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Diagnostico de moquillo canino con la prueba Dot-ELISA.

Canine distemper Diagnosis using Dot-ELISA test

Introduccion

El distemper canino es probablemente la enfermedad viral y altamente contagiosa de mayor distribucion mundial. Es producida por un paramixovirus del genero morbilivirus. Para evitar esta enfermedad es necesaria la vacunacion anual que suele reducir pero no eliminar su aparicion. En la medida en que la poblacion se encuentre menos vacunada y existan mas perros callejeros, aumentara la presentacion de casos clinicos.

Aunque es una enfermedad bastante difundida y conocida, presenta ciertas dificultades en el diagnostico, es por esto que se hace importante las tecnicas del laboratorio y su respectiva interpretacion.

Es importante tener en cuenta la historia clinica, la evaluacion fisica y los paraclinicos para encontrar el diagnostico preciso. La enfermedad tiene variadas manifestaciones clinicas que van desde una infeccion respiratoria o gastrointestinal inespecifica, hasta una afeccion multisistemica con un alto indice de mortalidad e involucra al Sistema Nervioso Central. La enfermedad suele manifestarse de tres maneras: aguda, subaguda y cronica.

La infeccion aguda suele tardar de 6 a 15 dias entre los que se manifiesta con fiebre, anorexia y el cuadro hematico revela una leucopenia ligera, y evoluciona normalmente acompanada con signos gastrointestinales, respiratorios, deshidratacion y perdida de peso. Los signos que comprometen el sistema nervioso central se pueden evidenciar como: contracciones involuntarias, paralisis especialmente de miembros posteriores, convulsiones, sialorreas, movimientos masticatorios, miccion involuntaria y ceguera. Tambien es posible ver hiperqueratosis en las almohadillas plantares y en la nariz.

El diagnostico es posible realizarlo por medios hematologicos, aunque es dificil la observacion de las inclusiones intracitoplasmaticas tipicas del moquillo en linfocitos, monocitos y eritrocitos, en caso de verlos es diagnostico y la ausencia de estos no excluye la presencia del virus.

Existen tecnicas mas especificas como los son la serologia, Inmunofluoresencia indirecta (IFI), seroconversion, entre otros. El utilizado para este estudio, fue la prueba ImmunoComb[R] Canine Distemper util para la respuesta de anticuerpos IgM despues de la vacunacion o frente a la infeccion por el virus del moquillo canino.

El metodo diagnostico ImmunoComb se basa en una elisa o cromatografia rapida, donde los antigenos estan adheridos a la tarjeta plastica, la cual cuenta con 12 dientes que permiten la realizacion de 12 analisis simultaneos o de manera individual, en el se desarrolla el color plata que se hace mas evidente en caso de positividad.

El conocer la seroprevalencia de moquillo canino, mediante el diagnostico con la prueba serologica InmunoComb[R] IgM (Dot-ELISA), permite evidenciar el impacto que tiene la enfermedad en la poblacion canina atendida en el Hospital Veterinario "Diego Villegas Toro" de la Universidad de Caldas afectada con sintomatologia compatible, realizando la concordancia entre el diagnostico clinico y el diagnostico serologico.

Materiales y Metodos

Se tomo como poblacion todos los caninos del municipio de Manizales. La muestra obtenida incluyo 84 caninos en 2,5 anos, los cuales ingresaron al Hospital Veterinario "Diego Villegas Toro" de la Universidad de Caldas. Estos no presentaban plan de vacunacion y mostraban sintomatologia nerviosa, digestiva, respiratoria, ocular o cutanea, que hacen parte de los sistemas afectados por el virus.

A los animales muestreados se les realizo un examen clinico, se diligencio la historia clinica y se tomaron muestras de sangre en tubos vacutainer sin anticoagulante, por flebotomia de la vena cefalica, safena o yugular. Se conto con el consentimiento informado de los propietarios de las mascotas, y se siguieron las normas eticas para el manejo de animales establecidas en la Ley 84 de 1989 y las normas eticas para investigacion sin riesgo en comunidades, descritas en la resolucion del Ministerio de Salud No. 008430 de 1993.

