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Determinacion del potencial de membrana mitocondrial mediante citometria de flujo durante el proceso de criopreservacion de espermatozoides epididimarios de alpacas.

Determination of mitochondrial membrane potential by flow cytometry during the cryopreservation process of epididymal alpaca spermatozoa

INTRODUCCION

El empleo de biotecnologias reproductivas viene permitiendo lograr animales geneticamente superiores, asi como reducir el tiempo generacional en varias especies de interes ganadero. Sin embargo, la complejidad en las caracteristicas fisiologicas reproductivas de la alpaca no ha permitido la utilidad deseada en esta especie (Fernandez-Baca, 1993). Para su mejora productiva se requiere la distribucion de material genetico de alta calidad hacia distintas areas geograficas que puedan beneficiarse con la obtencion de crias mejoradas. Es asi que se necesita evaluar diversos parametros del material genetico; entre ellos, el volumen, pH, motilidad, concentracion, morfologia y viabilidad espermatica. Actualmente, un nuevo parametro a utilizar es el potencial de membrana mitocondrial (PMM) de los espermatozoides, el cual podria ser un indicador directo de motilidad e indirecto de capacidad fecundante (Manosalva et al., 2005). El interes en evaluar la actividad mitocondrial deriva de su importancia en la produccion de adenosina-tri-fosfato (ATP), producido por fosforilacion oxidativa y necesario para la motilidad y la fecundacion (Andrade, 2005).

Recientemente, la tecnica de citometria de flujo ha ofrecido una mayor precision en la forma de medir la calidad del semen (Hallap et al., 2005), incluyendo la determinacion del porcentaje de espermatozoides con alto PMM como parametro en diversas especies, ademas de la alpaca (Cheuqueman et al., 2013). Una de las tinciones especificas para mitocondrias es el MitoTraker[R] Deep Red, cuyas moleculas se difunden a traves de la membrana plasmatica y se unen especificamente a los lipidos de membrana de las mitocondrias funcionales. Las principales ventajas son que presentan especificidad, fotoestabilidad, y elevada sensibilidad al ser incorporado en distintos protocolos.

Reportes de la literatura cientifica indican que Santiani et al. (2016) evaluaron el PMM en espermatozoides frescos epididimarios de alpaca con los fluorocromos MitoTracker[R] Deep Red y MitoTracker CMXRos, asi como el trabajo de Cheuqueman et al. (2013), quienes evaluaron el PMM en muestras de eyaculado de alpacas utilizando el fluorocromo JC-1. Adicionalmente, se tiene el reporte de Santiani et al. (2015) donde evaluaron muestras descongeladas epididimarias de alpaca, utilizando en este caso el fluorocromo MitoTracker CMXRos. Sin embargo, se desconoce el efecto de la criopreservacion sobre el PMM en espermatozoides de alpaca. Se ha demostrado que la criopreservacion afecta negativamente diversos parametros del funcionamiento espermatico, por lo que podria esperarse que el porcentaje de espermatozoides con alto PMM se vea afectado por este proceso (Castelo et al., 2008). Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue determinar, mediante la citometria de flujo, el efecto del proceso de criopreservacion sobre el porcentaje de espermatozoides de alpaca con alto PMM.

MATERIALES Y METODOS

Muestras

Las muestras se obtuvieron del Camal Municipal del Distrito de Ninacaca, departamento de Pasco, Peru, y se procesaron en el Laboratorio de Reproduccion Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, durante el ano 2016.

El tamano muestral se calculo utilizando la formula n = (2[([Z.sub.[alfa]]+[Z.sub.[beta]]).sup.2]* [S.sup.2]/[d.sup.2], considerando un valor de [Z.sub.[alfa]] de 1.645, [Z.sub.[beta]] de 1.282, [S.sup.2]=19% y d=15%, lo cual dio como resultado una n de 41 testiculos. Los testiculos se recuperaron luego del beneficio de los animales, se lavaron con solucion fisiologica (NaCl 0.9%) y se colocaron en bolsas hermeticas individuales junto con la solucion fisiologica. Se almacenaron en cajas transportadoras, utilizando un gel refrigerante para mantener la temperatura a 5[grados]C y se trasladaron al laboratorio. Los testiculos debian tener un tamano minimo de 3 cm y un peso minimo de 10 g para ser considerarlos en el presente estudio, dado que son adecuados indicadores de la funcion espermatica de un macho adulto (Abraham et al., 2016).

