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Determinacion de la Concentracion Optima de Tres Crioprotectores para la Criopreservacion de Espermatozoides Epididimarios de Alpaca.

DETERMINATION OF THE OPTIMUM CONCENTRATION OF THREE CRYOPROTECTANTS FOR THE CRIOPRESERVATION OF ALPACA EPIDIDYMAL SPERMATOZOA

INTRODUCCION

Los estudios sobre conservacion de semen fresco, refrigerado y congelado de camelidos sudamericanos (CSA), para su empleo en inseminacion artificial, no ha obtenido el exito esperado como en otras especies domesticas. Esto podria deberse a las caracteristicas particulares que presenta el semen de los CSA, principalmente la alta viscosidad, bajo porcentaje de motilidad y baja concentracion espermatica (Bravo et al., 1997). Estas caracteristicas espermaticas han condicionado la evaluacion, manipulacion, dilucion y conservacion del semen en esta especie (Tibary y Memon, 1999).

Los espermatozoides epididimarios constituyen un modelo experimental para el desarrollo de los trabajos de conservacion de semen, ya que se encuentran en un nivel de maduracion final y no estan mezclados con el plasma seminal viscoso (Canorio, 2008).

Se dispone de diversos trabajos de investigacion sobre criopreservacion de espermatozoides epididimarios, pero los resultados pos-descongelamiento, como la motilidad, son muy variables y, por lo general, deficientes, obteniendose valores que varian entre 0 y 34% (Morton et al., 2007, 2010; Canorio, 2008; Banda et al., 2010; Terreros et al., 2012) a partir de motilidades iniciales de 30-70%. La escasa supervivencia de los espermatozoides de CSA al proceso de criopreservacion podria deberse a la susceptibilidad inherente de la especie, los componentes de los dilutores y la produccion de especies reactivas de oxigeno (ROS), los cuales han sido identificados en otras especies (Medeiros et al, 2002).

Asimismo, existe una gran limitacion en lo concerniente al desarrollo de protocolos adecuados para la conservacion de espermatozoides de CSA (dilutores, temperatura de equilibrio, velocidad de congelacion y descongelacion, entre otros). Los crioprotectores son componentes importantes de los dilutores, pues permiten mantener una mayor proporcion de agua liquida a bajas temperaturas y, en consecuencia, una menor concentracion de electrolitos, posibilitando la supervivencia celular durante el proceso de criopreservacion (Stornelli et al., 2005).

El crioprotector mas utilizado en espermatozoides y semen de alpacas es el glicerol; el cual ha sido empleado en concentraciones de 2-7% (0.27-0.96 M) (Santiani et al., 2005; Banda et al., 2010; Morton et al., 2010). Asimismo, se ha utilizado el etilenglicol en concentraciones de 1-7% (0.21.25 M) (Santiani et al., 2005; Banda et al., 2010; Terreros et al., 2012) y dimetil sulfoxido (DMSO) en concentraciones de 0.9-7% (0.125-0.98 M) (Canorio, 2008; Terreros et al., 2012). Sin embargo, no se ha establecido el agente crioprotector y la concentracion que ofrece mejores resultados posdescongelamiento del semen criopreservado. Por ello, el objetivo del presente estudio fue evaluar tres agentes crioprotectores (glicerol, etilenglicol y DMSO) y determinar las concentraciones optimas para la adecuada motilidad espermatica, la integridad funcional de la membrana plasmatica y la viabilidad e integridad de la membrana acrosomal de los espermatozoides de alpaca.

MATERIALES Y METODOS

Lugar y Muestra de Estudio

El estudio se realizo en el Laboratorio de Reproduccion Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Lima, Peru). Se utilizaron 27 epididimos obtenidos del Camal Municipal de Huancavelica. Los epididimos para los tres primeros experimentos fueron colectados entre marzo y julio de 2012, y los del experimento 4 entre marzo y julio de 2014.

Los epididimos provenian de alpacas machos adultos, con mas de 3 anos de edad. Las dimensiones testiculares fueron de 3.5-4 cm de largo y 2-2.5 cm de ancho. Solo se utilizaron aquellos con una concentracion mayor a 70 x [10.sup.6] espermatozoides por mililitro y motilidad mayor o igual al 60%. La muestra de estudio estuvo constituida por 168 muestras procedentes de 27 epididimos.

Recuperacion de Espermatozoides Epididimarios

La coleccion de los testiculos/epididimos se realizo inmediatamente despues del sacrificio del animal. Los testiculos fueron liberados de la tunica albuginea y se colocaron en un recipiente con ClNa 0.9% a 5[grados]C. El tiempo transcurrido entre la coleccion y su llegada al laboratorio fue de 20 horas.

