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Determinacion del polimorfismo C677T de metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) en una poblacion piloto de estudiantes de la Universidad del Rosario.

Preliminary population study of Methylenetetrahydrofolate Reductase (MTHFR) C677T polymorphism determination in a pilot group of students from the University of Rosario

Introduccion

El folato es la forma soluble de la vitamina B9. Entre los alimentos que la contienen estan la lenteja, la arveja, la naranja, el brocoli, los esparragos y el higado; en suplementos alimenticios se encuentra como acido folico, su forma sintetica (1). La ingesta adecuada de folato es importante en diversos procesos vitales, entre ellos la sintesis, replicacion y reparacion del ADN, asi como la biosintesis de proteinas y otros procesos fundamentales para la viabilidad celular, por ejemplo la division y la homeostasis (1-2), debido al papel esencial de sus coenzimas en la regeneracion de metionina, oxidacion y reduccion de unidades de un unico carbono requeridos para un metabolismo normal y regulado (2).

El suplemento de las coenzimas del folato in vivo requiere tanto de la cantidad y biodisponibilidad del folato ingerido como de su tasa de perdida por via catabolica, urinaria y fecal. Cuando se presentan ciclos de ingesta inadecuada, mala absorcion o cambios bioquimicos asociados con un nivel inadecuado de folato, se generan anormalidades (2-5) que pueden ser asociadas a enfermedad coronaria y ciertos tipos de cancer (3-7). Tambien existen otros polimorfismos funcionales en los genes que codifican para las enzimas involucradas en su metabolismo que pueden llegar a influir en la susceptibilidad frente a estas patologias; por tal razon, los polimorfismos del gen de metilentetrahidrofolato reductasa se cuentan entre los mas estudiados (3-5).

MTHFR y funcion

El gen codificante para esta enzima se encuentra ubicado en la region p36.3 del cromosoma 1. La secuencia complementaria de ADN tiene una longitud de 2,2 kb y 11 exones; el producto del gen es una proteina de aproximadamente 70 kDa (4). La enzima desempena un papel fundamental en el metabolismo del folato, catalizando junto con otra serie de enzimas la conversion irreversible de 5,10-metilentetrahidrofolato a 5-metilentetrahidrofolato, la primera forma circulante del folato en el cuerpo (5), y un co-sustrato para la metilacion de homocisteina a metionina. La actividad enzimatica esta bajo el control de los niveles intracelulares de S-Adenosil-Metionina (SAM), coenzima participante en la transferencia de grupos metilo, encontrandose una alta actividad relacionada con niveles elevados de SAM y una baja actividad con niveles intracelulares disminuidos (6). De esta manera se asegura que haya suficiente disponibilidad de folato tanto para la metilacion de la homocisteina como para la metilacion de dUMP (desoxi-uridinmonofosfato), intermediario en el metabolismo de los desoxirribonucleotidos, el cual es catalizado por la timidilato sintasa que tambien utiliza 5,10-metilentetrahidrofolato (5-6).

En 1995 se describio un cambio comun de C[flecha diestra]T en la posicion 677 del gen de MTHFR, que conduce a la sustitucion de alanina por valina en el codon 222 de la proteina y que trae como consecuencia termolabilidad y baja actividad especifica de la enzima. Desde entonces el genotipo homocigoto (677TT) ha sido relacionado con bajos niveles de folato en suero (7), homocisteina elevada en plasma (8-9), distribucion alterada de distintos tipos de folato en las celulas (10) y aumento del riesgo de generar enfermedad coronaria (11) y varios tipos de cancer (12).

