Printer Friendly

Determinacion de la viabilidad de semillas de orquideas utilizando la prueba de Tetrazolio e indigo carmin.

Determining the Viability of Orchid seeds using the Tetrazolio and Carmin Indigo Tests

1 Introduccion

La familia Orquidaceae es de las mas ricas en especies y con mayor riesgo de extincion del reino Plantae en el mundo [1]. Posee alrededor de 25.000 a 30.000 especies distribuidas en 880 generos [2]. Son conocidas por sus flores hermosas y duraderas, crecen en una amplia gama de habitats; que van desde epifitas, terrestres y rupicolas [3,4]. Colombia reporta 4010 especies, agrupadas en 260 generos [5]. En Norte de Santander se han registrado 37 generos y 105 Especies [6].

Las orquideas son extremadamente susceptibles a la alteracion de sus habitats en comparacion con otras plantas [6,7], lo cual ha llevado a la disminucion de sus poblaciones debido a la perdida de habitat y la excesiva recoleccion para el ornamento [9, 10]. Actualmente la intervencion del hombre ha aumentado la desaparicion y fragmentacion de los bosques tropicales, sometiendo en riesgo una gran variedad de especies de orquideas [11]. En la region de Pamplona, Norte de Santander, las orquideas se han visto perjudicadas por la disminucion de sus habitats, ocasionada por la actividad agricola, ganadera y de desarrollo urbano [6], de tal manera, varias especies han sido reportadas en el libro rojo de las plantas de Colombia [12]. Ademas, las semillas se caracterizan por ser muy pequenas: 1.0-2.0 mm de largo y 0.5-1.0 mm de ancho [13], la tasa de germinacion es muy limitada ya que la semilla tiene poca reserva alimenticia, por lo que se hace necesario que existan asociaciones simbioticas con un hongo formador de micorrizas para lograr su germinacion en condiciones naturales [14, 15, 16]. Por tal motivo, se hace necesario analizar la capacidad germinativa (viabilidad) de las semillas de orquideas, considerando la situacion de peligro de extincion y su papel importante en el ecosistema [17]. Para determinar la viabilidad de semillas se han desarrollado diferentes metodos bioquimicos, dentro los cuales encontramos: indigo carmin y tetrazolio [18, 19, 20].

La prueba de indigo carmin no es aceptada por la International Seed Testing Association (ISTA), Sin embrago, se ha utilizado para evaluar la viabilidad en un determinado grupo de plantas [21, 22, 23]. Esta prueba produce una coloracion diferencial de los tejidos vivos y muertos del embrion. Asi, se tinen de azul las semillas muertas por el aumento en la permeabilidad de la membrana y las no viables permanecen incoloras [18].

En orquideas la prueba mas utilizada es la de tetrazolio [24, 25, 26, 27], la cual es aprobada por el ISTA [28]. Esta prueba refleja la actividad de las enzimas deshidrogenasas que intervienen en la respiracion celular [29, 30, 31], dando como resultado una coloracion roja a las semillas viables, mientras que las no viables quedan del color natural de la semilla [15]. En el presente estudio se determina la viabilidad de las semillas de las especies de orquideas Elleanthus arauntiacum, Epidendrum sp, Maxillaria sp, Odontoglossum lindenii, Prosthechea sp, Telipogon dubios, Stelis sp, Elleanthus sp, Epidendrum elongatum y Cyrtochilum sp, utilizando la prueba de Tetrazolio e Indigo Carmin.

2 Materiales y metodos

2.1 Material Vegetal

Las capsulas maduras de las especies de orquideas fueron colectadas en la vereda El Escorial en Norte de Santander, Colombia (Tabla 1; Figuras 1 y 2), donde se realizo una breve descripcion del habitat de las especies de orquideas encontradas. Para identificar las capsulas maduras se observo la transicion de color verde a amarillo [32]. El metodo de coleccion de orquideas con capsulas se realizo al azar, debido a que no existe un metodo determinado que permita hacer una coleccion que origine datos para un analisis estadistico [6]. Seguidamente fueron extraidas las semillas para ser almacenadas en sobres de papel kraft a 4[grados]C en un recipiente plastico al cual se le aplico 10 g de silica gel durante dos dias para evitar que las semillas se deterioren por la humedad [33, 34, 35].