Dilutor

Se mezclo 19 ml de leche descremada, 1 ml de yema de huevo y 0.97 g de fructosa. A esta mezcla se le anadio 1840 [micron]l del crioprotector dimetilacetamida (DMA), equivalente a una concentracion final 1 M. Esta mezcla final se mantuvo temperada a 37.5[grados]C.

Espermatozoides Epididimarios

Se retiro la tunica vaginal visceral de cada testiculo, se hizo la divulsion para separar el epididimo y se aislo la cola del epididimo mediante un corte con tijera Mayo recta y pinza de Adson. Se retiro todo el tejido conectivo visible con el mismo instrumental y con el bisel no cortante de una hoj a de bisturi se corrio el contenido de los vasos sanguineos para evitar la contaminacion de la muestra. Antes de aislar la cola del epididimo, se realizo un lavado con PBS y luego se coloco la cola del epididimo en una placa Petri temperada a 37.5[grados]C, y se agrego 1 ml de dilutor para proceder a la liberacion, mediante cortes seriados de la cola del epididimo. Finalmente, se colecto la suspension en un tubo eppendorf de 1.5 ml y se mantuvo temperado a 37.5[grados]C.

Calidad Seminal

La motilidad fue evaluada en forma subjetiva, utilizando 10 [micron]l de cada muestra de suspension de espermatozoides recuperados. Se coloco la muestra sobre una lamina porta objeto temperada a 37.5[grados]C, se cubrio con una lamina cubre objeto y se observo en el microscopio con un objetivo 40X. Para la concentracion de la suspension de espermatozoides recuperados cada muestra se diluyo en una proporcion 1:20 con agua destilada, se recupero 10 [micron]l de cada dilucion y se leyo en la camara de Neubauer a 400X. Solo aquellas muestras con motilidad [mayor que o igual a] 30% y concentracion [mayor que o igual a] 50x[10.sup.6] espermatozoides por ml fueron procesados.

Criopreservacion

Para el proceso de criopreservacion se utilizo nitrogeno liquido dentro de un sistema de congelamiento automatico (Cryobath, Cryologic). Las muestras de espermatozoides suspendidas en el dilutor se envasaron en pajillas de plastico de 0.25 ml. Se utilizo el programa # 7 del sistema (Figura 1), el cual se inicio a una temperatura de 18[grados]C, disminuyendo hasta llegar a 5[grados]C en un periodo de 90 minutos, para luego mantenerse en esas condiciones por 30 minutos. Luego, la temperatura descendio hasta lograr la congelacion de las pajillas. Estas fueron luego colocadas en nitrogeno liquido hasta su evaluacion.

Motilidad Pos-descongelacion

Las pajillas se descongelaron en bano maria a 37[grados]C durante un minuto, luego se secaron y el contenido de cada pajilla se coloco en un tubo de 1.5 ml. Se tomo 10 [micron]l de cada muestra y se coloco en una lamina porta objeto temperada a 37.5[grados]C, se cubrio con una lamina cubre objeto y se observo en el microscopio con un objetivo 40X para evaluar la motilidad.

Potencial de Membrana Mitocondrial (PMM)

El PPM se evaluo utilizando el fluorocromo MitoTracker Deep Red (M22425, Molecular Probes, EEUU). Se realizo antes y despues del proceso de criopreservacion. Cada muestra fresca y descongelada se lavo dos veces por centrifugacion con PBS a 600 g por 8 min. Se elimino el sobrenadante y el pellet se resuspendio en 150 [micron]l de PBS. Se preparo una solucion stock de MitoTracker Deep Red, para lo cual se diluyo 50 [micron]g en 92 [micron]l de DMSO para llegar a una concentracion de 1 mM. Se procedio a homogenizar y se prepararon alicuotas de 2 [micron]l guardandolas en congelacion. Luego se preparo una solucion de trabajo para lo cual se diluyo 2 [micron]l de solucion stock de MitoTracker Deep Red con 100 [micron]l de PBS, para llegar a una concentracion de 20 [micron]M. Se tomo 100 [micron]l de muestra despues del lavado y se agrego 0.5 [micron]l de solucion de trabajo de MitoTracker Deep Red 633 (20 [micron]M) para obtener una concentracion final de 100 [micron]M. Se incubo durante 10 min a 38[grados]C en oscuridad.