La separacion del testiculo de la cola del epididimo se hizo en el laboratorio. Los epididimos fueron lavados con ClNa 0.9%. La recuperacion de los espermatozoides epididimarios se realizo en una placa Petri a traves de cortes seriados con un bisturi en la superficie de la cola epididimaria (Banda et al., 2010). Durante este proceso, se agrego 1.5 ml del dilutor leche descremada--yema de huevo--fructosa (Santiani et al., 2005) a 37[grados]C sobre la cola epididimaria para facilitar la salida de los espermatozoides.

El liquido de la placa Petri fue colocado en una estufa a 37[grados]C por 5 min. Luego, se tomo 0.5 ml para evaluar las caracteristicas espermaticas iniciales y 1.0 ml se mezclo con 3 ml del dilutor. Los 4 ml resultantes se distribuyeron equitativamente en 8 alicuotas de 0.5 ml para cada tratamiento del experimento 1. Para el experimento 2 se siguio el mismo procedimiento, con la diferencia de que la dilucion final con el dilutor fue distribuida equitativamente en cuatro tratamientos de 1 ml.

Diseno Experimental

El objetivo del experimento 1 fue determinar la concentracion optima del glicerol, etilenglicol y DMSO.

Por ello, se trabajo con 120 muestras procedentes de quince epididimos. Esto significa que los espermatozoides epididimarios recuperados de un epididimo se dividieron en 8 tratamientos de 0.5 ml. Los tratamientos con base a los tres crioprotectores fueron: T1 (0 M), T2 (0.25 M), T3 (0.50 M), T4 (0.75 M), T5 (1.00 M), T6 (1.25 M), T7 (1.50 M) y T8 (1.75 M).

El objetivo del experimento 2 fue evaluar las concentraciones optimas resultantes del experimento 1. Se trabajo con 48 muestras procedentes de 12 epididimos. Es decir, los espermatozoides epididimarios recuperados de un epididimo se dividieron en 4 tratamientos de 1 ml. Los tratamientos con base a los tres crioprotectores fueron: T1: sin crioprotector; T2: concentracion optima de glicerol, T3: concentracion optima de etilenglicol; T4 concentracion optima de DMSO.

Criopreservacion y Descongelacion

El proceso de criopreservacion consistio en la curva de enfriamiento y congelacion. Para la curva de enfriamiento, las alicuotas de semen diluido de cada tratamiento fueron colocadas en tubos de vidrio dentro de un recipiente con agua a 35 [grados]C, e introducido en una refrigeradora para bajar la temperatura hasta 5 [grados]C en un tiempo aproximado de 150 minutos (tasa de enfriamiento: 1[grados]C/5 min). Luego se agrego el crioprotector respectivo (glicerol, etilenglicol o DMSO) y se dejo reposar por 30 min, antes del llenado de pajillas de 0.25 ml. Se obtuvieron 2 pajillas por cada tratamiento en el experimento 1 (n= 240 pajillas) y en el experimento 2 se obtuvieron 4 pajillas por tratamiento (n= 192 pajilllas).

Para la congelacion, las pajillas fueron expuestas a vapores de nitrogeno en una caj a de poliestireno expandido (tecnopor) por 20 min, para luego sumergirlas directamente al nitrogeno liquido. Las pajillas fueron almacenadas en el tanque de nitrogeno por siete dias. La descongelacion se realizo sumergiendo cada pajilla en bano maria a 37[grados]C por 1 min.

Evaluacion de los Espermatozoides

Se evaluo la totalidad de las pajillas. Para la evaluacion de los espermatozoidesepididimarios del experimento 1 se determino la motilidad (Ax et al., 2000), mientras que en el experimento 2, se evaluaron, ademas, la integridad funcional de membrana espermatica mediante la prueba hipoosmotica (Jeyendran et al., 1984) y la viabilidad e integridad acrosomal mediante la tecnica de doble tincion azul tripan / giemsa (Didion et al., 1989).

En el caso de la prueba hipoosmotica, se considero como Host+ a espermatozoides con cola enrrollada y como Host- a espermatozoides con cola sin cambios (Jeyendran et al., 1984). En el caso de la viabilidad e integridad acrosomal, se consideron cuatro categorias: VA: espermatozoide vivo con acrosoma intacto; VS: espermatozoide vivo con acrosoma desprendido; MA: espermatozoide muerto con acrosoma intacto; MS: espermatozoide muerto con acrosoma desprendido (Didion et al., 1989).