Implicaciones

La funcion de la enzima puede llegar a influir en el riesgo de contraer cancer, frecuentemente gastrico o de seno, de dos formas. En la primera, el 5,10-metilentetrahidrofolato, substrato de MTHFR, al estar involucrado en la conversion de dUMP a monofosfato de deoxitimidilato (dTMP), puede ocasionar el incremento de la relacion de estos dos componentes, si se encuentra en niveles disminuidos, aumentando la tasa de incorporacion al ADN de uracilo en vez de timina, incrementado asi la probabilidad de aparicion de mutaciones puntuales y rompimiento del ADN a nivel cromosomico (13). La segunda esta determinada por los niveles de SAM, un donante comun de grupos metilo necesarios para el proceso de metilacion del ADN. En este caso, cambios en la metilacion modifican la conformacion del ADN y la expresion de los genes (14). Una forma menos activa de la enzima MTHFR supone bajos niveles de SAM, por ende hipometilacion (15). De manera similar, la baja ingesta de folato puede determinar el riesgo de aparicion de algunos tipos de cancer, provocando una metilacion aberrante en el ADN que resulta en una expresion alterada de proto-oncogenes y de genes de supresion tumoral (16-17).

En cuanto a la enfermedad coronaria, se han encontrado elevadas concentraciones de homocisteina en pacientes con enfermedad arterial (18) e hipertension (19), esto sugiere que la homocisteina esta involucrada en activacion plaquetaria, hiper coagulacion, estres oxidativo, disfuncion endotelial y proliferacion de celulas de musculo liso junto con oxidacion y peroxidacion de lipidos (20-22). Adicionalmente, una concentracion elevada de homocisteina en pacientes hipertensos ha sido correlacionada con la presion arterial (23-26). Individuos escogidos aleatoriamente para llevar a cabo un tratamiento de reduccion de la concentracion de homocisteina mostraron una disminucion en la presion sanguinea, hecho que evidencia tal la relacion (18).

El folato tambien ha sido relacionado con defectos de tubo neural en bebes en etapa de gestacion, que han producido patologias como anencefalia y espina bifida, ademas de influir en la aparicion de cardiopatias congenitas, con mayor frecuencia la tetralogia de Fallot, comunicacion interventricular y comunicacion intraventricular (27).

Variantes geneticas

La mayoria de los genes que codifican para las enzimas involucradas en el metabolismo del folato son polimorficos (28). Con base en lo anterior, 29 mutaciones raras del gen para MTHFR, que resultan en una actividad enzimatica considerablemente baja, han sido descritas en pacientes que padecen de homocistinuria (4), mientras que en individuos no homocistinuricos y considerados sanos se han encontrado dos polimorfismos funcionales frecuentes, cuyas variantes genotipicas son asociadas con bajos niveles de folato en plasma sanguineo (3).

El primer polimorfismo corresponde a un cambio C[flecha diestra]T en el nucleotido 677 del exon 4 (C677T); el segundo, a un cambio A[flecha diestra]C en el nucleotido 1.298 del exon 7 (A1298C). Estos dos polimorfismos se localizan a 2,1 kb el uno del otro, y se ha investigado la asociacion de estos polimorfismos con el riesgo de padecer las patologias mencionadas (4). Si bien estos polimorfismos se relacionan con bajos niveles de folato en plasma sanguineo, el primero es mas relevante. La actividad enzimatica de los heterocigotos (CT) es del 65% y del 30% para los homocigotos (TT) con respecto al alelo mayor (CC) (3-4, 16). Diferentes investigaciones han asociado al genotipo MTHFR-TT con la hipometilacion del ADN, particularmente en individuos con concentraciones reducidas de folato en plasma (29-32). Estudios realizados en distintas poblaciones del mundo muestran una alta asociacion del polimorfismo C677T y la susceptibilidad de cancer gastrico (5, 32-33), de seno (17, 34-36) y enfermedad coronaria (11, 18, 37).

Frecuencias poblacionales

Diferentes trabajos han mostrado la frecuencia del alelo T y su amplia variacion en los rangos de frecuencias alelicas en poblaciones sanas, en estudios poblacionales (38-39) y en estudios de casos y controles en patologias como cancer o cardiopatias (4-5, 37, 40-41).

