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Detection of Rhizoctonia solani in potato tissues using polyclonal antibodies/Deteccion de Rhizoctonia solani en tejidos de papa mediante anticuerpos policlonales/Deteccao de Rhizoctonia solani em tecidos de batata mediante anticorpos policlonais.

SUMMARY

Potato is a relatively important crop for the economic and social development in the Andean region of Venezuela. Rhizoctonia solani AG-3 is a plant pathogen that affects yield by causing considerable damage on tubers, stolons and stems in the crop. The development of specific, simple and sensitive detection methods is crucial for a timely response when making decisions about disease control. The objective of this study was to produce polyclonal antibodies against proteins anchored to the plasma membrane, so as to detect the presence of R. solani in potato tubers. The results demonstrate the potential for immunodetection with polyclonal antibodies to identify diseased material.

RESUMO

A batata e um item agricola de relativa importancia economica e social na area andina venezuelana. Rhizoctonia solani AG-3 e um fitopatogeno que afeta os rendimentos ao causar lesoes consideraveis em tuberculos, estoloes e hastes no cultivo. O desenvolvimento de metodos de deteccao especificos, simples e sensiveis e determinante para dar uma resposta oportuna no momento da tomada de decisoes sobre o controle das enfermi dades. O objetivo deste trabalho foi a obtencao de antigenos e o desenvolvimento de anticorpos policlonais a partir de proteinas ancoradas na membrana plasmatica, que permitam detectar a presenca de R. solani em tuberculos de batata. Os resultados obtidos demonstram o potencial da imunodeteccao com anticorpos policlonais na identificacao de material enfermo e seu possivel uso no combate da enfermidade.

RESUMEN

La papa es un rubro agricola de relativa importancia economica y social en el area andina venezolana. Rhizoctonia solani AG-3 es un fitopatogeno que afecta los rendimientos al causar lesiones considerables en tuberculos, estolones y tallos en el cultivo. El desarrollo de metodos de deteccion especificos, sencillos y sensibles es determinante para dar una respuesta oportuna al momento de tomar decisiones sobre el control de las' enfermedades. El objetivo de este trabajo fue la obteneion de antigenos y el desarrollo de anticuerpos policlonales a partir de proteinas ancladas a la membrana plasmatica, que permitan detectar la presencia de R. solani en tuberculos de papa. Los resultados obtenidos demuestran el potencial de la inmunodeteccion con anticuerpos policlonales en la identificacion de material enfermo y su posible uso en el combate de la enfermedad.

Palabras clave / Antigenos / Dot Blot / Inmunodeteccion / Papa / Rhizoctonia solani AG-3 / Solanum tuberosum /

Recibido: 19/01/2010. Modificado: 13/12/2010. Aceptado: 17/12/2010.

Introduccion

Rhizoctonia solani Kuhn [Teleomorfo: Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk] es un fitopatogeno causante de diversas enfermedades en una gran variedad de cultivos. Ha sido objeto de multiples estudios ecologicos, patologicos, taxonomicos y de control biologico (Gonzalez-Hernandez, 2002). En Venezuela, los metodos de deteccion e identificacion son los utilizados tradicionalmente, que requiere de experiencia con el genero Rhizoctonia, para su ubicacion taxonomica dentro de los grupos de anastomosis ya definidos (Gonzalez et al., 2006). Estudios realizados en cultivos de papa (Solanun tuberosum L.) en la zona andina venezolana, reportan la presencia de los grupos de anastomosis de R. solani, AG-3 y AG-2-1, siendo AG-3 el mas importante por su alta frecuencia de aparicion en diferentes localidades (Cedeno et al., 2001). El cultivo de la papa es de gran importancia en la zona andina de Venezuela, tanto por la extension del area cultivada como por el numero de productores que se dedican a este rubro. R. solani AG-3 ha sido reportado como el grupo de anastomosis mas importante que afecta el cultivo de la papa en diferentes localidades del pais (estados Merida, Tachita y Trujillo). En Maine (EEUU) es la principal causa de rizoctoniosis dentro de cinco grupos de anastomosis diferentes (Bandy, 1988). De igual manera, Ceresini et al. (2002) reportaron la presencia de R. solani AG-3 en tuberculos de papa provenientes de Canada y EEUU (Maine, Minnesota, Nueva York, Dakota del Norte y Wisconsin).

