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Determinacion de secuencia y modelaje por homologia de la lipasa de Marinobacter sp. LB.

Sequence determination and homology modeling of lipase from Marinobacter sp.

Introduccion

Las lipasas (EC 3.1.1.3) son un grupo de enzimas con gran interes industrial, cientifico y tecnologico, debido a su capacidad catalitica en reacciones de esterificacion, interesterificacion y transesterificacion en medios no acuosos (Houde et al. 2004). En ese sentido, son utilizadas en las industrias: farmaceutica, cosmetica, medica, alimentaria, oleoquimica, quimica, papelera, textilera, entre otras (Louwrier 1998, Schiraldi et al. 2002, Hasan et al. 2006, Wang et al. 2008, Monsia & Monsia 2013).

La primera clasificacion de lipasas bacterianas realizada por Jaeger et al. (1999) considero seis familias, dentro de las cuales destaca la familia I, verdaderas lipasas, con su miembro mas representativo, la de Pseudomonas aeruginosa. En los meses sucesivos, la clasificacion se extendio con las familias VII y VIII (Arpigny & Jaeger 1999).

Las caracteristicas de las verdaderas lipasas segun Kim et al. (2004) son:

1. La triada catalitica conformada por serina, acido aspartico e histidina, donde la serina esta dentro del pentapeptido conservado Gly-X-Ser-X-Gly.

2. La region del agujero oxianion constituida por los residuos His-Gly y ubicada en la region amino terminal, cadena arriba entre 70 a 100 aminoacidos (aa) del pentapeptido.

3. La secuencia senal localizada entre 10 a 40 aminoacidos por encima de la secuencia His-Gly.

Las propiedades y caracteristicas de las lipasas se pueden determinar por diversas metodologias, entre las mas utilizadas son las tecnicas moleculares que permiten identificar, caracterizar y expresar genes especificos en hospederos conocidos y faciles de manipular (Jorgensen et al. 1991, Ihara et al. 1991, Tan & Miller 1992, Saeed et al. 2006, Ruiz et al. 2002, An et al. 2003).

Por otro lado, los analisis in silico permiten predecir de manera rapida y economica algunas propiedades de las enzimas, tales como el peso molecular, punto isoelectrico (pI), estructura tridimensional, sitio activo, especificidad de sustratos, entre otros. Asi, Wohlfarth et al. (1992) clonaron el gen lipA de Pseudomonas aeruginosa PAO1 de 936 pares de bases (bp) determinando con metodos bioinformaticos un peso molecular de 30.134 kDa y la presencia del pentapeptido Gly-His-Ser-His-Gly. De forma similar, Alquati et al. (2002) amplificaron y clonaron el gen de una lipasa de 879 bp perteneciente a Pseudomonas fragi IFO3458 y mediante analisis in silico determinaron una secuencia proteica de 293 aa, con 32.086 kDa y pI de 9.33. Adicionalmente, Messaoudi et al. (2011) obtuvieron de la base de datos NCBI una lipasa de Arabidopsis thaliana de 379 aa y 44.23 kDa con la finalidad de generar un modelo de homologia, para lo cual eligieron como molde una lipasa humana con 32% de identidad. La estructura fue validada y sometida al analisis de acoplamiento molecular identificando dos bolsillos de interaccion con los sustratos ensayados. Posteriormente, Ali et al. (2013) modelaron una lipasa de Pseudomonas sp. AMS8 de 476 aa y 50 kDa, extraida de la base de datos, en este estudio, utilizaron como posibles plantillas a las lipasas de Serratia marcescens (80% de identidad) y Pseudomonas sp. MIS38 (69% de identidad); sin embargo, sus analisis generaron un mejor modelo con la lipasa de Pseudomonas sp. MIS38, evidenciando que los porcentajes de identidad altos no brindan necesariamente los mejores modelos. Por ultimo, Gupta et al. (2015) y Lanka et al. (2015), realizaron el modelamiento homologo, la validacion de la estructura y los estudios de acoplamiento de lipasas de Pseudomonas fluorescens y Emericella nidulans NFCCI 3643, respectivamente. En ambos casos, el bolsillo de interaccion fue unico para los sustratos ensayados.

Marinobacter sp. LB es una bacteria halofila moderada, aislada de las Salinas de Pilluana (San Martin-Peru), presenta una lipasa extracelular versatil ante condiciones de estres salino (FernandezJeri et al. 2013). Sin embargo, el cultivo de esta bacteria en medios salinos dificulta los procesos de filtracion, precipitacion, dialisis y cromatografia, evitando su caracterizacion total. Por este motivo se decidio realizar el analisis in silico del gen lip y de la secuencia aminoacidica, con la finalidad de pronosticar la estructura de la enzima, sus caracteristicas y su mecanismo de interaccion con sustratos.