La tabla 1 presenta algunos datos reportados en distintas regiones del mundo para este polimorfismo. En casos como China (42-43) o Estados Unidos (44), donde se muestrean las mismas poblaciones geograficas, se obtienen resultados muy diferentes. Esta frecuencia tiene valores entre el 1% en la poblacion del sur oriente de la India (45) hasta el 57% en Linxian, China (43), con una frecuencia de homocigosidad que varia entre 0% (45, 44) hasta mas del 30% en diferentes poblaciones de China (46, 47, 43). En Estados Unidos, en un estudio aplicado a diferentes grupos etnicos, Li y colaboradores han reportado la menor frecuencia del alelo T en la poblacion afroamericana y la mayor en la poblacion hispana (44).

En Colombia se han realizado previamente tres estudios (48-50), en los que se han analizado las frecuencias alelicas y genotipicas de este polimorfismo mediante la comparacion de casos y controles. Los resultados han mostrado un comportamiento variable, incluso cuando se han muestreado personas de la misma region geografica, como la poblacion de Medellin, en el occidente del pais (49-50).

Teniendo en cuenta la importancia de esta enzima y la heterogeneidad de las poblaciones estudiadas, se realizo un estudio para determinar las frecuencias alelicas y genotipicas del polimorfismo C677T de MTHFR en una muestra de individuos sanos colombianos compuesta por estudiantes de la Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud de la Universidad del Rosario; adicionalmente, se compararon con los resultados obtenidos con otras poblaciones a nivel mundial.

Materiales y metodos

Estudio de tipo descriptivo disenado para conocer las frecuencias alelicas y genotipicas de las dos variantes polimorficas del gen de interes en una muestra poblacional e integrado, pues combina resultados de tres estudios cientificos realizados en Colombia.

Para estimar el tamano poblacional a evaluar a partir de los 436 estudiantes de primer a cuarto semestre de la Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud de la Universidad del Rosario, se trabajo con un maximo de variabilidad para el alelo T de 0,5; un intervalo de confianza del 95% y un error del 5%, obteniendo un tamano poblacional de muestreo de 204 estudiantes. Se tomo una muestra de 5 ml de sangre total para 206 estudiantes voluntarios. Los individuos incluidos fueron estudiantes sanos, de ambos sexos y mayores de edad con previa firma del consentimiento informado. No se estratifico por procedencia, grupo etnico o nivel socioeconomico.

El estudio fue realizado con previa aprobacion del protocolo por parte del Comite de Etica de la Universidad del Rosario.

El ADN genomico se aislo mediante la tecnica de extraccion de salting out (51). Una vez obtenido, se comprobo su calidad en gel de agarosa al 1%; posteriormente, se cuantifico y diluyo a una concentracion de 25 ng/[micron]l.

Para el estudio del polimorfismo C677T de MTHFR se utilizo el metodo reportado por Frosst (52) y Weisberg (53) con modificaciones menores. Los primers: 5' CGA AGC AGG GAG CTT TGA GGC TG 3' y 5' AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG 3'. La amplificacion se realizo mediante una PCR convencional bajo las siguientes condiciones experimentales: 94 [grados]C 5 min; 35 ciclos (94 [grados]C 30 s, 62 [grados]C 45 s y 68 [grados]C 30 s) y finalmente 68 [grados]C 5 min. Se obtuvo un fragmento de 233 pb (figura 1), el cual fue digerido con la enzima TaqI durante 12 h a 37 [grados]C, generando un fragmento de 233 pb para el homocigoto CC, un fragmento de 171 pb para el homocigoto TT y dos fragmentos de 233 y 171 pb para el heterocigoto CT (figura 2).

Se incluyeron en los analisis a 621 individuos colombianos, aparentemente sanos, reportados por estudios previos en Colombia (48-50). Se calcularon las frecuencias alelicas y genotipicas tanto para la poblacion de estudiantes como para la poblacion total (incluyendo los individuos sanos reportados por otros autores) y se realizo el analisis de ajuste al equilibrio de Hardy-Weinberg (EHW) en ambas muestras, utilizando test exactos con cadenas de Markov para estimar el valor exacto de p.

[FIGURA 1 OMITIR]

[FIGURA 2 OMITIR]

Resultados

En la amplificacion por PCR se obtuvo un fragmento de 233 pb (figura 1), que al ser cortado con la enzima TaqI genero fragmentos de 233 pb para el homocigoto CC, un fragmento de 171 pb para el homocigoto TT y dos fragmentos de 233 y 171 pb para el heterocigoto CT (figura 2).