Las muestras se enviaron al Laboratorio de Patologia Clinica del Hospital Veterinario "Diego Villegas Toro" de la Universidad de Caldas, donde se centrifugaron a 2600 rpm, durante 5 minutos para la obtencion de los sueros, los cuales se llevaron en tubos eppendorf a congelacion a -4[grados]C. Con un tiempo de conservacion maximo de 3 meses hasta completar las doce muestras de cada kit que permitieron hacer el diagnostico simultaneo. Cada muestra se etiqueto con el nombre del paciente y la fecha de la toma de la muestra. Se realizo este procedimiento hasta obtener la totalidad de las muestras de los ochenta y cuatro (84) caninos.

El diagnostico serologico se hizo con el kit serologico InmunoComb[R] IgM. Biogal Galed Labs. Esta prueba detecta anticuerpos de IgM contra moquillo canino. Tiene una especificidad del 95,5% y una sensibilidad del 93,1% para detectar IgM contra moquillo canino.

Se registro el numero de historia clinica para la identificacion del animal, la clasificacion de los signos clinicos y los resultados de la prueba serologica aplicada.

La serologia se realizo siguiendo las instrucciones del fabricante. El kit diagnostico InmunoComb[R] IgM contiene: una tarjeta plastica dentada donde se adhieren los anticuerpos del virus del moquillo presentes en el suero de pacientes positivos a infeccion, el plato de multicompartimentos donde se depositan las muestras de suero, pinzas para la manipulacion apropiada de cada kit y 12 tubos capilares para la recoleccion de las muestras de sangre. El kit trae una tarjeta calibradora, la cual se compara con el tono de color que se observa en la tarjeta dentada para especificar el estado de infeccion de acuerdo a la cantidad de anticuerpos presentes en la muestra. Entre mas definido es el color en la prueba, el diagnostico se hace cada vez mas positivo. La tarjeta calibradora trae una escala de deteccion de anticuerpos que va desde S0 a S6.

Los animales positivos a la serologia fueron aislados adecuadamente para realizar el tratamiento correspondiente a la infeccion, y por medio de su historia clinica y la informacion suministrada por el propietario, se analizaron las posibles causas de la infeccion.

El analisis estadistico se realizo por medio de correspondencia simple y de clasificacion jerarquica ascendente, tomando como variables activas las frecuencias de los complejos.

Por medio de una prueba de [ji al cuadrado] se contrastaron los diagnosticos clinicos y serologicos, y esta informacion se uso para calcular el coeficiente de concordancia Kappa (Pfeiffer, 2002).

Resultados y Discusion

En la Figura 1, se observan en el dendograma los individuos positivos al examen serologico con alteraciones en alguno de los sistemas, respiratorio, digestivo, nervioso, ocular y piel y sus anexos donde cada individuo es excluyente.

De acuerdo con el dendograma o arbol de clasificacion, se decidio dejar tres clases para que el corte presentara grupos de individuos mas homogeneos.

En la Figura 2, se observan las poblaciones de individuos clasificados por sistemas; se aprecia la relacion que tiene el complejo respiratorio con las alteraciones oculares y de piel, pero este a su vez es excluyente con el complejo digestivo y el complejo nervioso; estos tres complejos son independientes entre si.

[FIGURA 1 OMITIR]

[FIGURA 2 OMITIR]

En la Tabla 1, se observa el numero y el porcentaje de animales clasificados por razas y edades que fueron positivos a la prueba serologica InmunoComb[R] IgM. Con un nivel de significancia P-value=0,0903 indica que la raza y la edad son variables independientes al momento de analizar la presencia de los sintomas.

En la Tabla 2, se observa la relacion entre sexo y raza de los animales con resultado positivo a la prueba serologica InmunoComb[R] IgM. Con un nivel de significancia P-value=0,9793 indica que el sexo y la raza son variables independientes al momento de analizar la presencia de sintomas positivos.

En la Tabla 3, se observa la relacion entre sexo y edad de los animales con resultado positivo a la prueba serologica InmunoComb[R] IgM. Con un nivel de significancia P-value=0,0300 indica que la edad y el sexo son variables dependientes al momento de analizar la presencia de sintomas positivos.

En el analisis de las tablas de contingencia de las variables de raza, edad (Tabla 1), sexo y raza (Tabla 2), se determino que son independientes pero en el analisis sexo y edad (Tabla 3), el virus del moquillo canino se puede manifestar en cualquier raza, sexo y edad del animal siendo mas susceptibles los cachorros en los cuales la proteccion materna ha terminado y que no recibieron un plan vacunal adecuado, lo cual se relaciono con lo dicho por Leib & Michael (1997), donde expresan que el VMC puede afectar a cualquier edad, raza y sexo y puede ser diagnosticado tanto en perros vacunados como en no vacunados.