Material y metodos

Extraccion de ADN genomico.--Se utilizo Marinobacter sp. LB proveniente del cepario del Laboratorio de Biologia Molecular de la Facultad de Farmacia y Bioquimica de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. A partir de la cual se prepararon cultivos frescos de 12 h a 37[grados]C en caldo tripticasa de soya y NaCl al 3%. A continuacion, se centrifugo 1.5 mL de cultivo a 12000 rpm por 10 min, eliminando el sobrenadante. El pellet fue resuspendido con 200 pL de tampon PBS 1X y NaCl 3%, se centrifugo nuevamente a 12000 rpm por 10 min, eliminando el sobrenadante. Con la finalidad de lisar las membranas celulares, se adicionaron 200 pL de agua bidestilada y las celulas fueron sometidas a un choque termico de 100[grados]C por 10 min y -20[grados]C por 2 min. Luego, se centrifugo a 12000 rpm por 10 min y se conservo el sobrenadante. Para verificar la calidad del ADN genomico, se realizo una electroforesis en gel de agarosa 1% (Biorad) con tampon TAE 1X y marcador DNA Ladder 1 kb (Invitrogen).

Amplificacion del gen lip mediante PCR.--Para la amplificacion del gen lip mediante PCR se utilizaron los cebadores forward 5'-ATACTCCCTGTTGCATGTCG-3' y reverse 5'-TGGACTGGTGCTTCATAACC-3' disenados con el programa primer3 (Untergasser et al. 2012, Koressaar & Remm 2007). El volumen final fue de 25 [micron]L y la mezcla de reaccion contenia KCl 50 mM, Tris/HCl 10 mM, triton X-100 0.1% (v/v), Mg[Cl.sub.2] 1.5 mM, dNTPs 200 pM, 20 pmoles de cada cebador, Taq ADN-polimerasa 1 U y 50 ng de ADN genomico. La PCR se inicio con una desnaturalizacion del ADN a 94[grados]C por 4 min seguido de 35 ciclos repetitivos a 94[grados]C por 45 s, 45[grados]C por 55 s y 72[grados]C por 45 s, con una extension final a 72 [grados]C por 7 min. La verificacion de los productos amplificados se realizo por electroforesis en gel de agarosa 1% con tampon TBE 0.5X. La secuencia nucleotidica del gen lip de Marinobacter sp. LB se obtuvo con el metodo de Sanger a traves de los servicios de secuenciacion de la Universidad Peruana Cayetano Heredia.

Analisis del gen lip y modelado de la Lipasa de Marinobacter sp. LB.--La transcripcion y traduccion del gen lip, se realizo con el programa Bioedit (Hall 1999) considerando un marco de lectura + 1. La secuencia de aminoacidos fue sometida a un alineamiento local utilizando la herramienta BLAST, de la base de datos GenBank, y se extrajo algunas secuencias de lipasas de la Familia I.

Posteriormente, se realizo un alineamiento multiple con el programa ClustalX 2.1 (Thompson et al. 1997). Se compararon 21 secuencias de lipasas, entre las cuales figuraba la secuencia de Marinobacter sp. LB, las del GenBank y lipasas representativas de la Familia I obtenidas de Arpigny y Jaeger (1999). Este segundo alineamiento se realizo con la finalidad de verificar la familia a la que pertenece nuestra enzima y elucidar las regiones conservadas como el pentapeptido Gly-X-Ser-X-Gly.

Con ayuda del programa SignalP (Petersen et al. 2011), se determino el peptido senal en la region amino terminal de la proteina en estudio. Para este analisis se considero que Marinobacter sp. LB es una bacteria Gram negativa y la lipasa producida es extracelular (Chavez-Hidalgo 2010, Fernandez-Jeri et al. 2013).

Seleccion de la estructura molde. --Para seleccionar a la mejor estructura molde, se buscaron secuencias proteicas obtenidas a partir de estudios cristalograficos en las bases de datos Protein Data Bank (PDB) y UniProtKB. Las secuencias encontradas se compararon con la obtenida en este estudio. El molde elegido fue la lipasa codificada como 1EX9 (secuencia plantilla), perteneciente a Pseudomonas aeruginosa PAO1.

Modelamiento homologo.--El modelamiento homologo se construyo utilizando el programa Swiss-PDB Viewer 4.0.4 (Guex & Peitsch 1997) en modo proyecto, el cual permite analizar la estructura tridimensional de las proteinas. Este analisis se basa en el alineamiento entre la secuencia blanco (secuencia en estudio) con la plantilla. Durante este proceso, se identifican las estructuras secundarias y terciarias de la plantilla, mapeando los residuos similares con la secuencia blanco. Asi, se alinearon las secuencias, luego se realizo la inspeccion visual y se edito manualmente el alineamiento, para aumentar sitios conservados y finalmente, se superpuso las secuencias de aminoacidos. Asimismo, se calculo la raiz de la desviacion cuadratica media (RMSD) con el mismo programa para evaluar la confiabilidad de la estructura modelada.

La superficie electrostatica de la lipasa modelada se determino empleando APBS (Adaptive Poisson-Boltzmann Solver) que realiza calculos electrostaticos de Poisson-Boltzmann sobre biomoleculas (Baker et al. 2001) para describir la complementariedad ligando-proteina basado en la estructura geometrica e interacciones electrostaticas pues desempenan un papel importante en la catalisis enzimatica. El modelo se visualizo utilizando el programa PyMOL (DeLano 2002).