Se estimaron las frecuencias alelicas y genotipicas tanto para la poblacion de 206 individuos aparentemente sanos (tabla 2) como para la poblacion colombiana en general, al incluir los individuos de otros trabajos previamente reportados (tabla 3). En ambos casos se observo un exceso de homocigotos, que en el grupo de datos de estudiantes de la Universidad del Rosario genero una probabilidad significativa de no encontrarse en EHW (p = 0,0001; s.d. <0,0000), con un indice de endogamia negativo y significativo ([F.sub.IS] = -0,2712). Para los 621 individuos de Colombia la probabilidad de no encontrarse en EHW (p = 0,2468; s.d. = 0,0043) no es significativa, con un indice de endogamia negativo, pero no significativo ([F.sub.IS] = -0,0480).

Se muestran las frecuencias del alelo T para individuos aparentemente sanos en diferentes poblaciones alrededor del mundo (tablas 4 y 5). La tabla 4 presenta algunas de las poblaciones cuyas frecuencias alelicas son estadisticamente diferentes a este trabajo; la tabla 5, poblaciones con frecuencias alelicas similares.

Discusion

Al comparar los resultados de frecuencias alelicas en la poblacion de estudiantes (tabla 2) y de la poblacion total colombiana (tabla 3), los valores obtenidos son muy similares, con menos del 1% de diferencia. Sin embargo, las estimas de ajuste al EHW indican que la poblacion de estudiantes muestreada en este trabajo no se encuentra en EHW, contrario al analisis que incluye la totalidad de muestras colombianas. Esto sugiere que existe la probabilidad, aunque reducida, de que una fuerza de seleccion este favoreciendo a los heterocigotos en la poblacion de estudiantes o que este representando alguna situacion que favorezca al alelo T lo cual se refleja en el alto numero de heterocigotos.

La primera situacion puede ser el cambio en el numero total de individuos. Un tamano de muestra mas grande reduce el error de muestreo; por tanto, es posible que las poblaciones se ajusten mejor a los supuestos del equilibrio, al hacer este muestreo en una poblacion con caracteristicas mas heterogeneas. Se destaca que las desviaciones al EHW por tamanos de muestreo se deben por lo general a un efecto Wahlund, segun el cual el numero de homocigotos aumenta debido a la subestructura criptica de la poblacion (58-59). Esto suele solucionarse aumentando el numero de individuos muestreados. Sin embargo, en este caso, el desequilibrio se observa por un exceso de heterocigotos; si bien la poblacion es pequena -206 individuos- y puede no representar de manera adecuada a la totalidad de la poblacion colombiana, debe resaltarse que en ninguno de los estudios realizados en Colombia que fueron incluidos en este analisis (49-51) ni en otro estudio no incluido realizado en Bogota con personas aparentemente sanas (60) se observa falta de EHW aun cuando los tamanos de muestra son menores o iguales al reportado por nosotros.

Otra situacion se refiere a la enorme variabilidad del polimorfismo C677T en las diferentes poblaciones muestreadas en el mundo. Sus frecuencias alelicas han sido reportadas para el alelo T entre 0,01 (17) y 0,64 (4). Los datos obtenidos en este estudio para la poblacion colombiana se situan en un punto intermedio similar al reportado para Mexico, donde el polimorfismo es de 0,47 (33).

Si bien los valores de las frecuencias alelicas observadas en los dos grupos (tabla 1 y tabla 2) son similares, no ocurre lo mismo con la distribucion de las frecuencias genotipicas. En este caso, los estudiantes presentan valores de heterocigotos mayores a los observados en la poblacion general (mas del 10%).