[FIGURA 1 OMITIR]

[FIGURA 2 OMITIR]

2.2 Viabilidad de Semillas

Prueba de Tetrazolio (2,3, 5-cloruro trifenil tetrazolio: solucion incolora).

Se sumergieron 100 semillas de cada especie de orquidea en la solucion de tetrazolio al 1% con un pH de 6.5, durante 24 horas en la oscuridad, seguidamente se realizo la evaluacion de la viabilidad en el microscopio estereoscopio (Leica EZ4: 350X). Se hicieron 5 replicas del proceso de viabilidad por especie de orquidea. Las semillas viables se tineron de rojo, debido a la reduccion del tetrazolio por la actividad respiratoria de las celulas [28, 30, 36].

Prueba de indigo Carmin (3,3-dioxo-2,2-bi-indolilideno-5,5-disulfonato disodico: solucion de color azul).

Se sometieron 100 semillas de cada especie de orquidea en la solucion de indigo carmin al 0.15% con un pH de 6.5, durante 3 horas en la oscuridad. Posteriormente, se lavaron con agua destilada y luego se examinaron al microscopio estereoscopio (Leica EZ4: 350X) para evaluar la viabilidad de las semillas de orquideas. Se hicieron 5 replicas del proceso de viabilidad por especie de orquidea. En esta tecnica, las semillas no viables tinen azul, debido a que la permeabilidad de la membrana aumenta en las celulas muertas [22].

2.3 Diseno experimental y analisis estadistico

El diseno experimental utilizado, consistio en un modelo factorial 2x10 (2 pruebas x 10 especies) completamente al azar con 5 repeticiones de 100 semillas de orquideas por especie y un total de 100 unidades experimentales. Los datos se analizaron utilizando la varianza (Anova). Seguidamente, las medias se compararon utilizando la prueba de rangos multiples de HSD (Honestly Significant Difference) de Tukey para determinar las diferencias significativas a un nivel de P [menor que o igual a] 0.05 [37]. Ademas, se realizo el coeficiente de correlacion entre la prueba de Tetrazolio e Indigo Carmin. Para el analisis estadistico se utilizo el software Statgraphic Centurion[R] version 16.

3 Resultados y discusion

El rango de altura donde se encontraron orquideas con capsulas maduras en la vereda El Escorial en Norte de Santander; fue de 2500 a 2920 m.s.nm, corresponde a una cuchilla con laderas de pendientes pronunciadas, excepto en la parte mas alta donde forma un pequeno domo. En su parte baja presenta actividades economicas como ganaderia y agricultura, el cual ejerce presion extensiva sobre estas pequenas manchas de bosque. En esta zona se colectaron capsulas sobre la franja de vegetacion arbustiva con matorrales altos, predominan pequenos arboles de Roupala colombiana, Tovomita parviflora, Clusia multiflora, Myrsine coriaceae, Clethra ovalifolia; arbustos de Bejaria glauca, Psamisa sp, Myrciantes leucoxyla, Hesperomeles heterophylla. Presenta suelos arenoso-arcillosos con presencia de rocas de gran tamano, con vegetacion arbustiva rala y herbacea (Bejaria, sphyrospermum, Gaultheria); helechos de los generos Lophosoria, Pteridium y polypodium [6]. En esta vegetacion se encontraron las siguientes especies de orquideas con disponibilidad de capsulas: en ambiente terrestre (Elleanthus arauntiacum Maxillaria sp.), semiterrestre (Telipogon dubios), epifitas (Elleanthus arauntiacum, Odontoglossum lindenii, Prosthechea sp.).

En la parte alta del Escorial se presenta manchas de bosques primarios poco intervenidos, predominando la vegetacion arborea como: Weinmannia tometosa, Clusia sp. (tampacos), Alnus acuminata, Schefflera velutina. Las especies de orquideas con capsulas encontradas fueron: en ambiente terrestre, (Epidendrum sp, Elleanthus arauntiacum), litofitica (Elleanthus arauntiacum), epifitas (Odontoglossum lindenii, Stelis sp. y Cyrtochilum sp).