Validacion del modelamiento.--El proceso de validacion se realizo para verificar que el modelado de la lipasa cumple con los requisitos minimos de calidad. En consecuencia, el modelo fue sometido a los analisis de: evaluacion de la calidad estereoquimica de los puntos de Ramachandran, con el programa RAMPAGE (http://mordred.bioc.cam.ac.uk/~rapper/rampage.php); evaluacion del entorno de los aminoacidos considerando la calidad de la estructura proteica, con Verify 3D (Bowie et al. 1991, Luthy et al. 1992) y analisis de las regiones plegadas, utilizando ERRAT (Colovos & Yeates 1993). Los dos ultimos programas estuvieron en el servidor del Instituto DOE de la Universidad de California, Los Angeles (http://www.doe-mbi.ucla.edu/).

Acoplamiento molecular .--Con la finalidad de obtener las energias de acoplamiento y el posible modo de interaccion entre la lipasa de Marinobacter sp. LB y los tres sustratos seleccionados, se realizaron los dos analisis descritos a continuacion:

El primero se realizo con el programa HEX 8.0.0 (Ritchie et al. 2008), los sustratos fueron tributirina (CID: 6050), trioctanoina (CID: 10850) y trioleina (CID: 11970724), extraidos de la base de datos de moleculas quimicas del NCBI (PubChem). Los parametros utilizados fueron predeterminados por el programa que simulo varias orientaciones posibles con sus respectivas energias de acoplamiento, brindando el modelo mas viable. El tipo de correlacion y la salida del post procesamiento para el receptor y el ligando se mantuvieron con base a la forma, el potencial electrostatico y la minimizacion de la mecanica molecular (MM). El acoplamiento se llevo a cabo a rotacion total del ligando manteniendo la posicion del receptor fija en el espacio. Este programa fue validado reproduciendo tres modelos cristalograficos de lipasas pertenecientes a Pseudomonas aeruginosa (PDBID: 1EX9), Burkholderia cepacia (PDBID: 1YS1) y Pseudomonas cepacia (PBDID: 1HQD) en interaccion con RC(RP,SP)-1,2-dioctil carbamoil-glicero-3-O-octilfosfonato (CID: 445454), acido hexilfosfonico (R)-2-metil-3-fenil propil ester (CID: 4369425) y 1-fenoxi-2-acetoxibutano (CID: 446123), respectivamente. Los acoplamientos para la validacion fueron realizados retirando los sustratos de los modelos cristalograficos con ayuda del programa Swiss-PDB Viewer 4.0.4 (Guex & Peitsch 1997) y acoplandolos nuevamente con el programa HEX 8.0.0 (Ritchie et al. 2008). Ademas, las interacciones se analizaron con el programa Discovery Studio 2017 R2 (Dassault Systemes BIOVIA, San Diego, CA, USA).

El segundo analisis de acoplamiento para tributirina, trioctanoina y trioleina fue realizado con el modulo de acoplamiento FlexX del programa LeadIT 2.1.8 (https://www.biosolveit.de/); los resultados fueron evaluados usando la funcion de puntuacion HYDE en SEESAR 70 (https://www.biosolveit.de/). El punto de partida fue la estructura obtenida por modelamiento homologo de la lipasa de Marinobacter sp. LB. Para este estudio, el sitio de union en la proteina se limito a 10 A y las 50 soluciones con mejores puntuaciones (FlexX) de cada ligando fueron conservadas y posteriormente analizadas para obtener las puntuaciones subsecuentes con SEESAR; por ultimo, se seleccionaron las posturas con las mejores puntuaciones.

Resultados

Amplificacion del gen lip.-A partir del ADN amplificado y separado en gel de agarosa 1% (Fig. 1), se calculo que el gen lip de Marinobacter sp. LB midio aproximadamente 998 pb. Este calculo fue realizado por regresion lineal y el producto amplificado fue secuenciado. El electroferograma mostro picos bien definidos para cada base, sin ruido ni superposiciones.

Analisis del gen lip y modelamiento de la lipasa de Marinobacter sp. LB.--La secuencia genica de la lipasa de Marinobacter sp. LB, desde el codon de inicio hasta el de termino, fue de 927 nucleotidos y se analizo con Bioedit (Hall 1999) para obtener una cadena aminoacidica de 308 aminoacidos (material complementario 1).

Para el estudio de la estructura primaria se utilizaron 21 secuencias proteicas: once descritas por Arpigny y Jaeger (1999); nueve obtenidas de la base de datos GenBank y una perteneciente a nuestra lipasa. De todas las enzimas, las secuencias de Pseudomonas aeruginosa ATCC31156, Burkholderia glumae CBS322.89, Burkholderia cepacia, Chromobacterium viscosumATCC6918 son representativas de la familia I (Tabla 1).

El tamano aproximado (incluido los gaps) de las secuencias alineadas fue de 391 posiciones y se pudo evidenciar la triada catalitica (Ser-Asp-His) dentro de las regiones conservadas presentes en las lipasas del genero Marinobacter y de la familia I (Fig. 2). Tales regiones incluyeron: el pentapeptido conservado Gly-His-Ser-Gln(His)-Gly, que contiene al primer aminoacido catalitico (Ser); la region Asn-Asp-Gly-Leu-Val, presenta al segundo aminoacido catalitico (Asp); y la secuencia Asn(Asp)His-Leu-Asp, posee al tercer aminoacido catalitico (His).

