aglutinacao inespecifica (CARMICHAEL, 1980). Nesse trabalho, no entanto, nao foi possivel estabelecer uma relacao entre gravidade da infeccao e titulo de HA. Por outro lado, pelo menos um caso de gastrenterite hemorragica resultou negativo para CPV em todas as tecnicas de diagnostico utilizadas, o que evidencia a necessidade de investigacao mais profunda de outras causas de diarreias hemorragicas. No presente trabalho, apenas 56,7% (17/30) das gastrenterites caninas foram causadas pelo CPV, o que demonstra que um diagnostico baseado apenas nos sinais clinicos certamente proporcionara um manejo incorreto do paciente e tratamento inadequado da doenca.

O estudo fenotipico por meio de soro hiperimune e HI cruzada permitiu identificar diferencas entre duas amostras de campo de CPV e uma amostra vacinal. Dados semelhantes foram observados anteriormente por soroneutralizacao cruzada utilizando soro hiperimune contra CPV-2 e CPV2b (PRATELLI et al., 2001). E possivel que essas diferencas fenotipicas sejam decorrentes de pequenas variacoes nos epitopos das proteinas estruturais dos virus, ocasionadas por discretas mutacoes geneticas (PARRISH et al., 1991; TRUYEN et al., 1995; SAGAZIO et al., 1998). Embora o significado dessa variabilidade ainda seja investigado, acredita-se que tenha importancia principalmente quando os filhotes, com imunidade passiva materna, sao desafiados com virus antigenicamente diferente, ou seja, um determinado titulo de anticorpos e suficientemente alto para proteger contra o desafio com o virus homologo, mas nao o suficiente para evitar uma infeccao por uma cepa heterologa, podendo causar doenca nesses caes (TRUYEN, 2006). No entanto, as possiveis diferencas entre essas cepas somente poderao ser identificadas atraves do sequenciamento genetico das amostras de CPV analisadas neste estudo.

Atualmente, com o uso de vacinas contra a parvovirose canina, a infeccao por CPV tem sido relativamente controlada. No entanto, os dados sorologicos obtidos neste estudo demonstram que 96,2% (178/185) dos caes analisados apresentaram titulos de anticorpos contra CPV vacinal entre 10 e 20.480 UHI, ressaltando-se que a maior prevalencia dos titulos, 22,5% (40/178), foi de 320 UHI. Estudos previos demonstram que caes com titulos de anticorpos contra CPV superiores a 80 UHI sao imunes a infeccao oronasal por CPV (POLLOCK & CARMICHAEL, 1982). Titulos de anticorpos abaixo de 80 UHI nao conferem protecao contra a infeccao por CPV, alem de interferiram na imunizacao ativa do animal (PRATELLI et al., 2001). Entre os caes estudados, 29 (15,6%) apresentam titulos de anticorpos abaixo de 80 (Tabela 2). A infeccao pelo CPV nesses animais pode se tornar um problema caso ocorra em uma femea em gestacao, manifestando-se na forma de abortos, ou em seus filhotes, que, devido a baixa quantidade de anticorpos anti-CPV da mae, nao recebem quantidades suficientes de anticorpos maternos via colostro e leite e se tornam, consequentemente, suscetiveis a infeccao antes de se iniciar um programa de vacinacao.

Em resumo, os dados obtidos no presente trabalho evidenciam a necessidade de um diagnostico diferencial rapido das gastrenterites caninas, que pode ser realizado pela HA ou pela PCR. Estudos fenotipicos sugerem possiveis diferencas genotipicas que deverao ser avaliadas por meio de sequenciamento genetico. Embora o CPV se encontre amplamente disseminado, uma parcela significativa de caes possui titulos de anticorpos nao protetores e alguns sao soronegativos, o que permite a continua circulacao do CPV e a manutencao do carater endemico dessa infeccao.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao MSc. Sergio Porto, do Bioterio da Universidade de Passo Fundo, RS, pela colaboracao na manipulacao dos animais de laboratorio, e aos academicos de Medicina Veterinaria que auxiliaram na coleta das amostras. LCK e bolsista PQ do CNPq (300259/2003-4).

Recebido para publicacao 13.10.06 Aprovado em 23.05.07

REFERENCIAS

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MOCHIZUKI, M.; HASHIMOTO, T. Growth of feline panleukopenia virus and canine parvovirus in vitro. Japanese Journal of Veterinary Science, v.48, n.4, p.841-844, 1986.

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MURPHY, F.A. et al. Veterinary virology. 3.ed. New York: Academic, 1999. 629p.