Los porcentajes de viabilidad utilizando la prueba de tetrazolio fueron muy variables, se encontro que las especies Maxillaria sp (93,8%), Cyrtochilum sp (93,4%) y Odontoglossum lindenii (91,0%) tuvieron un alto porcentaje de viabilidad. A diferencia, Elleanthus sp (69,2%) y Elleantus arauntiacum (73,2%) se encontraron porcentajes de viabilidad bajo (Tabla 2 y Figura 3).

[FIGURA 3 OMITIR]

En la prueba de viabilidad de indigo carmin los porcentajes fueron muy altos (95,6 a 99,8) en todas las especies de orquideas trabajadas (Tabla 2). Estos resultados muestran que la prueba de indigo carmin arrojo resultados muy positivos en cuanto a la viabilidad de las semillas.

Al analizar el coeficiente de correlacion (R2=0,419; Tabla 2) entre la prueba de tetrazolio e indigo carmin se encontro una relacion relativamente debil entre las pruebas, con diferencias estadisticamente significativas de P [menor que o igual a] 0.05. Estos resultados reflejan los altos porcentajes que se obtuvieron en la prueba de vialidad de indigo carmin en todas las especies trabajadas. Si se analiza el principio de esta prueba, donde las semillas no viables se tornan azul, debido al aumento de la permeabilidad de la membrana en celulas muertas [22], se pueden encontrar falsos positivos por exceso de colorante, es decir, semillas no viables se pueden identificar como viables, dificultando la evaluacion de la viabilidad en semillas de orquideas. Segun Benito et al., 2004 [21] y Marrero, 2007 [22], la prueba de indigo Carmin se utiliza con exito para determinar la viabilidad en las semillas de especies forestales y arbustivas respectivamente. Ademas, otros autores indican que el metodo del indigo carmin tiene ciertas ventajas en relacion con el metodo de tretrazolio en la especie herbacea Hordeum distichon L, ya que es mas economico y en solucion acuosa es mas estable, garantizando la durabilidad de la solucion. [18]. Sin embargo, en esta investigacion demostro que en orquideas la eficacia es baja, por los falsos positivos y el tamano pequeno de las semillas. En la prueba de tretrazolio los resultados son mas confiables debido a la facil identificacion de las semillas viables, las cuales toman una coloracion roja (Fig. 3) por la reduccion del tetrazolio a formazan, lo que indica que hay actividad respiratoria en la celula y, consecuentemente, que la semilla es viable [30, 38, 39]. Otras investigaciones han utilizado la prueba de tetrazolio en las semillas de orquideas de una forma exitosa [31, 35, 40, 41], aunque, la concentracion de la solucion de tretazolio puede variar de acuerdo a la especie de orquidea trabajada.

4 Conclusiones

La prueba de tetrazolio es confiable para la determinacion de la viabilidad de las semillas de Elleanthus arauntiacum, Epidendrum sp, Maxillaria sp, Odontoglossum lindenii, Prosthechea sp, Telipogon dubios, Stelis sp, Elleanthus sp, Epidendrum elongatum y Cyrtochilum sp, debido a que es una solucion incolora que puede penetrar facilmente las semillas. Por el contrario, la prueba de Indigo Carmin no es recomendable para predecir la capacidad germinativa de las semillas de orquideas. Se recomienda implementar diferentes metodologias que puedan ayudar a la conservacion de orquideas.

Seir Antonio Salazar Mercado

Universidad Francisco de Paula Santander

Javier Dario Gelvez Manrique

Universidad Simon Bolivar

Received: June 22, 2015

Accepted: December 1,2015

Agradecimientos

A la Universidad Francisco de Paula Santander por su valiosa colaboracion.

Referencias bibliograficas

[1] Zhang, Z., Yan, Y., Tian, Y., Li, J., He, J. S., y Tang, Z. (2015). Distribution and conservation of orchid species richness in China. Biological Conservation, 181, 64-72. doi: http://dx.doi.org/10.1016Zj.biocon.2014.10.026.

[2] Thorpe, T., y Yeung, E. (2011). Plant Embryo Culture: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Springer Science+Business Media, 710. doi: http:// dx.doi.org/10.1016/j.biocon.2014.10.026.