El tamano de la proteina inmadura es de 308 aa, constituida en mayor proporcion por glicina (11%), alanina (9.4%) y leucina (9.1%); en forma minoritaria, por acido glutamico (1.9%), triptofano (1.9%) y cisteina (0.6%). La secuencia del peptido senal detectada por SignalP (Petersen et al. 2011) esta en la region N-terminal de la proteina, compuesta por los primeros 24 aa. Por lo tanto, la lipasa madura extracelular tendria un tamano teorico de 284 residuos con peso molecular de 29.99 kDa, pI de 8.89. En base al alineamiento multiple, se pronostico que los aminoacidos cataliticos de nuestra lipasa son Ser78, Asp229 e His251. Mientras que, la Cys180 y Cys235 participan en la formacion del puente disulfuro. Cabe senalar que las lipasas son dependientes de calcio (Jaeger et al. 1999), siendo los posibles residuos de union a este cofactor Asp210 y Asp253 (Fig. 3).

Para la seleccion de la estructura molde y posterior modelamiento de la lipasa se comparo la secuencia aminoacidica en estudio con las bases de datos (PDB, UniProtKB) y se encontro seis proteinas equivalentes provenientes de diferentes especies bacterianas (Tabla 2). De las cuales, Pseudomonas aeruginosa PAO1 (43%), Proteus mirabilis (37%) y Pseudomonas glumae (34%) presentan estudios por cristalografia. Los analisis evolutivos demuestran que las especies de Marinobacter tienen mayor relacion evolutiva con Pseudomonas aeruginosa y menor relacion con el genero Proteus (Anzai et al. 2000). El porcentaje de identidad, la estructura cristalografica y la relacion evolutiva fueron los factores que determinaron a la lipasa 1EX9, perteneciente a Pseudomonas aeruginosa PAO1, como molde (plantilla) para el modelaje por homologia.

El modelo fue construido con el programa Swiss-PDB Viewer (Guex & Peitsch 1997), para lo cual, primero se realizo el alineamiento de nuestra secuencia madura con la lipasa 1EX9 de Pseudomonas aeruginosa PAO 1. Durante la ejecucion del programa, se logro reconocer las estructuras secundarias propias de la plantilla, en base a su estructura cristalografica. Por tal motivo, en las regiones donde los aminoacidos de ambas secuencias coincidian, se construyo la estructura terciaria de la lipasa de Marinobacter sp. LB. La raiz de la desviacion cuadratica media (RMSD) obtenido con el mismo programa, en donde se ajustaron los carbonos alfa de la estructura en mencion, fue 0.32 A.

La representacion grafica del modelaje por homologia de la lipasa se observo con el programa Discovery Studio 2017 R2 (Dassault Systemes BIOVIA, San Diego, CA, USA), diferenciando que 11 [alfa]-helices se encuentran distribuidas en toda la proteina, mientras que 7 de las 9 laminas-[beta] se agrupan en la region central de la biomolecula (Fig. 4). La lipasa madura de Marinobacter sp. LB no presenta el peptido senal, motivo por el cual el porcentaje de identidad con la lipasa (PBDID: 1EX9) aumenta a 45.85%. En la Figura 4 se observa que nuestra enzima es monomerica. La superficie electrostatica de la enzima (Fig. 5) evidencia que la polaridad del ligando y de la superficie de la lipasa modelada, son complementarias.

Validacion del modelamiento.--Previo al acoplamiento molecular, el modelo desarrollado fue validado mediante la evaluacion de la calidad estereoquimica y del entorno de los aminoacidos. En la primera evaluacion, el programa RAMPAGE genero el diagrama de Ramachandran (Fig. 6) a partir de la conformacion de los aminoacidos, en base a los giros que existen entre los enlaces del carbono alfa con los grupos amino y carboxilo, denominados angulos phi (O) y psi (V), respectivamente. La figura 6A presenta tres regiones definidas, evidenciando la presencia de laminas-[beta], [alfa]-helices con giros a la derecha e izquierda. La figura 6B indica la posicion de los aminoacidos, en donde el 92.6% estan en la region "favorecida" (zonas oscuras), 6% en la "permitida" (zonas claras) y 1.4% en la "desfavorable" (zonas blancas).

En la segunda evaluacion, el programa ERRAT (Colovos & Yeates 1993) identifico la presencia de regiones incorrectamente plegadas, pues 12 aa pertenecen a regiones inconsistentes. Sin embargo, 272 aa forman parte de regiones plegadas dentro del limite permitido (Fig. 7), por lo que el programa brindo un "Factor de calidad general" del 95.604 %. Por otra parte, se analizo la compatibilidad de la estructura terciaria (3D) con la primaria (1D) usando el programa Verify 3D (Bowie et al. 1991, Luthy et al. 1992), con puntuaciones que varian desde -1 (puntaje malo) hasta +1 (puntaje bueno), en este caso la compatibilidad fue del 78.52% que representa un "puntaje promedio 3D-1D" [mayor que o igual a] +0.2.