La aplicacion de metodos de deteccion especificos, sencillos y sensibles es determinante para dar una respuesta oportuna al momento de tomar decisiones sobre el control de las enfermedades. Estudios de deteccion serologica de R. solani han sido conducidos para mejorar las posibilidades de exito y la velocidad de respuesta en las pruebas de diagnostico. Matthew y Brooker (1991) lograron anticuerpos policlonales y monoclonales para R. solani AG-8, contra proteinas secretadas al medio de cultivo. Posteriormente se desarrollo un metodo de deteccion y cuantificacion a traves de perlas de vidrio inmunomagneticas donde se fijo un anticuerpo monoclonal que enlazaba proteinas de R. solani presente en suelo (Thornton, 1996). Tambien se logro la cuantificacion de R. solani en suelo con anticuerpos monoclonales que reconocian la enzima catecoloxidasa secretada por el hongo (Otten et al., 1997). Finalmente Thornton et al. (2004) afinaron la tecnica y lograron desarrollar un metodo inmunocromatografico de flujo lateral que permite detectar y cuantificar a R. solani AG-4 en suelos. Sin embargo, los trabajos no permiten identificar de manera intraespecifica a los grupos de anastomosis de R. solani, y generalmente utilizan un pool completo de proteinas para el desarrollo de los anticuerpos. El objetivo del presente trabajo fue desarrollar un metodo serologico que permita detectar a R. solani causante de rizoctoniosis en papa en Venezuela, utilizando proteinas ancladas a la membrana para la produccion de los anticuerpos.

Materiales y Metodos

Aislamiento

Tuberculos enfermos con sintomas y signos de rizoctoniosis fueron colectados en las localidades de Mucuchies y El Valle, estado Merida, Venezuela. Los tuberculos fueron trasladados ai Laboratorio de Fitopatologia del Instituto de Investigaciones Agropecuarias de la Universidad de Los Andes (IIAPULA), donde se lavaron con agua corriente. Los esclerosios presentes sobre los tuberculos fueron desprendidos, desinfestados durante 3min con hipoclorito de sodio al 0,5%, lavados tres veces con agua destilada esteril (ADE) y sembrados en placas con medio aguaagar, agar acidificado a pH 4 con acido lactico, a 25[grodos]C. De las colonias emergentes se realizaron transferencias de apices hifales para la obtencion de cultivos puros.

Condicion nuclear

En los cultivos obtenidos con caracteristicas que correspondian al genero Rhizoctonia se procedio a realizar la cuantificacion nuclear en celulas somaticas distintas a la apical, siguiendo el procedimiento HCl-Giemsa de Rogers (1965).

Pruebas de anastomosis

En placas con medio agua-agar (2%) + PDA Difco (10%) se evaluo la habilidad de los aislamientos para realizar fusion hifal con cultivos-tipo (testers). Los testers suministrados por el Laboratorio de Fitopatologia del IIAP-ULA fueron adquiridos en la American Type Culture Collection, EEUU, y el Centraalbureau Voor Schimmencultures, Holanda. La afiliacion a los grupos de anastomosis se establecio en base a la frecuencia de fusion hifal (Sneh et al., 1991)

Preparacion del micelio

Cultivos puros de R. solani AG-3 provenientes de Mucuchies crecieron en total oscuridad y a 25[grados] durante 28 dias en erlenmeyers que contenian medio liquido con dextrosa 2% y pectina 1%. El micelio fue lavado con ADE para eliminar los restos de medio de cultivo, congelado con [N.sub.2] liquido y liofilizado para su posterior tratamiento.