Si se tiene en cuenta que las presiones selectivas positivas sobre alelos deletereos son poco frecuentes, existe la posibilidad de que la poblacion de estudiantes se este comportando de manera similar a la que analizaron el grupo de Mayor-Olea y colaboradores (38) en Espana. Estos investigadores trabajaron con una poblacion espanola de diferentes rangos de edad, verificando en cada uno de ellos las frecuencias del polimorfismo C667T MTHFR; encontraron que los nacidos despues de 1976 presentaban un comportamiento en las frecuencias diferente a la de los nacidos en el periodo 1900-1975. Los autores atribuyen este cambio en las frecuencias alelicas, representada por un aumento en el numero de individuos que portan el alelo T, a la suplementacion con acido folico durante el periodo gestacional, incluida en el sistema de salud espanol durante la decada de 1970 (38).

Los resultados presentados en las tablas 4 y 5 indican que no existe una distribucion zonal que permita afirmar que las poblaciones se comportan igual en las distintas regiones del mundo. Asimismo, se evidencia la enorme variabilidad del polimorfismo, al observarse que es posible encontrar frecuencias del alelo T bastante diferentes en un mismo pais, como en China (46) y Colombia (49, 50), donde la poblacion muestreada es la misma.

Los interrogantes biologicos a partir de los resultados de este estudio indican que es necesario considerar proyectos futuros que permitan darles solucion. Para esto seria pertinente realizar otro estudio con dos nuevos grupos poblacionales: mayores de cuarenta anos y ninos menores de edad. Asi, si la hipotesis presentada por el grupo espanol (38) es correcta, la primera muestra se encontraria en EHW y la segunda en desequilibrio; esto confirmaria que la ingesta de acido folico por parte de madres gestantes esta influenciando la frecuencia genetica del alelo T. Si se llegase a observar que en la poblacion de ninos los alelos se encuentran en EHW, entonces se analizaria un posible proceso de exogamia sobre la muestra de estudiantes.

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Zaniah N. Gonzalez-Galofre [1], B.Sc., Victoria Villegas [2], M.Sc., Maria Martinez-Aguero [2], Ph.D.

Recibido: 16 de febrero de 2010 * Aceptado: 24 de marzo de 2010

[1] Universidad de Los Andes, Departamento de Ciencias Biologicas, Bogota, Colombia.

[2] Universidad del Rosario, Facultad de Ciencias Naturales y Matematicas, Bogota, Colombia.

Correspondencia: maria.martinez@urosario.edu.co
Tabla 1. Frecuencias alelicas para el polimorfismo
C677T reportadas para diferentes regiones del mundo
en individuos sanos

Region        Pais                                    Numero
                                                    individuos

Asia          India                Alluri (45)          49
centro-
occidente     Iran                 Golbahar (54)       391

Asia          China                Baum (42)           304
oriente
              China                Stolzenberg-        398
                                   Solomon (43)

Europa        Turquia              Ilhan (18)          100

              Italia               Fabris (55)         236

America       Estados Unidos       Li (44)              13
  del Norte     (hispanos)
              Estados Unidos       Li et al.            16
                (afroamericanos)     2005 (44)
              Estados Unidos       Li (44)             307
                (caucasicos)
              Mexico               Lacasana-           631
                                     Navarrro
                                     (33)
              Brasil               Santos (56)         111

America       Colombia             Camacho             150
  Latina                             Vanegas (60)
              Colombia             Bermudez (48)        95
              Colombia             Torres (49)         114
              Colombia             Cardona (50)        206

Region        Pais                                      Frecuencias
                                                        genotipicas

                                                     CC      CT    TT

Asia          India                Alluri (45)      0,980  0,020  0,000
centro-
occidente     Iran                 Golbahar (54)    0,560  0,389  0,051

Asia          China                Baum (42)        0,641  0,313  0,046
oriente
              China                Stolzenberg-     0,163  0,525  0,312
                                   Solomon (43)

Europa        Turquia              Ilhan (18)       0,720  0,260  0,020

              Italia               Fabris (55)      0,292  0,479  0,229

America       Estados Unidos       Li (44)          0,385  0,385  0,231
  del Norte     (hispanos)
              Estados Unidos       Li et al.        0,750  0,250  0,000
                (afroamericanos)     2005 (44)
              Estados Unidos       Li (44)          0,485  0,450  0,065
                (caucasicos)
              Mexico               Lacasana-        0,337  0,419  0,244
                                     Navarrro
                                     (33)
              Brasil               Santos (56)      0,369  0,478  0,153