Acoplamiento molecular.--Las energias de acoplamiento molecular fueron determinadas enfrentando la lipasa modelada con los sustratos. Para este fin, se realizo evaluaciones con el programa HEX (Ritchie et al. 2008) en donde se emplearon 2000 soluciones de acoplamiento en cada caso y se obtuvo las energias -248.11, -314.28 y -215.44 kcal/mol para tributirina, trioctanoina y trioleina, respectivamente (Tabla 3).

Las mismas condiciones fueron utilizadas para validar el programa HEX (Ritchie et al. 2008), donde se reprodujo el acoplamiento de las lipasas 1EX9, 1YS1 y 1HQD con sus respectivos sustratos, dando energias de acoplamiento muy bajas, lo que significa que existe una alta probabilidad para estas interacciones. Con el uso del programa Discovery Studio 2017 R2, se encontro que varios aminoacidos de cada bolsillo de union de las estructuras cristalograficas (Tabla 4) tambien participaban del reconocimiento de los ligandos en los modelos pronosticados.

Ademas, el programa HEX (Ritchie et al. 2008) brindo coordenadas de interaccion enzima-sustrato para la lipasa de Marinobacter sp. LB obteniendose valores muy similares para tributirina, trioctanoina y trioleina. Estas coordenadas en conjunto con el modelo homologo de la lipasa fueron utilizadas como punto de partida en los estudios de acoplamiento molecular realizados con el programa con LeadlT, el cual revelo que los tres sustratos se unen en el mismo bolsillo de union (Fig. 8). La postura de los sustratos en la region de la enzima fue evaluada usando el programa HYDE, donde las puntuaciones son producto de la prediccion de la afinidad de los ligandos a la proteina mediante los valores de la constante de disociacion Ki (Tabla 3), un menor valor de Ki representa una mayor afinidad de la enzima por su sustrato, en consecuencia esto significa que las bajas concentraciones de sustrato pueden ser reconocidas por la enzima y ejercer su efecto. Los aminoacidos del bolsillo que interaccionan con los tres sustratos son Asnl67, Lysl06,Trpl72, Thrl64, Alal79, ademas Argl77 y Cys235 coinciden para tributirina y trioctanoina, tal como se muestra en la Figura 8.

Discusion

La clasificacion de las lipasas fue propuesta por Arpigny y Jaeger (1999) resaltando regiones conservadas en la familia I las que contienen a los aminoacidos de la triada catalitica, las mismas que estan en la lipasa en estudio (Fig. 2). Por tal motivo, se podria considerar a esta enzima dentro del grupo de las verdaderas lipasas. La secuencia aminoacidica inmadura es de 308 residuos, el tamano de estas proteinas depende de la familia a la que pertenece, la especie y del espacio donde actua. Asi mismo, las lipasas extracelulares bacterianas por lo general presentan un peptido senal (Ihara et al. 1991, Frenken et al. 1992, Sangeetha et al. 2014, Sullivan et al. 1999, Park et al. 2009) en la region N-terminal, reconocido por receptores de membrana y proteinas de secrecion que permiten su salida al medio externo (Jaeger et al. 1999). En tal sentido, el reconocimiento de un peptido senal de 24 aa en la secuencia de la lipasa, se puede sustentar con los trabajos realizados por Alejandro-Paredes (2012) y FernandezJeri et al. (2013) quienes describen que la lipasa de Marinobacter sp. LB es extracelular.

La secuencia madura de la lipasa presento 284 residuos, 29.99 kDa y pl de 8.89. Los aminoacidos de la triada catalitica son Ser78, Asp229 e His251, tambien se reconocieron los residuos de union al Ca2+ en las posiciones Asp210 y Asp253. Hallazgos similares fueron reportados por Ihara et al. (1991) quienes describen lipasas de Pseudomonas nov. sp. 109, cuya secuencia madura presenta 311 aa, 30.149 kDa y pl de 7; Frenken et al. (1992) caracterizaron una lipasa de Pseudomonas glumae PG1, con una secuencia madura de 319 aa, 33.1 kDa y pl de 7.2, los residuos cataliticos descritos fueron Ser87, Asp241 e His285; Sullivan et al. (1999) presentaron una lipasa de Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 de 313 aa, 32.5 kDa y pl de 6.16, identificaron los residuos Asp240 y Asp281 como los de union al Ca2+, mientras que los aminoacidos cataliticos fueron Ser111, Asp258 e His280; Alquati et al. (2002) reportaron una lipasa de Pseudomonas fragi IFO 3458 con 293 aa, 32.086 kDa y pI de 9.33, la triada catalitica fue Ser83, Asp238 e His260; An et al. (2003) identificaron una lipasa de Pseudomonas sp. SW-3, con 311 aa y 31 kDa, los residuos cataliticos fueron Ser108, Asp255 e His277, y los residuos de union al Ca2+ descritos como Asp240 y Asp279.