Extraccion de antigenos

El micelio liofilizado (0,5g) se sometio a ruptura mecanica con perlas de vidrio en condiciones de congelacion y utilizando buffer de extraccion (150mM NaCl, 10mM Tris-HCl, y 2% Triton X-114; pH 7,4) en presencia de inhibidores de proteasas (Complete Roche[R]). El antigeno se obtuvo usando el metodo de particion con el detergente Triton X-114 descrito por Ko y Thompson (1995) y modificado por Afiez-Rojas et al. (2006), el cual permite separar diferentes biomoleculas unidas a la membrana celular de parasitos, que por su tamano y constitucion (proteinas y carbohidratos) son las de mayor importancia inmunogenica (Anez-Rojas et al., 2006; Costachel et al., 2005). El metodo permite obtener tres fracciones diferenciadas por su solubilidad en Triton X-114: proteinas hidrofilicas (F1), proteinas integrales de membrana (F2) y proteinas unidas a la membrana con anclaje del tipo glucosilfosfatidilinositol (F3). Despues del tratamiento de ruptura con el buffer de extraccion, las muestras fueron colocadas en agitacion y frio durante 1h, centrifugadas durante 20min a 8500rpm y el sobrenadante guardado a -20[grados] durante 24h. El material fue descongelado a temperatura ambiente, sometido a una primera particion a 32[grados] durante 12min, y centrifugado a 3000rpm. La fase acuosa (FI) fue separada de la fase de detergente y guardada a -20[grados]. La fase de detergente fue resuspendida en 3 volumenes de buffer Triton 0,06% (150mM NaCl, 10mM tris-HCl, 0,06% Triton X-114; pH 7,4) e incubada a 0[grados] durante 10min. Se realizo una segunda particion a 32[grados], la fase acuosa fue descartada, el lavado fue repetido dos veces. A la fase de detergente sele agregaron 3 volumenes de buffer Triton 0,06%, se incubo a 0[grados] durante 10min y se centrifugo a 10000rpm durante 20min a 0[grados], obteniendo un precipitado con la fraccion (F2). La fase acuosa fue colocada a 32[grados] para una ultima particion. En la fase de detergente, se obtuvo la fraccion compuesta por proteinas con anclaje tipo glucosilfosfatidilinositol (F3). Las proteinas de todas las fracciones fueron precipitadas individualmente agregando tres volumenes de acetona fria y resuspendidas en buffer muestra (250mM Tris-base, 2% SDS, 10% glicerol, 0,01% azul de bromofenol; pH 6,8]. Se determino la cantidad aproximada de proteinas contenidas en las fracciones utilizando el metodo de Lowry (Bollang y Edelstein, 1991).

Electroforesis en geles de poliacrilamida

Las fracciones de R. solani AG-3 de Mucuchies fueron sometidas a separacion electroforetica en geles de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio al 12% (SDSPAGE), y tefiidos con azul de Comassie[R] R-250 siguiendo el procedimiento de Laemmli (1970). En los hoyos se colocaron 25 [micron]g de proteinas de las fracciones para las comparaciones en geles coloreados, y 5 [micron]g para las transferencias a membrana. Se utilizaron marcadores de peso molecular sin tenir para las comparaciones en los geles y pretenidos para las transferencias a membranas.

Obtencion de anticuerpos

Para obtener anticuerpos se utilizo la fraccion F3 aislada de R.solani AG-3 proveniente de Mucuchies. Las inmunizaciones fueron remizadas en 5 conejos, con inyeccion subcutanea cada 15 dias con dosis secuenciales de 80, 50 y 80[micron]g de proteina. El extracto de antigenos fue mezclado con buffer fosfato salino pH 7,3 (PBS) y adyuvante incompleto Freund[R] 1:1 hasta completar 1m1 de suspension. El suero con los anticuerpos desarrollados fue extraido a los 15 dias despues de la ultima inmunizacion.