[3] Niknejad, A., Kadir, M., y Kadzimin, B. (2011). In vitro plant regeneration from protocorms-like bodies (PLBs) and callus of Phalaenopsis gigantea (Epidendroideae: Orchidaceae). African Journal of Biotechnology, 10(56), 11808-11816.

[4] Vij, S., y Pathak, P. (2012). Orchid Diversity: Conservation and Utilization. Proceedings of the National Academy of Sciences. India Section B: Biological Sciences, 82(2), 295-300.

[5] Mejia, H., y Pino, T. (2010). Diversity of Orchids Epiphytes in a Tropical Rain Forest (Bh-T) of Departament Choco, Colombia. Acta Biologica Colombiana, 15(2), 37-46.

[6] Diaz, J., Solano, F., Sanchez, L., y Espinosa, F. (2004). Riqueza y distribucion de las orquideaceae en la provincia de Pamplona. Bistua, 2(1), 106-112.

[7] Mweetwa, A., Welbaum, G., y Tay, D. (2008). Effects of development, temperature, and calcium hypochlorite treatment on in vitro germinability of Phalaenopsis seeds. Scientia Horticulturae, 117, 257-262.

[8] Jacquemyn, H., Honnay, O., y Pailler, T. (2007). Range size variation, nestedness and species turnover of orchid species along an altitudinal gradient on Reunion Island: implications for conservation. Biological Conservation, 136, 388-397.

[9] Basker, S., y Bai, N. (2010). In vitro propagation of an epiphytic and rare orchid Eria bambusifolia Lindl. Research in Biotechnology, 1, 15-20.

[10] Huang, H. (2011). Plant diversity and conservation in China: planning a strategic bioresource for a sustainable future. Botanical Journal of the Linnean Society, 166, 282-300.

[11] Perez, O., Sanchez, E., y Ortiz, P. (2009). Inventario orquideologico de la Reserva Bosque de Yotoco, Valle del Cauca. Acta Agronomica, 58(3), 189-196.

[12] Calderon, E. (2007). Libro Rojo de plantas de Colombia. Vol. 6. Bogota D. C., Colombia: Instituto Alexander von Humboldt--Ministerio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial.

[13] Arditti, J., y Ernst, R. (1993). Micropropagation of Orchids. New York, USA: John Wiley & Sons.

[14] Rasmussen, H. (1995). Terrestrial orchids, from seed to mycotrophic plant. Cambridge University Press, 55.

[15] Chen, W-H., y Chen, H-H. (2007). Orchid Biotechnology. Editorial: World Scientific.

[16] Murdad, R., Latip, M., Aziz, Z., y Ripin, R. (2010). Effects of carbon source and potato homogenate on in vitro growth and development of Sabah's Endangered orchid: Phalaenopsis gigantean. Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology, 18(1), 199-202.

[17] Orta, S., Lopez, J., Chile, T., Perez, I., y Blanco, P. (2011). Conservacion de las orquideas cubanas con enfoque desde la ciencia, la tecnologia y la sociedad. Revista Iberoamericana CTS, 1(1), 1-18.

[18] Prieto, J., Prieto, F., Hernandez, N., Cervantes, J., Dominguez, M., y Alma D. (2011). Metodos comparativos del poder germinativo en Hordeum distichon L. calidad maltera. Multiciencias, 11 (2), 121-128.

[19] Lallana, V., y Garcia, L. (2013). Efecto de pretratamientos en la prueba de viabilidad de semillas de Trichocentrum jonesianum (Orchidaceae). Investigacion Agraria, 15(2), 129-132.

[20] Cerna, M., Cardenas, S., Cruz, A., y Jacome, I. (2014). Coleccion de germoplasma de especies de la familia Orchidaceae Del Canton Santiago De Mendez--Morona Santiago, Ecuador. La granja. Revista de ciencias de la vida, 20(2), 5-19. doi: 10.17163.lgr.n20.2014.01.

[21] Benito, M., Sierra, H., Jimenez, I., y Penuelas, J. (2004). Aplicacion de metodos colorimetricos para la determinacion de la viabilidad en semillas de "Pinus Pinae": test de tetrazolio e indigo carmin. Cuadernos de la Sociedad Espanola de Ciencias Forestales,, 17, 23-28.