El porcentaje de identidad entre la lipasa en estudio con la de Pseudomonas aeruginosa PAO1 fue de 45.85%, otros modelos como el desarrollado por Gupta et al. (2015) utilizan 80.5% de identidad entre su lipasa y la estructura molde. Sin embargo, un porcentaje mayor no asegura el desarrollo de un buen modelo homologo (Ali et al. 2013). Asi lo demuestran Messaoudi et al. (2011) y Lanka et al. (2015) quienes modelaron lipasas con identidades del 32% y 32.77%, respectivamente. Mas aun, Yang et al. (2000) demuestran que porcentajes de identidad mayores al 25% indican estructuras tridimensionales semejantes entre dos proteinas.

La estructura tridimensional de la lipasa de Marinobacter sp. LB, presento 11 [alfa]-helices perifericas y 9 laminas-[beta] ubicadas principalmente en la region central, similar a lo descrito por Messaoudi et al. (2011) quienes describen en su modelo 8 laminas-[beta] centrales. El plegamiento y estabilidad de nuestra lipasa depende de: los puentes de hidrogeno, entre aminoacidos polares; interacciones hidrofobicas, entre residuos apolares (glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina); y un puente disulfuro generado entre los grupos tiol (-SH) de los residuos Cys180 y Cys235, tambien descrito por Frenken et al. (1992), An et al. (2003), Sangeetha et al. (2014) y Sullivan et al. (1999). En relacion al RMSD, los modelos que presentan un porcentaje de identidad entre 90% a 95%, suelen tener valores entre 1 y 0.5 A (Rost 1999, Vivas-Reyes et al. 2010), por lo que puntuaciones inferiores a 0.5 A deben considerarse estructuralmente confiables, tal como sucede con el valor de 0.32 A obtenido con Swiss-PDB Viewer (Guex & Peitsch 1997).

En la validacion de la estructura de la lipasa (Fig. 4), el programa RAMPAGE determino tres regiones: favorecida (92.6%), permitida (6%) y atipica (1.4%). Cabe resaltar que el programa recomienda valores aproximados al 98% en la region favorecida, sin embargo, el puntaje obtenido es aceptable por ser un modelo predictivo y no una estructura cristalografica completamente resuelta (Ali et al. 2013). Al respecto, Messaoudi et al. (2011) y Ali et al. (2013), mencionan que valores superiores al 90% indican modelos con buena calidad estereoquimica.

El programa ERRAT (Colovos & Yeates 1993) asigno un "Factor de calidad general" de 95.60% que indica un buen modelo estructural debido a que el programa recomienda valores superiores a 95%. A pesar de esto, se han validado estructuras con 84.67% (Lanka et al., 2015). Por otro lado, el programa Verify 3D muestra que el 78.52% de los aminoacidos presenta un "Puntaje promedio 3D-1D" mayor a +0.2. En este contexto, Bowie et al. (1991) y Luthy et al. (1992), indican que por lo menos el 65% de aminoacidos deben tener puntajes mayores a +0.2, lo cual demuestra una buena relacion entre el modelo tridimensional y la estructura primaria. Asi, todos los analisis reflejan un modelo predictivo adecuado de la lipasa de Marinobacter sp. LB.

En los analisis de acoplamiento, los tres sustratos se unieron al mismo bolsillo, en interaccion con los aminoacidos Asn167, Lys106, Trp172, Thr164, Ala179, y parcialmente con Arg177, Cys235, Val175, Asn176, Cys180, Asn178. La ausencia de los residuos de la triada catalitica indica que los aminoacidos cataliticos son los mas reactivos y en consecuencia importantes en la catalisis enzimatica, pero no necesariamente intervienen en la union enzima-sustrato. De manera similar, Gupta et al. (2015) describen el acoplamiento de una lipasa de Pseudomonas fluorescens con p-nitrofenil, ion acetato y dietil fosfonato, mediante los residuos Leu26, Tyr29, Asn31, Asp33, Pro315 y Thr316. Por otro lado, las energias de acoplamiento y constantes de disociacion Ki (tabla 3) indican que la lipasa de Marinobacter sp. LB tiene mayor afinidad por la trioctanoina, seguido por tributirina y trioleina, puesto que la menor energia utilizada en la union enzima-sustrato genera mayor probabilidad de acoplamiento (Ritchie et al. 2008) y valores bajos de la contante Ki indican que la enzima puede reconocer bajas concentraciones del sustrato y ejercer su efecto catalitico. Los estudios experimentales realizados por AlejandroParedes (2012), donde la lipasa de Marinobacter sp. LB degrada mas tributirina que trioleina, refuerzan lo antes mencionado. Adicionalmente, describen que las lipasas interaccionan con bajas energias de acoplamiento con trioctanoina, tributirina y trioleina (Messaoudi et al. 2011, Lanka et al. 2015).