Western blot

Despues de realizar la electroforesis, las proteinas fueron transferidas a 110V durante 1h a una membrana de polyvinylidene fluoride (PVDF-Inmobilon P[R]). La membrana se bloqueo con 0,5% de leche descremada en Tris Buffer Salino (TBS) con 10mM Tris-HCl y 150mM NaCl; pH 8. Los anticuerpos fueron enlazados durante 1h en agitacion suave, usando una dilucion 1:100 en TBS. Luego de cuatro lavados con TBS, se agrego inmunoglobulina anticonejo/peroxidasa a razon de 1:7500 en TBS durante 30min. EL revelado se realizo con 4-cloro-1-naphthol y H202 (Zeder-Lutz et al., 2006). Se evaluaron proteinas de cuatro aislamientos de R. solani: AG-3 aislada a partir de material enfermo naturalmente, y los patrones AG-3 (Anderson P-42), AG-8 (ATCC-76106) y AG-2-1 (ATCC-44658), a los cuales previamente seles realizo la extraccion de proteinas segun el metodo descrito. Se evaluo la especificidad de los anticuerpos contra Fusarium oxysporum, Colletotricum gloeosporioides y Botrytis cinerea.

Deteccion en esquejes de papa

Fragmentos de tallos de 6cm de largo de plantas de papa (esquejes), fueron autoclavados a 121[grados] y 151bs/ [pulg.sup.2] durante 10min. Los esquejes se inocularon sin heridas con discos de 0,5cm de diametro de agar-agua con micelio de los hongos R. solani AG-3 de Mucuchies, AG-2-1 de El Valle y Fusarium oxvsporum. La inoculacion se hizo en placas de Petri y en condiciones de camara humeda (total oscuridad y a 25[grados]). Como testigo se utilizaron esquejes inoculados con discos de agar-agua. A las 72h se tomaron porciones de 1cm de esqueje invadido por el micelio del hongo y se trataron con buffer de extraccion (0,8% NaCl, 0,02KCl, 0,115[Na.sub.2]HP[O.sub.4], 0,02K[H.sub.2]P[O.sub.4], 0,05% Tween 20; pH 8,3 ajustado con NaOH 1M) en frio y con agitacion durante 1h. La suspension se centrifugo a 9000g durante 10min y el sobrenadante fue mezclado con 3 volumenes de acetona fria durante 2h. Posteriormente se centrifugo a 3500g durante 20min y las proteinas precipitadas fueron suspendidas en buffer muestra y sometidas a SDS-PAGE y Western Blot.

Deteccion en tuberculos de papa

Treinta y dos muestras de tuberculos con sintomas de rizoctoniosis y asintomaticos recolectadas en el paramo de Mucuchies y en el Valle del estado Merida fueron tratadas para la deteccion de R. solani. Se tomaron 0,5g del peridermo de las muestras, y se trataron durante 1h con buffer de extraccion, en frio y con agitacion (Thornton, 1999). La suspension se centrifugo a 9000g durante 15min, se trato con 3 volumenes de acetona fria durante 2h, se centrifugo a 3500g durante 20min; las proteinas precipitadas fueron suspendidas en buffer muestra y se sometieron a SDS-PAGE y Western blot.

Dot blot

Las muestras colectadas para las pruebas de deteccion de R. solani en tuberculos de papa fueron sometidas a pruebas inmunologicas utilizando un equipo Dot blot (Bio-Rad[R]). Para ello la membrana de Inmobilon P fue hidratada 5min con alcohol metilico y buffer de transferencia respectivamente (Zeder-Lutz, 2006), y las muestras (5 [micron]l) fueron colocadas mediante succion. Posteriormente se procedio al bloqueo de la membrana durante 1h con leche descremada ai 5% en PBS, durante 45min se enlazaron los anticuerpos diluidos a razon de 1:100 en PBS, y la membrana fue lavada 3 veces durante 5min con PBS. El anticuerpo secundario fue diluido a razon de 1:7500 en PBS, dejandolo reaccionar durante 30min y se lavo tres veces con PBS. Finalmente se revelo con 4-cloronaftol y [H.sub.2][O.sub.2] (Zeder-Lutz, 2006).