Citometria de Flujo

Las muestras se analizaron utilizando un citometro de flujo FlowSight (Amnis) equipado con un sistema analizador de imagenes. Se leyeron diez mil espermatozoides por cada muestra. Para la excitacion del MitoTracker Deep Red se utilizo un laser de longitud de onda de 642 nm y la emision de la fluorescencia se leyo utilizando el canal de deteccion 11 (Ch-11): (642-740 nm). Los eventos se presentaron utilizando un grafico tipo histograma, en donde el eje <<X>> midio la intensidad de fluorescencia del Ch-11 y en el eje <<Y>> la frecuencia de los eventos. Se consideraron espermatozoides con actividad mitocondrial a aquellos que presentaron fluorescencia roja. Los resultados se expresaron en porcentaje de espermatozoides con actividad mitocondrial.

Dado que el citometro de flujo cuenta con un sistema analogo de imagen, se observaron fotos de espermatozoides con alto y bajo PMM de los siguientes canales:

Ch1 : Pre sentado en campo claro (longitud de onda: 435-505 nM)

Ch11: Presentado en campo oscuro (longitud de onda: 642-745 nM)

Ch1/Ch11: Presentado en campo claro y oscuro (longitud de onda: 435-505 nM + 642-745 nM)

Controles de Fluorescencia

Para la corroboracion de los datos se utilizaron controles de autofluorescencia, control negativo y control positivo. Los datos se presentaron en tres histogramas: el control de autofluorescencia en donde se analizo las muestras espermaticas a traves del citometro de flujo sin la utilizacion de algun fluorocromo; el control negativo, donde las muestras de espermatozoides se indujeron a muerte celular, y luego se evaluaron a traves del citometro de flujo utilizando el fluorocromo MitoTracker Deep Red; y el control positivo, donde una muestra de espermatozoides a condiciones normales fue evaluada a traves del citometro de flujo utilizando el fluorocromo MitoTracker Deep Red 633.

Diseno Experimentan y Analisis

Se evaluaron las 41 muestras obtenidas, divididas en dos etapas: evaluacion de muestras en fresco y evaluacion post congelamiento. El promedio de los porcentajes de espermatozoides con alto PMM, frescos y descongelados, se analizaron mediante un tStudent de muestras pareadas. Ademas, los datos se presentaron como media, mediana, coeficiente de variacion e intervalo de confianza. Los porcentajes de motilidad y PMM tambien fueron comparados utilizando la Correlacion de Pearson. Se utilizo el programa GraphPad Prism[R] v. 3.0.

RESULTADOS

Los datos estadisticos de los espermatozoides que presentan alto potencial de membrana mitocondrial (PMM) se presentan en el Cuadro 1. El 49.82 [+ o -] 12.41% de espermatozoides frescos y el 34.97 [+ o -] 9.96% de espermatozoides descongelados presenta alto PMM, siendo esta diferencia estadisticamente significativa (p<0.05) mediante la prueba de t de Student (Cuadro 2). En forma similar, la motilidad fue de 46.10 [+ o -] 7.71% en las muestras de espermatozoides frescos y de 24.07 [+ o -] 6.50% en las muestras de espermatozoides descongelados, habiendo diferencias significativas (p<0.05) entre grupos (Cuadro 2).

En la Figura 3 se presentan ejemplos graficos (histogramas) del analisis de las muestras de espermatozoides epidimarios de alpaca mediante el citometro de flujo. En (A) se presenta el control de autofluorescencia del fluorocromo MitoTracker Deep Red, donde se muestra que no hay emision de fluoresencia en Ch 11, por lo que todos los eventos forman una sola poblacion ubicada a la izquierda del eje x, indicando bajo PMM. En (B) se presenta el control negativo, espermatozoides inducidos a muerte celular analizados utilizando el fluorocromo MitoTracker Deep Red, donde se observa que los eventos forman una sola poblacion ubicada a la izquierda del eje x, indicando baj o potencial de membrana mitocondrial. En (C) y (D) se presentan el analisis de muestras frescas y muestras descongeladas, respectivamente. En (C) se puede observar una mayor distribucion de eventos localizados a la derecha del eje x y en (D) se puede observar una mayor distribucion de eventos localizados a la izquierda del eje x, por lo cual representan una variacion en las poblaciones antes y despues del proceso de criopreservacion.