Conclusion

La lipasa de Marinobacter sp. LB fue construida por modelamiento homologo, la estructura tridimensional fue validada en base a la calidad estereoquimica y el entorno de sus aminoacidos. Los analisis de acoplamiento con sustratos naturales de lipasas, permitieron evidenciar los aminoacidos que participan en el bolsillo de union. Este trabajo propone alternativas para la caracterizacion parcial y total de proteinas a partir de secuencias genicas. Se recomienda para futuras investigaciones de esta lipasa, realizar estudios de optimizacion por dinamica molecular.

doi: http://dx.doi.org/ 10.15381/rpb.v25i3.15208

Agradecimientos

A BioSolveIT GmbH de la Universidad Estadual de Campinas por el acceso a los programas LeadIT 2.1.8 y Seesar 70 para el analisis quimioinformatico.

Litertura citada

Alejandro-Paredes A. 2012. Produccion en cultivo discontinuo y caracterizacion parcial de lipasas de Marinobacter sp. aislada de las salinas de Pilluana [Tesis para obtener el titulo de Quimico Farmaceutico]. Facultad de Farmacia y Bioquimica. Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

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Jhosep Avila (1), Amparo Iris Zavaleta (1), Mercedes Palomino (1), Christian Solis-Calero (2)

(1) Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Facultad de Farmacia y Bioquimica, Lab. de Biologia Molecular. Jiron Puno 1002 Cercado de Lima, Peru.

(2) Departamento de Biologia Estrutural e Funcional. Universidade Estadual de Campinas.

E-mail Jhosep Avila: shonatan@hotmail.com,

E-mail Amparo Iris Zavaleta: azavaletap@unmsm.edu.pe,

E-mail Mercedes Palomino: mepa_8815@hotmail.com.

E-mail Christian Solis Calero: c180276@dac.unicamp.br

Presentado: 27/11/2017

Aceptado: 12/09/2018

Publicado online: 25/09/2018

Fuentes de financiamiento: Este estudio fue financiado parcialmente por los contratos 017-FINCYT-PIBAP-2008 y 007-FUNDECYT-2014.

Informacion sobre los autores:

JA realizo las pruebas experimentales, analisis bioinformatico. AIZ realizo la asesoria del trabajo, pruebas experimentales, analisis bioinformatico. MP realizo las pruebas experimentales. CS-C realizo el analisis bioinformatico. Todos los autores participaron en la redaccion, revision y aprobacion del manuscrito.

Los autores no incurren en conflictos de intereses.

Leyenda: Figura 1. Gel de agarosa 1%, mostrando el producto del gen lip de Marinobacter sp. LB. Lineas: B, blanco; MP, marcador de peso molecular; M, gen lip (flecha).

Leyenda: Figura 2. Alineamiento de lipasas de la familia I incluido Marinobacter sp. LB. Letras: en rojo indican, triada catalitica (SerAsp-His); con cuadros negros, aminoacidos conservados; con cuadros plomos, aminoacidos con propiedades similares. A, regiones cercanas al extremo N-terminal que incluyen al pentapeptido Gly-X-Ser-X-Gly, en asteriscos. B, regiones cercanas al extremo C-terminal que incluyen las secuencias Asn-Asp-Gly-Leu-Val y Asn(Asp)-His-Leu-Asp, en asteriscos.

Leyenda: Figura 3. Estructura primaria de la lipasa de Marinobacter sp. LB.--, secuencia madura de la lipasa con 284 aa; GXSXG, pentapeptido conservado de la familia I; SDH, triada catalitica; C, residuos de cisteinas formadoras del puente disulfuro; DD, posibles residuos de acido aspartico que forman enlaces con [Ca.sup.2+].

Leyenda: Figura 4. Representacion de la lipasa de Marinobacter sp. LB modelada con Swiss-PDB Viewer y visualizada con Discovery Studio 2017 R2. Laminas turquesa, laminas-[beta]. Espirales rojas, [alfa]-helices.

Leyenda: Figura 5. A, Representacion de las estructuras secundarias de la lipasa modelada de Marinobacter sp. LB usando el programa PyMOL. B, Calculo de superficie electrostatica usando el programa APBS (Adaptative Poisson-Boltzman Solver). Las superficies con carga negativa y positiva estan de rojo (-5 kT e-1) y azul (+5 kT e-1), respectivamente.

Leyenda: Figura 6. Diagrama Ramachandran de la lipasa modelada de Marinobacter sp. LB, donde se visualiza las regiones energeticamente permitidas para los angulos Phi ([phi]) y Psi ([psi]. A, la region media derecha, superior y media izquierda, pertenecen a las [alfa]-helices con giro a la izquierda, laminas-[beta] y [alfa]-helices con giro a la derecha, respectivamente. B, Diagrama Ramachandran desglosado mostrando las regiones favorecidas (zonas oscuras), permitidas (zonas claras) y rechazadas (zona blanca), el diagrama muestra las parcelas de los posibles angulos [phi] y [psi] de los aminoacidos en general, glicina, pre-prolina y prolina.

Leyenda: Figura 7. Diagrama ERRAT para la lipasa modelada de Marinobacter sp. LB. Las barras blancas representan regiones con menor tasa de error para el plegamiento de proteinas, las negras indican regiones plegadas de manera erronea y las grises representan regiones con error entre el 95 y 99%.