De los 47 caninos serologicamente positivos, 4 caninos eran mayores de 5 anos considerados perros gerontes, los cuales presentaron sintomatologia relacionada con el complejo nervioso. Los individuos mas jovenes presentaban alteraciones en alguno de sus complejos como el respiratorio, digestivo, afecciones en piel, ocular y en algunos casos tambien se presentaban afecciones en su sistema nervioso central, esto se relaciona con lo reportado por Don-jun An et al. (2007), en un estudio realizado en Corea. Los caninos infectados con el virus del moquillo canino podrian ser clasificados al menos en dos grupos clinicos, considerados como perros jovenes con signos asociados al sistema nervioso central, con sintomas respiratorios y/o gastrointestinales, y perros gerontes unicamente con signos del sistema nervioso central.

De acuerdo con lo reportado en las historias clinicas los signos mas comunes son hipertermia, postracion, anorexia, conjuntivitis e inapetencia. Estos signos clinicos presentados por los caninos muestreados y positivos al kit serologico, tienen semejanza con lo reportado por el investigador Arenas et al. (citados por Vadillo et al., 2002. p. 660-661.): "La forma mas comun de presentacion clinica suele iniciarse con abatimiento, postracion, estado febril de curva bifasica, conjuntivitis, opacidad y ulceras de la cornea e incluso suele presentarse aborto".

Las afecciones del sistema nervioso se evidenciaron por la presencia de mioclonos, movimiento pendular de la cabeza, marcha en circulos, paralisis de los miembros posteriores y convulsiones. Estos signos hallados en la presente investigacion concuerdan con lo informado por Ettinger & Feldman (2005). Las anormalidades neurologicas pueden reflejar lesiones en algun sitio del sistema nervioso central e incluyen lesiones, ataxia, hipermetria y paraparesia o tetraparesia. Los mioclonos, tambien generalizados o focales, son un signo clinico comun y sugiere fuertemente una infeccion del virus del moquillo canino, este virus produce secreciones al infectar los macrofagos en el tracto respiratorio alto y pulmones, el cual es transportado a los nodulos linfaticos y tonsilas en las primeras 24 horas. Segun lo reportado por Greene (2000), el primer pico febril se reduce durante varios dias hasta que se produce una segunda elevacion de la temperatura que dura menos de una semana, y donde la fiebre puede acompanarse de secrecion nasal serosa, ocular muco purulenta y anorexia; lo mencionado por el autor corresponde con lo encontrado en el presente estudio, donde 36 individuos tuvieron afecciones en su complejo respiratorio con secrecion nasal purulenta, tos, estornudos y algunos en numero reducido se auscultaron estertores crepitantes, la mayoria de animales con su tracto respiratorio alto afectado, pero al cabo de unos dias se recuperaban de la alteracion.

A nivel digestivo las alteraciones mas relevantes fueron vomito, diarrea que iban desde mucoides hasta sanguinolentas, lo cual se asemeja con lo expresado por los autores Arenas et al. (citados por Vadillo et al., 2002) en el sistema digestivo se presenta al comienzo de la infeccion vomito y diarrea que puede ser sanguinolenta o mucoide.

A nivel ocular se presento conjuntivitis, opacidad corneal, secrecion ocular purulenta; lo cual corrobora lo expresado por Jubb et al., (2007), quienes afirman que las lesiones oculares incluyen conjuntivitis, queratitis, retinitis, y neuritis optica. La conjuntivitis es muy comun en los estados tempranos de la enfermedad y ocasionalmente se extiende a la cornea causando una queratitis ulcerativa.