Analisis Estadistico

Los datos de las variables motilidad, integridad de la membrana plasmatica y viablilidad e integridad acrosomal fueron transformados (arcoseno) para aproximar los valores a la distribucion normal. En el experimento 1 se empleo el analisis de regresion polinomial quintuple para determinar la concentracion optima del glicerol, etilenglicol y DMSO, respectivamente. En el experimento 2 se utilizo un analisis de varianza para evaluar el efecto del crioprotector sobre la motilidad, integridad de membrana plasmatica y viabilidad e integridad acrosomal posdescongelamiento; ademas se realizo la prueba de Tukey para determinar cual de las concentraciones optimas de los tres crioprotectores era la mejor. En todos los casos se empleo el paquete estadistico IBM SPSS Statistics 22.0 para Windows.

RESULTADOS

Los resultados obtenidos de motilidad inicial y motilidad pos-descongelamiento con el glicerol, etilenglicol y DMSO para el experimento 1 se encuentran en el Cuadro 1.

La Figura 1 muestra que las motilidades tienden a aumentar conforme se aumenta la concentracion de glicerol hasta el valor de 1 M, para luego disminuir con concentraciones mayores. El analisis de regresion muestra que la pendiente es igual a cero (R=0.915) en la concentracion de 1.16 M, por lo que esa seria la concentracion optima.

El etilenglicol presenta un comportamiento similar (Figura 2), donde la pendiente es igual a cero (R=0.740) en una concentracion de 1.02 M, por lo que esa seria la concentracion optima. Asimismo, en el caso de DMSO, la motilidad aumenta hasta la concentracion de 0.75 M y comienzan a declinar con concentraciones mayores a 0.9 M (Figura 3); por otro lado, la pendiente es igual a cero (R=0.730) en una concentracion de 0.9 M, por lo que esa seria la concentracion optima.

En el experimento 2, los mejores promeio pos-descongelamiento se observaron en 4 y T2 (Cuadro 2), sin deferencias signifiitivas entre estos criopreservantes, aunque con promedios ligeramente superiores en T4.

DISCUSION

El tipo y la concentracion del crioprotector influencia el proceso de criopreservacion de los espermatozoides (Watson, 1990). En alpacas, el glicerol ha sido empleado en concentraciones de 7% (0.96 M) (Santiani et al., 2005; Terreros et al., 2012), 6% (0.82 M) (Banda et al, 2010) y 2-4% (0.27-0.55 M) (Morton et al, 2007, 2010), obteniendo motilidades pos-descongelamiento entre 6 y 24%, posiblemente por los efectos efectos toxicos del glicerol (Garner et al., 1999). El etilenglicol se ha empleado al 1% (0.2 M) (Banda et al, 2010) y 7% (1.25 M) (Santiani et al., 2005; Terreros et al., 2012) con motilidades pos-descongelacion entre 1 y 20%. En estos estudios, Terreros et al. (2012) obtuvieron resultados inferiores que Santiani et al. (2005), posiblemente debido al tipo de muestra (espermatozoides epididimarios y semen eyaculado). Con el uso de DMSO al 0.9% (0.125 M), 1.8% (0.25 M) (Canorio, 2008) y 7% (0.98 M) se logro hasta 33% de motilidad pos-desconge-lamiento (Terreros et al., 2012).

En los estudios antes mencionados no se pudo identificar el tipo y concentracion ideal del crioprotector que permita obtener mejores tasas de motilidad pos-descongelamiento, lo que es de suma importancia, puesto que los crioprotectores son altamente especie especificos y su efectividad varia en funcion de la concentracion utilizada (Gao et al., 1995). Al respecto, en el presente estudio se determino que las concentraciones aparentemente optimas del glicerol, etilenglicol y DMSO fueron de 1.16, 1.02 y 0.9 M, respectivamente, obteniendose mayores tasas de motilidad para el glicerol (30.8%) y DMSO (35.8%), pero menores para el etilenglicol (17.4%).

Los resultados del experimento 2 indicaron que el glicerol y DMSO presentaron mayores porcentajes de motilidad, integridad funcional de membrana plasmatica y viabilidad e integridad acrosomal respecto al etilenglicol (p<0.05). Posiblemente, esto podria deberse al tiempo de exposicion de los crioprotectores con los espermatozoides, dado que el etilenglicol, por su facil penetracion celular y congelacion rapida puede ejercer efectos toxicos mayores sobre la celula que los otros crioprotectores.