En la Figura 4 se presentan fotos de espermatozoides analizados mediante citometria de flujo. El espermatozoide que se observa en la Figura 4A pertenece a la poblacion de eventos con alto potencial de membrana mitocondrial, observada mediante el sistema analizador de imagenes del citometro de flujo utilizando el canal Ch 1 en campo claro. Se presenta con fluorecencia naranja intensa ante la exposicion a los filtros para el fluorocromo MitoTracker Deep Red del Ch 11 en campo oscuro y utilizando los canales Ch 1 y Ch 11 en campo claro y oscuro. En la Figura 4B se presenta un espermatozoide que pertenece a la poblacion de eventos con bajo potencial de membrana mitocondrial, observada bajo el sistema analizador de imagenes del citometro de flujo utilizando el Ch 1 en campo claro, y observado ante la exposicion a los filtros para el fluorocromo MitoTracker Deep Red del canal Ch 11 en campo oscuro y utilizando los canales Ch 1 y Ch 11 en campo claro y oscuro.

El analisis de correlacion de Pearson entre los valores porcentuales obtenidos entre motilidad y el porcentaje de alto PMM (n=82 pares) indico una correlacion positiva significativa (p<0.0001) con un valor de r = 0.6271 (Figura 5).

DISCUSION

Este trabajo es el primer reporte que confirma que el PMM disminuye significativamente durante el proceso de criopreservacion en espermatozoides epididimarios de alpacas analizados mediante el citometro de flujo y utilizando el fluorocromo MitoTracker Deep Red 633. El PMM es la diferencia de voltaje a traves de la membrana mitocondrial, el cual es un componente importante de la fuerza proton-motriz en las mitocondrias que se utiliza para realizar la sintesis de ATP (Vojtiskova et al., 2004).

Se encontraron valores cercanos al 50% de alto PMM en muestras espermaticas frescas, lo cual fue ligeramente inferior al descrito previamente por Santiani et al. (2016), donde obtuvieron alrededor de 59% de alto PMM, utilizando tambien el fluorocromo MitoTracker Deep Red 633. En dicho trabajo tambien evaluaron espermatozoides utilizando el flurocromo CMXRos obteniendo valores de 65% de alto PMM. Es posible que el factor estacional haya influido en los resultados, dado que el presente estudio se hizo en los meses de verano (enero-mayo), mientras que Santiani et al. (2016) trabajaron en los meses de primavera (septiembre-enero), considerando que Urquieta et al. (1994) menciona que los meses de mayor reproduccion corresponden entre marzo y mayo. Por otro lado Cheuqueman et al. (2013) evaluaron muestras de eyaculado de alpaca utilizando el fluorocromo JC-1 obteniendo un valor de 66% de alto PMM utilizando seis alpacas de comprobada fertilidad, en tanto que en el presente estudio se utilizaron testiculos de alpacas beneficiadas.

La calidad espermatica disminuyo significativamente por el proceso de criopreservacion, pues descendio a 35% de alto PMM. Resultados similares obtuvieron Santiani et al. (2015), encontrando un 25% de alto PMM en espermatozoides epididimarios de alpaca, utilizando en este caso el fluorocromo MitoTracker Red CMXRos. En otras especies, Hallap et al. (2005) utilizando tambien el fluorocromo MitoTracker Deep Red encontraron 69% de alto PMM en espermatozoides frescos de toros y alrededor de 48% en espermatozoides descongelados.

Con respecto a la motilidad, las muestras de espermatozoides frescos obtuvieron un valor de 46% y las muestras de espermatozoides descongelados un valor de 24%. En el estudio de Valdivia et al. (1999) con muestras seminales de alpaca obtuvieron tambien una variacion considerable en la motilidad, siendo de 60-98% en muestras frescas y de 15-20% luego del proceso de congelacion-descongelacion. Asi mismo, Santiani et al. (2005) utilizando muestras seminales recolectadas por vagina artificial obtuvieron motilidades de 72% en muestras frescas y 20% en muestras descongeladas. Cabe resaltar que en dicho estudio, se trabajo con muestras de cuatro alpacas criadas bajo buena alimentacion, lo cual puede explicar los mayores valores de motilidad respecto a los del presente estudio. Por otro lado, los mejores valores de motilidad pos-descongelacion entre ambos estudios se puede deber a las tecnicas de congelacion, ya que el metodo automatico utilizado en el presente trabajo minimiza el dano celular durante la criopreservacion. En diversos estudios se ha demostrado la perdida de motilidad por efecto de la criopreservacion (Aller et al., 2003; Piomboni et al., 2012).

Tal como indica O'Connell et al. (2003), existe una relacion directa entre motilidad y PMM. La correlacion de Pearson entre la motilidad y el PMM en el presente trabajo fue altamente significativa (p<0.0001).