America       Colombia             Camacho          0,280  0,467  0,253
  Latina                             Vanegas (60)
              Colombia             Bermudez (48)    0,232  0,516  0,253
              Colombia             Torres (49)      0,316  0,491  0,193
              Colombia             Cardona (50)     0,452  0,403  0,146

Region        Pais                                     Frecuencias
                                                       alelicas C T

Asia          India                Alluri (45)       0,990    0,010
centro-
occidente     Iran                 Golbahar (54)     0,755    0,246

Asia          China                Baum (42)         0,798    0,202
oriente
              China                Stolzenberg-      0,426    0,574
                                   Solomon (43)

Europa        Turquia              Ilhan (18)        0,850    0,150

              Italia               Fabris (55)       0,532    0,468

America       Estados Unidos       Li (44)           0,577    0,423
  del Norte     (hispanos)
              Estados Unidos       Li et al.         0,875    0,125
                (afroamericanos)     2005 (44)
              Estados Unidos       Li (44)           0,710    0,290
                (caucasicos)
              Mexico               Lacasana-         0,547    0,453
                                     Navarrro (33)
              Brasil               Santos (56)       0,608    0,392

America       Colombia             Camacho           0,513    0,487
  Latina                             Vanegas (60)
              Colombia             Bermudez (48)     0,490    0,511
              Colombia             Torres (49)       0,561    0,439
              Colombia             Cardona (50)      0,653    0,347

Fuente: elaboracion propia.

Tabla 2. Calculos realizados para los 206 individuos
aparentemente sanos muestreados (a)

(a) Genotipos y frecuencias genotipicas.

(b) Alelos y frecuencias alelicas.

Genotipo    Genotipos    Genotipos   Frecuencias   Frecuencias
           observados    esperados   observadas     esperadas

CC             55          68,6         0,27          0,33
CT             128         100,8        0,62          0,49
TT             23          36,6         0,11          0,18
CC/TT          78          105,2        0,38          0,51

(b)

Alelo      Frecuencias
            alelicas

C             0,58
T             0,42

Fuente: elaboracion propia.

Tabla 3. Calculos realizados para los 621 individuos
aparentemente sanos muestreados (a)

(a) Genotipos y frecuencias genotipicas.

(b) Alelos y frecuencias alelicas.

Genotipo    Genotipos     Genotipos   Frecuencias   Frecuencias
            observados    esperados   observadas     esperadas

   CC          206          213,2        0,33          0,34
   CT          316          301,5        0,51          0,49
   TT           99          106,3        0,16          0,17
 CC/TT         305          319,5        0,49          0,51

  (b)

 Alelo     Frecuencias
             alelicas

   C          0,5862
   T          0,4138

Fuente: elaboracion propia.

Tabla 4. Frecuencias alelicas reportadas para paises
con diferencias significativas frente a las
frecuencias calculadas para la poblacion muestreada

Pais            Numero de    Frecuencia
                Individuos    alelo T

China [46]         540          0,56
Taiwan [57]        285          0,33
Iran [54]          391          0,25
Colombia [50]      206          0,35

Fuente: elaboracion propia.

Tabla 5. Frecuencias alelicas reportadas para paises con
diferencias significativas frente a las frecuencias
calculadas para la poblacion muestreada

Pais            Numero de    Frecuencia
                Individuos    alelo T

Alemania [6]       106          0,38
Italia [55]        236          0,47
Espana [38]         88          0,43
Mexico [33]        427          0,45
Colombia [48]       95          0,51
Colombia [49]      114          0,44

Fuente: elaboracion propia.
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Title Annotation:Articulo originales
Author:Gonzalez-Galofre, Zaniah N.; Villegas, Victoria; Martinez-Aguero, Maria
Publication:Revista Ciencias de la Salud
Article Type:Report
Date:Jan 1, 2010
Words:6009
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