A nivel cutaneo la infeccion por moquillo canino puede acompanarse de hiperqueratosis del plano nasal y de las almohadillas plantares formando placas hiperqueratosicas en pulpejos (Wilkinson & Harvey, 1998). En los individuos que presentaron lesiones a nivel cutaneo en esta investigacion, el signo mas representativo fue la hiperqueratosis de almohadillas y plano nasal, y un numero alto de estos individuos que despues regresaron al Hospital Veterinario "Diego Villegas Toro" ya presentaba alteraciones a nivel del SNC, y los que ya presentaban alteraciones nerviosas ya tenian la hiperqueratosis, esto lo confirman Ettinger & Feldman (2005), quienes expresan que los perros que desarrollan lesiones pustulosas de piel son menos vulnerables al desarrollo de la enfermedad del SNC, que aquellos que exhiben hiperqueratosis del plano nasal y de las almohadillas digitales, los cuales con frecuencia se asocian a signos neurologicos. De acuerdo al mapa factorial de individuos y variables por complejos, se encontro la relacion que hay entre el complejo respiratorio con las alteraciones de piel y ocular. Los signos generales son comunes en cualquiera de los sistemas afectados; se observa la independencia que existe entre los sistemas respiratorio, digestivo y nervioso.

El indice de Kappa arrojo un resultado de 0,3 lo cual se interpreta como ausencia de relacion entre el diagnostico clinico y el diagnostico serologico (Pfeiffer, 2002).

Conclusiones

El Medico Veterinario Clinico no puede diagnosticar el virus de moquillo canino basandose unicamente en la presentacion de sintomas clinicos, para llegar a este diagnostico debe realizar pruebas de laboratorio especificas para la entidad.

Se confirma con los resultados obtenidos que el virus de moquillo canino se puede presentar en cualquier edad, raza y sexo; pero la correlacion sexo vs. edad estadisticamente fue dependiente, mientras que edad vs. raza y sexo vs. raza fueron completamente independientes.

Los complejos respiratorio, digestivo y nervioso fueron independientes entre si, pero el sistema cutaneo y ocular guardan una estrecha relacion con el sistema respiratorio; y los sintomas generales se presentan en cualquiera de los complejos anteriormente mencionados.

De acuerdo con el indice de Kappa, se concluye que hay ausencia de concordancia entre los diagnosticos realizados.

El kit InmunoComb[R] IgM se recomienda utilizarlo como prueba serologica diagnostica, aunque para proximas investigaciones se deben utilizar pruebas que evaluen preferiblemente antigenos y no anticuerpos.

Referencias Bibliograficas

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Sergio Eduardo Linares-Villalba (1), Adriana Maria Correa-Salgado (1), Luis Harby Velasquez-Garzon (1)

(1) Departamento de Salud Animal, Universidad de Caldas, Manizales, Colombia.

sergio.linares@ucaldas.edu.co

(Recibido: abril 15, 2010; aprobado: junio 20, 2010)

* Financiado por la Vicerrectoria de Investigaciones y Postgrados de La Universidad de Caldas.
Tabla 1. Numero y porcentaje de animales clasificados
por razas y edades positivos a la prueba serologica
InmunoComb[R] IgM. P-value=0,0903.

         < a 1 ano   1 - 5 anos   > a 5 anos   TOTAL

MESTIZO     14           12           4          30
           2979%       25,53%       8,51%      63,83%
OTROS       13           4            0          17
          27,66%       8,51%        0,00%      36,17%
TOTAL       27           16           4          47
          57.45%       30,04%       8,51%       100%

Tabla 2. Relacion entre sexo y raza
de los animales con resultado positivo
a la prueba serologica InmunoComb[R]
IgM. P-value=0,9793.

          MACHO    HEMBRA   TOTAL

MESTIZO     16       14       30
          34,04%   29,79%   63,83%
OTROS       9        8        17
          19,15%   17,02%   36,17%
TOTAL       25       22       47
          53,19%   46,81%    100%

Tabla 3. Relacion entre sexo y edad de
los animales con resultado positivo a
la prueba serologica InmunoComb [R] IgM.
P-value=0,0300.

             MACHOS   HEMBRAS   TOTAL

< a 1 ano      16       11        27
             34,04%   23,40%    57,45%
1 - 5 anos     5        11        16
             10,64%   23,40%    34,04%
> a 5anos      4         0        4
             8,51%     0,00%    8,51%
TOTAL          25       22        47
             53,19%   46,81%     100%
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Author:Linares-Villalba, Sergio Eduardo; Correa-Salgado, Adriana Maria; Velasquez-Garzon, Luis Harby
Publication:Veterinaria y Zootecnia
Article Type:Report
Date:Jul 1, 2010
Words:3147
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