La motilidad es considerada como la principal caracteristica al evaluar las tecnicas de congelacion, diluyentes y crioprotectores. Sin embargo, en la alpaca existe una gran variabilidad en los valores posdescongelamiento, tanto en el semen como en los espermatozoides epididimarios (Valdivia et al, 1999; Santiani et al, 2005; Morton et al, 2010; Banda et al, 2010; Terreros et al., 2012), lo que podria deberse a la motilidad inicial de las muestras; ya que al utilizar muestras con motilidades iniciales mayores a 60% se logran mejores porcentajes de motilidad despues del descongelamiento (Choez et al, 2013).

La motilidad inicial en este estudio fue mayor de 60%, obteniendo 31% de motilidad pos-descongelamiento para el glicerol; superior al 15% de Santiani et al. (2005), al 7-20% de Morton et al. (2007, 2010) y al 24% de Terreros et al. (2012), a pesar de haber utilizado un dilutor en base a leche descremada o lactosa. No obstante, fue similar al 32% obtenido por Ordonez y Verastegui (2007), quienes utilizaron el dilutor Tris con glicerol al 8%. Por otro lado, el 36% de motilidad obtenido con el DMSO fue similar a los reportes de Canorio (2008) y Terreros et al. (2012), aunque el primero utilizo un dilutor a base de citrato y en ambos casos se utilizon una menor concentracion (0.25 M), lo que indica que se pueden utilizar concentraciones mas bajas de DMSO, si se utiliza citrato como dilutor.

El 17% de motilidad obtenida con etilenglicol fue similar a los resultados reportados por Banda et al. (2010), pero mayores al 8% alcanzado por Terreros et al. (2012) y 4% por Ordonez y Verastegui (2007), quienes utilizaron concentraciones mas altas de etilenglicol, lo que al parecer resultaron ser mas toxicas para el espermatozoide de alpaca.

Los porcentajes de integridad funcional de membrana plasmatica del presente estudio de 45, 32 y 52% para glicerol, etilenglicol y DMSO, respectivamente, fueron superiores a los valores de 24 y 17% reportados por Banda et al. (2010) utilizando glicerol y etilenglicol, respectivamente; asimismo, Terreros et al. (2012) reportaron porcentajes de 26, 18 y 29% utilizando los tres crioprotectores del estudio, lo cual podria ocurrir debido a la tecnica de congelacion empleada de dos pasos, donde existe un mayor tiempo de exposicion de los crioprotectores y, por consiguiente, un mayor efecto sobre la membrana de los espermatozoides.

El 34, 21 y 38% de viabilidad e integridad acrosomal pos-descongelamiento para el glicerol, etilenglicol y DMSO, respectivamente, pueden considerarse como aceptables, en comparacion con el estudio de Santiani et al. (2005), quienes obtuvieron tasas de 13 y 19% para el glicerol y etilenglicol. No obtante, Banda et al. (2010), usando glicerol y etilenglicol reportan valores de 33 y 27%, respectivamente, y Morton et al. (2007, 2010) reportan valores hasta de 90% con glicerol.

Si bien, los resultados fueron alentadores; posiblemente el tiempo de transporte de los epididimos hasta su procesamiento en el laboratorio, la velocidad de enfriamiento y el metodo de congelacion empleado afectaron negativamente los resultados.

CONCLUSIONES

* Las concentraciones de 0.9 M de DMSO y 1.16 M de glicerol fueron mas efectivas para conservar la motilidad, integridad funcional de la membrana plasmatica y viabilidad e integridad de la membrana acrosomal de expermatozoides epididimarios de la alpaca por efecto de la criopreservacion.

* El etilenglicol presento una menor efectividad que el DMSO y el glicerol.

http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v28i3.13367

Agradecimientos

Los autores agradecen a Ricardo Castillo, Diego Evangelista, Javier Juarez y Gianfranco Arroyo por el apoyo prestado en el desarrollo del presente trabajo.

LITERATURA CITADA

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Katherine Choez A. (1,4), Luis Ruiz G. (1), Rocio Sandoval M. (1), Shirley Evangelista V. (3), Alexei Santiani A. (2)

(1) Clinica de Animales Mayores, (2) Laboratorio de Reproduccion Animal, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Peru

(3) Laboratorio de Biotecnologias Reproductivas y Celulares, Facultad de Ciencias Veterinarias y Biologicas, Universidad Cientifica del Sur, Lima, Peru

(4) E-mail: kathyvet3@hotmail.com

Recibido: 27 de noviembre de 2016

Aceptado para publicacion: 18 de marzo de 2017

Leyenda: Figura 1. Diagrama de regresion polinomial quintuple de la motilidad de espermatozoides epididimarios pos-descongelamiento con ocho concentraciones de glicerol