[22] Marrero, P, David, P., Valdes, F., y Nogales, M. (2007). Comparison of three chemical tests to assess seed viability: the seed dispersal system of the Macaronesian endemic plant Rubia fruticosa (Rubiaceae) as an example. Chemoecology, 17, 47-50.

[23] Jyoti, C. y Malik, C.P. (2013). Seed deterioration: A review. International Journal of Life Sciences Biotechnology and Pharma Research, 2(3), 373-385.

[24] Vujanovic, V., Arnaud, M., Barabe, D., y Thibeault, G. (2000). Viability testing of orchid seed and the promotion of colouration and germination. Annals of Botany, 86, 79-86.

[25] Ossenbach, C., Arce, J., y Warner, J. (2007). Almacenamiento de semillas de diferentes especies de orquideas para su conservacion en un banco de germoplasma: Deshidratacion, almacenamiento y pruebas de viabilidad de las semillas. Tierra Tropical, 5(1), 47-59.

[26] Munoz, M., y Jimenez, V. (2008). Capsule development, in vitro germination and plantlet acclimatization in Phragmipedium humboldtii, P. longifolium and P. pearcei. Lankesteriana, 8(2), 23-31.

[27] Billard, C., Dalzotto, C., y Lallana, V. (2014). Desinfeccion y siembra asimbiotica de semillas de dos especies y una variedad de orquideas del genero Oncidium. Polibotanica, 38, 145-157.

[28] International Seed Testing Association. (1985). International rules for seed testing. Seed Science and Technology, 300-520.

[29] Lauzer, D., Renaut, S., Arnaud., y Barabe, D. (2007). In vitro Asymbiotic Germination, Protocorm Development, and Plantlet Acclimatization of Aplectrum hyemale (Muhl. Ex Willd.) Torr. (Orchidaceae). The Journal of the Torrey Botanical Society, 134(3), 344-348.

[30] Canuto, R. (2012). Dehydrogenases. In Tech Design Team. Croatia. ISBN 978-953-307-019-3. 2012. p 366.

[31] Soares, J., Chaim, Y., Bento, M., Sorgato, J., y Soares, C. (2014). Identificacao da viabilidade de sementes de orquideas pelo teste de tetrazolio. Semina: Ciencias Agrarias, 35(5), 2275-2284.

[32] Kitsaki, C., Zygouraki, S., Ziobora, M., y Chintziest, S. (2004). In vitro germination, protocorm formation and plantlet development of mature versus immature seeds from several Ophrys species (Orchidaceae). Plant Cell Reports, 23(5), 284-290.

[33] Dutra, D., Johnson, T., Kauth P., Stewart, S., y Kane, M. (2008). Asymbiotic seed germination, in vitro seedling development, and greenhouse acclimatization of the threatened terrestrial orchid Bletia purpurea. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 94, 11-21.

[34] Vogel, I., y Macedo, A. (2011). Influence of IAA, TDZ, and light quality on asymbiotic germination, protocorm formation, and plantlet development of Cyrtopodium glutiniferum Raddi., a medicinal orchid. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 104, 147-155.

[35] Salazar-Mercado, S. A., y Cancino, G. (2012). Evaluacion del efecto de dos suplementos organicos en la germinacion in vitro de orquideas nativas de la provincia de Pamplona, Colombia. Revista Colombiana de Biotecnologia, 14(1), 53-59.

[36] Castilho, C., Damasceno, R., y Machado, N. (2012). Imagens digitalizadas na interpretas.ao do teste de tetrazolio em sementes de Brachiaria brizantha. Revista Brasileira de Sementes, 34(2), 334-341.

[37] Tukey, J. (1994). The problem of multiple comparisons. En: H. L. Braun (Ed.). The collected works of John W. Tukey (pp. 300). Nueva York, USA: Chapman and Hall.

[38] Salazar-Mercado, S.A. (2012). Germinacion asimbiotica de semillas y desarrollo in vitro de plantulas de Cattleya mendelii Dombrain (Orchidaceae). Acta Agronomica, 61(1), 69-78.

[39] Salazar-Mercado, S. A., Zulay, A., y Barrientos, F. (2013). Evaluation of different in vitro culture media in the development of Phalaenopsis hybrid (Orchidaceae). Revista Colombiana de Biotecnologia, 15(2), 97-105. doi: http://dx.doi.org/10.15446/rev. colomb.biote.v15n2.41268.