Resultados

Aislamiento

Se recolectaron 21 muestras de papa contaminada naturalmente. De los esclerocios presentes sobre los tuberculos se obtuvieron 67 cultivos puros con caracteristicas similares al genero Rhizoctonia, de los que 53 provenian de Mucuchies y 14 de El Valle. Entre las caracteristicas morfologicas destacables se observaron: hifas con pigmentacion marron, ramificacion cerca del septo distal, constriccion hifal y formacion de un septo a corta distancia del punto de ramificacion de la hifa, diametro de las hifas superior a 5[micron]m, presencia de septo doliporo y formacion de esclerocios en aislamientos con mas de dos semanas de edad.

Condicion nuclear

Las pruebas permitieron separar los cultivos en binucleados (Ceratobasidium) y multinucleados (R. solani). Solo dos aislamientos obtenidos de muestras provenientes de Mucuchies fueron binucleados, y el resto (65) presento varios nucleos por celula al ser tefiidos con la tecnica de Giemsa. Los aislamientos correspondientes a R. solani promediaron 9 nucleos (5-11) por celula somatica.

Pruebas de anastomosis

Las pruebas de anastomosis evidenciaron que de los 65 aislamientos de R. solani, 16 (24,62%) pertenecian al grupo de anastomosis AG-2-1 y 49 (75,38%) al AG-3. Dos de aislamientos (4%) de las muestras colectadas en la poblacion de Mucuchies fueron AG-2-1 y 51 (96%) AG-3. Todos los aislamientos obtenidos de muestras provenientes de El Valle fueron AG-2-1. El porcentaje promedio de fusion hifal para los aislados de AG-2-1 fue de 48% (27-67%) y para AG-3 de 55% (32-61%). Para las pruebas de extraccion y purificacion del antigeno fue utilizado el aislado de R. solani AG-3 de Mucuchies con mayor frecuencia de fusion hifal (62%).

[FIGURA 1 OMITIR]

Extraccion de los antigenos

La extraccion de 0,1g de micelio en peso seco (liofilizado) permitio obtener 12,8mg de proteinas. Despues del proceso de separacion se obtuvieron tres fracciones, identificadas como proteinas hidrofilicas (F1), con rendimiento aproximado de 6mg, proteinas integrales de membrana (F2) con 0,92mg y proteinas con anclaje a la membrana (F3) con 0,44mg.

Electroforesis en geles de poliacrilamida

En la Figura 1 se muestra el patron de corrida para las fracciones F1, F2 y F3 extraidas del mi-celio de R. solani AG-3 de Mucuchies. Para el caso de las F3 (carril 4), que representaban las proteinas de interes inmunologico en este trabajo, se observan bandas principalmente entre los 30 y 75kDa.

[FIGURA 2 OMITIR]

Al comparar en SDS-PAGE tenido con azul de Coomassie el patron de distribucion de las proteinas en las fracciones F1, F2 y F3 de los grupos de anastomosis R. solani AG-3 de Mucuchies, AG-2-1 El Valle y AG-8 (ATCC-76106), se aprecia que las proteinas presentes en la fraccion F3 para los diferentes grupos de anastomosis, se encontraron distribuidas entre los 30 y 75kDa (Figura 2).

Western blot

La pruebas de Western blot permitieron comprobar la es pecificidad de los anticuerpos para la deteccion de R. solani AG-3 de Mucuchies. AI enlazar los anticuerpos a las proteinas de la fraccion F3 de R. solani de AG-3 de Mucuchies y a las de las F3 de los patrones ATCC de R. solani: AG-3, AG-8 y AG-2-1 (Figura 3) se observo que los anticuerpos no fueron especificos para la deteccion del grupo AG-3. Las proteinas que mostraron mayor antigenicidad y que permitieron la deteccion para todos los grupos de anastomosis evaluados por Western blot, se observaron entre los 30 y 65kDa. El tiempo para la reaccion del revelado fue inmediato, lo que sugiere alta sensibilidad del metodo de deteccion.