CONCLUSIONES

* El potencial de membrana mitocondrial (PMM) de las muestras espermaticas se reduce por efecto del proceso de criopreservacion.

* El PMM es un parametro de calidad espermatica que tiene directa relacion con la motilidad.

http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v30i1.15677

Agradecimientos

Se agradece al proyecto No. 123-FINCyT-ECL-2014 por el financiamiento para el estudio.

LITERATURA CITADA

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(3.) Andrade A. 2005. Influencia en la calidad espermatica de la adicion de distintas concentraciones de crioprotectores para la conservacion del semen canino. Tesis Doctoral. Madrid: Univ. Complutense de Madrid. 287 p.

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(12.) Santiani A, Ugarelli A, Evangelista S, Choez K, Pacheco J. 2015. Evaluacion de diferentes concentraciones de FITCPSA y FITC-PNA para la valoracion de la integridad acrosomal en espermatozoides de alpaca. Anim Reprod Sci 5: 8792. doi: 10.18548/aspe/0002.20

(13.) Santiani A, Ugarelli A, Evangelista-Vargas S. 2016. Characterization of functional variables in epididymal alpaca (Vicugna pacos) sperm using imaging flow cytometry. Anim Reprod Sci 173: 49-55. doi: 10.1016/j.anireprosci.2016.08.010

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(16.) Vojstiskova A, Jesina P, Kalous M, Kaplanova V, Houstek J, Tesarova M, Fornuskova D, et al. 2004. Mitochondrial membrane potential and ATP production in primary disorders of ATP synthase. Toxicol Mech Methods 14: 711. doi: 10.1080/15376520490257347

Pablo Allauca [1], Alejandra Ugarelli [1], Alexei Santiani [1]

[1] Laboratorio de Reproduccion Animal, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Peru

[2] E-mail: asantiania@unmsm.edu.pe

Recibido: 27 de abril de 2018

Aceptado para publicacion: 18 de octubre de 2018

Leyenda: Figura 1. Programa #7 de congelamiento automatico Cryobath (Cryologic)

Leyenda: Figura 2. Esquema de presentacion de histograma de espermatozoides. Muestra dos poblaciones diferenciadas de espermatozoides

Leyenda: Figura 3. Histogramas de muestras de espermatozoides epididimarios de alpaca analizados mediante el citometro de flujo. (A) Control de autofluorescencia, muestra de espermatozoides analizados sin utilizar el fluorocromo MitoTracker Deep Red. (B) Control negativo, se analizo espermatozoides inducidos a muerte celular, utilizando el fluorocromo MitoTracker Deep Red. (C) y (D) representan muestras de espermatozoides epididimarios frescos y descongelados, respectivamente, utilizando el fluorocromo MitoTracker Deep Red

Leyenda: Figura 4: Ejemplos de espermatozoides epididimarios de alpaca evaluados mediante el sistema analizador de imagen del citometro de flujo. (A) Espermatozoide de alto potencial de membrana mitocondrial (PMM). (B) Espermatozoide de bajo PMM

Leyenda: Figura 5. Correlacion entre el porcentaje de motilidad y alto potencial de membrana mitocondrial (PMM) de espermatozoides epididimarios de alpaca
Cuadro 1. Espermatozoides epididimarios
de alpacas, frescos y descongelados,
analizados con el fluorocromo MitoTracker
Deep Red, con alto potencial de membrana
mitocondrial (PMM)

                   Muestras frescas (%)    Muestras descongeladas (%)

Promedio                  49.82                       34.97
Mediana                   51.50                       35.90
Desviacion                12.41                       9.95
estandar
Coeficiente               24.91                       28.48
de variacion
Intervalo de               7.84                       6.29
confianza

Cuadro 2. Potencial de membrana
mitocondrial (PMM) y la motilidad de
espermatozoides epididimarios de alpaca,
frescos y descongelados

                           Frescos                  Descongelados

Alto PMM (%)       49.82 [+ o -] 12.41 (a)     34.97 [+ o -] 9.96 (b)
Motilidad (%)      46.10 [+ o -] 7.71 (a)      24.07 [+ o -] 6.50 (b)

(a,b) Letras diferentes dentro de lineas indican
diferencia estadistica significativa (p<0.05)
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No portion of this article can be reproduced without the express written permission from the copyright holder.
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Author:Allauca, Pablo; Ugarelli, Alejandra; Santiani, Alexei
Publication:Revista de Investigaciones Veterinarias del Peru (RIVEP)
Date:Jan 1, 2019
Words:3890
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