[40] Thompson, D., Trevor, J., y Van, J. (2006). Evaluating asymbiotic seed culture methods and establishing Disa (Orchidaceae) germinability in vitro: relationships, requirements and first-time reports. Plant Growth Regulation, 49(2), 269-284.

[41] Mora, F., Leticia, M., Scapim, C., Nunes E., y Pires, M. (2008). Generalized lineal models for the analysis of binary data from propagation experiments of Brazilian orchids. Brazilian Archives of Biology and Technology, 51(5), 963-970. doi: http:// dx.doi.org/10.1590/S1516-89132008000500013

Direccion de los autores

Seir Antonio Salazar Mercado

Facultad de Ciencias Agrarias y del Medio Ambiente, Universidad Francisco de Paula

Santander, San Jose de Cucuta--Colombia

salazar663@hotmail.com.

Javier Dario Gelvez Manrique

Facultad de Educacion, Universidad Simon Bolivar, San Jose de Cucuta--Colombia

jdgelvezm@gmail.com
Tabla 1. Coordenadas geograficas de las especies de orquideas
encontradas en la vereda el Escorial en Norte de Santander,
Colombia.

Especies                                 Coordenadas

Elleanthus aurantiacus    N 07[grados]20'55.6"-W 072[grados]38'29.5"
  (Lindl.) Rchb.f. 1863
Epidendrum sp.            N 07[grados]20'60.5"-W 072[grados]38'35.5"
Maxillaria sp.            N 07[grados]21'296"-W 072[grados]30'21"
Odontoglossum lindenii    N 07[grados]21'26.8"-W 072[grados]38'25.4"
  Lindl
Prosthechea sp.           N 07[grados]21'298"-W 072[grados]30'25"
Telipogon dubius          N 07[grados]21'2O.6"-W 072[grados]38'31.2"
  Rchb.f
Stelis sp.                N 07[grados]20'52.3"-W 072[grados]38'26.7"
Elleanthus sp.            N 07[grados]20'65.5"-W 072[grados]38'40.5"
Epidendrum elongatum      N 07[grados]20'65.6"-W 072[grados]38'30.5"
  Jacq
Cyrtochilum sp.           N 07[grados]20'50.8"-W 072[grados]38'26.7"

Tabla 2. Porcentaje de la Viabilidad de semillas de
orquideas utilizando la prueba de Tretrazolio e
Indigo Carmin

Especies de orquideas    Tetrazolio   Indigo Carmin

Elleanthus sp              69,2a.        97,6ab
Elleanthus arauntiacum     73,2a          99,6b
Stelis sp.                74,6a;b         95,4a
Epidendrum sp             85,4;b;c        99,6b
Telipogon dubios           86;b;c        97,6ab
Prosthechea sp             89,4;c        99,8 b
Epidendrum e/ongatum       89,6;c        98,6a b
Odontoglossum lindenii     91,0;c        99,8 b
Cyrtochilum sp             93,4;c        99,8 b
Maxillaria sp              93,8;c        99,0 b
                         Coeficiente de Correlacion
                         [R.sup.2] = 0,419

Las medias con diferente letra de cada columna,
muestran diferencias significativas, de acuerdo con
laprueba de Tukey HSD (P [menor que o igual a] 0,05).
COPYRIGHT 2015 Universidad del Valle
No portion of this article can be reproduced without the express written permission from the copyright holder.
Copyright 2015 Gale, Cengage Learning. All rights reserved.

Article Details
Printer friendly Cite/link Email Feedback
Author:Salazar Mercado, Seir Antonio; Gelvez Manrique, Javier Dario
Publication:Revista de Ciencias
Date:Dec 1, 2015
Words:3561
Previous Article:Uso de acolchados (mulching) en la restauracion de bosques secos en el Valle del Cauca.
Next Article:Caracterizacion morfologica y molecular de Phytophthora en aji (Capsicum frutescens var. Tabasco), Valle del Cauca.
Topics:

Terms of use | Privacy policy | Copyright © 2019 Farlex, Inc. | Feedback | For webmasters