NUCLEOTIDE SEQUENCE DATABASE (GENBANK). NC_001539. 2000. Capturado em 05 mar, 2004. Online. Disponivel na internet http://www.ncbi.nlm.nhi.gov/pubmed.

PARRISH, C.R. et al. Rapid antigenic-type replacement and DNA sequence evolution of canine parvovirus. Virology, v.129, p.401-414, 1991.

POLLOCK, R.V.; CARMICHAEL, L.E. Maternally derived immunity to canine parvovirus infection: transfer, decline, and interference with vaccination. Journal of the American Veterinary Medical Association, v.180, n.1, p.37-42, 1982.

PRATELLI, A. et al. Canine parvovirus (CPV) vaccination: comparison of neutralizing antibody responses in pups after inoculation with CPV2 or CPV2b modified live virus vaccine. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, v.8, n.3, p.612-615, 2001.

REED, A.P. et al. Nucleotide sequence and genome organization of canine parvovirus. Journal of Virology, v.62, n.1, p.266-276, 1988.

SAGAZIO, P. et al. Antigenic characterization of canine parvovirus strain isolated in Italy. Journal of Virology Methods, v.73, n.2, p.197-200, 1998.

SENDA, M. et al. An improved hemagglutination test for study of canine parvovirus. Veterinary Microbiology, v.12, p.1-6, 1986.

TRUYEN, U. et al. Evolution of the feline-subgroup parvoviruses and the control of canine host range in vivo. Journal of Virology, v.69, n.9, p.4702-4710, 1995.

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Daisy Maria Strottmann (I) Gabriela Scortegagna (II) Luiz Carlos Kreutz (II) * Leonardo Jose Gil Barcellos (II) Rafael Frandoloso (II) Deniz Anziliero (II)

(I) Programa de Pos-graduacao do Instituto de Biologia Molecular do Parana, Curitiba, PR, Brasil.

(II) Laboratorio de Virologia e Imunologia, Hospital Veterinario, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinaria (FAMV), Universidade de Passo Fundo (UPF). Campus I, Bairro Sao Jose, CP 611, 99001-970, Passo Fundo, RS, Brasil. Fone/Fax: (54) 3316 8444/3316 8487. E-mail: lckreutz@upf.tche.br. *Autor para correspondencia.
Tabela 1 - Titulos de anticorpos dos soros hiperimunes, produzidos em
cobaias, anti-CPV vacinal, anti-UPF-06 e anti-UPF-10 contra os virus
CPV vacinal, UPF-06 e UPF-10, determinado por inibicao da
hemaglutinacao (HI) cruzada. O controle refere-se a amostra de soro
coletada antes da imunizacao.

                                Titulo dos soros (HI)
Antigeno
                Anti-CPV      Anti-UPF-06    Anti-UPF-10    Controle
                 vacinal

CPV-vacinal       20.480           2.560          40              0
UPF-06             1.280          10.240           1.280          0
UPF-10             1.280           5.120           2.560          0

Tabela 2 - Anticorpos hemaglutinantes anti-CPV, detectados em
amostras de soro de caes nao-vacinados coletadas em
agosto de 2005, no municipio de Passo Fundo, RS.

                                               No de soros/total
Titulo de anticorpos                             amostrado (%)

<10                                               7/185 (3,7)
[mayor que o igual a] 10
  [menor que o igual a] 40                       22/185 (11,9)
> 40 [menor que o igual a] 320                   84/185 (45,4)
> 320 [menor que o igual a] 2.560                65/185 (35,1)
> 2.560 [menor que o igual a] 20.480              7/185 (3,9)

                                              Media geometrica do
Titulo de anticorpos                         titulo de anticorpos

                                                     (IHA)
<10                                                     0
[mayor que o igual a] 10
  [menor que o igual a] 40                             30
> 40 [menor que o igual a] 320                        181
> 320 [menor que o igual a] 2.560                    1102
> 2.560 [menor que o igual a] 20.480                 7608

Figura 1 - Distribuicao percentual dos titulos de anticorpos, anti-CPV,
detectados pelo teste de inibicao da hemaglutinacao (HI) em 185
amostras de soro de caes nao-vacinados coletadas em agosto de 2005,
no municipio de Passo Fundo, RS.

10                       1,1
20                       2,8
40                       8,4
80                      14
160                     10,7
320                     22,5
640                     17,4
1280                     9,6
2560                     9,6
5120                     2,2
10240                    1,1
20480                    0,6

Nota: Tabla derivada de grafico de barra.
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Author:Strottmann, Daisy Maria; Scortegagna, Gabriela; Kreutz, Luiz Carlos; Gil Barcellos, Leonardo Jose; F
Publication:Ciencia Rural
Date:Mar 1, 2008
Words:3692
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