Leyenda: Figura 2. Diagrama de regresion polinomial quintuple de la motilidad de espermatozoides epididimarios pos-descongelamiento con ocho concentraciones de etilenglicol

Leyenda: Figura 3. Diagrama de regresion polinomial quintuple de la motilidad de espermatozoides epididimarios pos-descongelamiento con ocho concentraciones de dimetil sulfoxido (DMSO)
Cuadro 1. Motilidad inicial y pos-descongelamiento (promedio [+ o -]
d.e.) con ocho concentraciones de glicerol, etilenglicol y DMSO en
espermatozoides epididimarios de alpaca

Motilidad                   Glicerol          Etilenglicol

Inicial                 66.0 [+ o -] 8.9    64.0 [+ o -] 7.8
Pos-descongelamiento
  T1 (0 M)              10.0 [+ o -] 0       5.4 [+ o -] 3.2
  T2 (0.25 M)           22.0 [+ o -] 13.1    8.4 [+ o -] 5.7
  T3 (0.50 M)           23.0 [+ o -] 14.0    9.0 [+ o -] 3.6
  T4 (0.75 M)           26.0 [+ o -] 15.2   11.0 [+ o -] 4.8
  T5 (1.00 M)           34.0 [+ o -] 15.2   12.0 [+ o -] 3.9
  T6 (1.25 M)           36.0 [+ o -] 15.2   11.0 [+ o -] 3.6
  T7 (1.50 M)           26.0 [+ o -] 13.9    9.4 [+ o -] 3.3
  T8 (1.75 M)           22.0 [+ o -] 13.0    8.0 [+ o -] 2.4

Motilidad                    DMSO

Inicial                70.0 [+ o -] 7.1
Pos-descongelamiento
  T1 (0 M)              8.0 [+ o -] 5.0
  T2 (0.25 M)          12.3 [+ o -] 4.1
  T3 (0.50 M)          14.5 [+ o -] 4.2
  T4 (0.75 M)          22.5 [+ o -] 7.9
  T5 (1.00 M)          24.1 [+ o -] 7.3
  T6 (1.25 M)          15.0 [+ o -] 5.6
  T7 (1.50 M)          14.0 [+ o -] 3.6
  T8 (1.75 M)          12.8 [+ o -] 5.2

Los valores son promedios [+ o -] limite de confianza al 95%

Cuadro 2. Efecto de la concentracion optima del glicerol,
etilenglicol y DMSO sobre las caracteristicas espermaticas (promedio
[+ o -] d.e.) al inicio y despues de la criopreservacion de
espermatozoides epididimarios de alpaca (n=192 pajillas)

Motilidad                        Motilidad
                              espermatica (%)

Inicial                    67.5 [+ o -] 7.5
Pos-descongelamiento
  T1 (Sin crioprotector)    7.3 [+ o -] 5.4 (c)
  T2 (1.16 M Gl)           30.8 [+ o -] 9.7 (a)
  T3 (1.02 M EG)           17.4 [+ o -] 12.2 (b)
  T4 (0.9 M DMSO)          35.8 [+ o -] 9.3 (a)

Motilidad                       Integridad
                                 funcional
                              de membrana (%)

Inicial                    81.8 [+ o -] 9.4
Pos-descongelamiento
  T1 (Sin crioprotector)   15.3 [+ o -] 7.4 (c)
  T2 (1.16 M Gl)           45.0 [+ o -] 13.0 (a)
  T3 (1.02 M EG)           32.2 [+ o -] 14.1 (b)
  T4 (0.9 M DMSO)          51.8 [+ o -] 11.9 (a)

Motilidad                      Viabilidad e
                                integridad
                               acrosomal (%)

Inicial                    75.8 [+ o -] 8.9
Pos-descongelamiento
  T1 (Sin crioprotector)    9.9 [+ o -] 5.0 (c)
  T2 (1.16 M Gl)           33.8 [+ o -] 10.0 (a)
  T3 (1.02 M EG)           21.0 [+ o -] 7.5 (b)
  T4 (0.9 M DMSO)          38.3 [+ o -] 6.8 (a)

(a,b,c) Letras diferentes dentro de una columna indican diferencia
significativa (p<0.05)
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Author:Choez A., Katherine; Ruiz G., Luis; Sandoval M., Rocio; Evangelista V., Shirley; Santiani A., Alexei
Publication:Revista de Investigaciones Veterinarias del Peru (RIVEP)
Date:Jul 1, 2017
Words:3989
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