Leyenda: Figura 8. Representacion de las mejores posturas de acoplamiento de los sustratos trioctanoina (A-B), trioleina (C-D) y tributirina (E-F), usando el modelo de homologia de la lipasa de Marinobacter sp. LB generado por el modulo de acoplamiento FlexX del programa LeadIT, seguido de evaluaciones usando la funcion de puntuacion de HYDE en SEESAR. A, C, E, indican diagramas de las interacciones de los complejos sustrato-enzima, las lineas punteadas rojas y continuas verdes indican puentes de hidrogeno e interacciones de Van Der Waals, respectivamente. B, D, F, presentan la vista lateral de las interacciones del complejo enzima-sustrato. La superficie de la lipasa se genero mediante calculo de superficie electrostatica usando APBS.
Tabla 1. Codigos de las secuencias aminoacidicas de
lipasas de la familia I utilizadas en el analisis bioinformatico

Especie                              Cepa        Codigo de acceso
                                                   (gb/emb/dbj)

Pseudomonas fluorescens               C9            AAC15585.1
P. fragi                          IFO-12049         CAA32193.1
P. aeruginosa (1)                 ATCC31156         BAA09135.1
P. mendocina                         ymp          WP_003239806.1
P. mendocina                       PK-12CS          AAM14701.1
P. stutzeri                           --           WP_011913157
P. wisconsinensis                LMG P-15151        AAB53647.1
P. luteola                            --            AAC05510.1
Acinetobacter calcoaceticus         BD413           CAA56780.1
Proteus vulgaris                     K80            AAB01071.1
Burkholderia glumae (1)           CBS 322.89        CAA49812.1
B. cepacia1                           --            AAA50466.1
Vibrio cholerae                    12129(1)          EEN99655
Rhodoferax ferrireducens             T118         WP_011465630.1
Myxococcus xanthus                    --          WP_011555480.1
Chromobacterium violaceum         ATCC12472         NP_902384.1
C. viscosum (1)                    ATCC6918          Q05489.1
Marinobacter adhaerens (2)           HP15           CP001978.1
M. manganoxydans (2)                MnI7-9       NZ_AGTR01000039.1
M. algicola (2)                     DG893        NZ_ABCP01000010.1

(1) Secuencias representativas de lipasas de la Familia I (verdaderas
lipasas).

(2) Secuencias de aminoacidos obtenidas a partir del genoma completo.

Tabla 2. Porcentaje de identidad de la secuencia aminoacidica de la
lipasa de Marinobacter sp. LB con lipasas de referencia

Bacteria                                  Enzima              Codigo
                                                            de acceso

Vibrio cholerae                   Triacilglicerol lipasa     P15493.2
Pseudomonas aeruginosa PAO1 (1)           Lipasa               1EX9
Proteus mirabilis                         Lipasa               4HS9
Pseudomonas sp. 109                       Lipasa              P26877
Pseudomonas sp. KWI-56            Triacilglicerol lipasa      P25275
Pseudomonas glumae (1)                    Lipasa               1TAH

Bacteria                          Identidad     Base de
                                     (%)         datos

Vibrio cholerae                       51       UniProtKB
Pseudomonas aeruginosa PAO1 (1)       43          PDB
Proteus mirabilis                     37          PDB
Pseudomonas sp. 109                   43       UniProtKB
Pseudomonas sp. KWI-56                35       UniProtKB
Pseudomonas glumae (1)                34          PDB

(1) presentan estructura cristalografica

Tabla 3. Puntuacion de los metodos utilizados para realizarei
acoplamiento molecular.

Sustrato             Puntuacion HYDE (1)       Puntuacion HEX (2)
                            (uM)                   (Kcal/mol)

Trioctanoina         2.761>Ki Hyde>0.028            -314.28
Tributirina         443.692>Ki Hyde>4.466           -248.11
Trioleina          1766.043>Ki Hyde>17.775          -215.44

(1) puntuacion para la mejor posicion.

(2) puntuacion para el mejor acoplamiento.

Tabla 4. Lipasas utilizadas en la validacion del programa HEX.

Bacteria                                    Sustrato

Pseudomonas aeruginosa     RC-(RP,SP)-l,2-dioctil carbamou-glicero-3-
  PAO1                                  O-octilfosfonato
Burkholdma cepacia          acido hexilfosfonico (R)-2-metil-3-fenil
                                          propil ester
Pseudomonas cepacia                 1-fenoxi-2-acetoxibutano

                            Energia de          Aminoacidos que
Bacteria                   acoplamiento        coinciden en los
                          (Kcal/mol) (1)    bolsillos de union (2)

Pseudomonas aeruginosa        -390.15        Ser82, Metio, Leu118
  PAO1
Burkholdma cepacia            -256.14        Gln88, Leu17, Leu167
Pseudomonas cepacia           -216.50            Leu167, Leu17

(1) Determinado por el programa HEX 8.0.0

(2) Bolsillos de union de la estructura cristalina y pronostico del
HEX 8.0.0
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Title Annotation:TRABAJOS ORIGINALES
Author:Avila, Jhosep; Iris Zavaleta, Amparo; Palomino, Mercedes; Solis-Calero, Christian
Publication:Revista peruana de biologia
Date:Aug 1, 2018
Words:7545
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