En la Figura 4 se comprueba la especificidad en el reconocimiento de R. solani contra otros hongos. Los anticuerpos no reaccionaron con las extractos de proteinas de los hongos Fusarium oxisporum, Colletotrichum gloeosporioides y Botrytis cinerea (carriles 2, 3 y 5, respectivamente), mientras que se observa reaccion al ser enlazados con proteinas de R. solani AG-3 de Mucuchies

[FIGURA 3 OMITIR]

Deteccion en esquejes de papa

A los 3 dias desde la inoculacion los hongos habian invadido los esquejes casi en su totalidad, y presentaban consistencia flacida y acuosa. Despues de realizar el corte de las muestras y la extraccion de las proteinas, se observo mediante Western blot (Figura 5) que el metodo de extraccion y deteccion de los antigenos era posible sobre tejido fresco y que los esquejes sin inoculo (control negativo) y los infectados con F. oxysporum no mostraron ninguna reactividad. Por el contrario, las muestras inoculadas con micelio de R. solani AG-2-1 El Valle y R. solani AG-3 Mucuchies resultaron positivas.

Deteccion en tuberculos de papa

En la Figura 6 se muestran los resultados obtenidos con algunas de las muestras evaluadas. Se detecto una marcada reactividad con la banda de 34kDa. En el carril 3, se coloco una muestra de papa sana obtenida en hidroponia, y en el carril 10 se aprecia menor sensibilidad cuando se procesa material obtenido de chancro en el tallo producido por R. solani.

[FIGURA 4 OMITIR]

[FIGURA 5 OMITIR]

Dot blot

La estandarizacion de las prueba con Dot blot permitio mejorar el diagnostico, disminuir los costos y posibilitar la evaluacion de un mayor numero de muestras. Uno de los problemas observados es que si la prueba da positiva, no es posible saber con certeza si el organismo presente es R. solani AG-3 o R. solani AG-2-1, ya que los anticuerpos se enlazan a ambos grupos de anastomosis. En la Figura 7 se pueden apreciar resultados de Dot blot, en lA se encuentra la muestra de papa sana (control negativo) y los controles positivos en 2A y 3A (F3 de R. solani AG-3 de Mucuchies y R. solani AG-2-1 El Valle, respectivamente). El resto son representantes de las extracciones obtenidas en el muestreo para la deteccion en los tuberculos, donde las numeradas como 1 (4A), 5 (1B), 12 (6B) y 18 (6C) dieron negativas para la prueba de Dot blot y para las pruebas de aislamientos, estas provenian de tuberculos asintomaticos. Los resultados obtenidos en Dot blot coincidieron 100% con los de Western blot.

Discusion

La tendencia de distribucion en campo de los aislados de R. solani AG-3 y AG-2-1 es similar a la obtenida por Cedefio et al. (2001), encontrandose los representantes del grupo AG-3 en la localidad de Mucuchies y los de AG-2-1 en El Valle y Mucuchies. Sin embargo, AG-2-1 registro menor porcentaje de incidencia (3,77%) que AG-3 (96,23%) en Mucuchies. Aun cuando no se midio severidad, el estudio demuestra la importancia que tiene AG-3 sobre AG-2-1 al presentarse en el 65,38% de los casos estudiados.

El metodo de extraccion y separacion de fracciones proteicas utilizado en este trabajo, para la extraccion de proteinas unidas a la membrana mediante glicosilfosfatidilinositol (GPI), permitio a Afiez-Rojas et al. (2006) el desarrollo de anticuerpos especificos para diferenciar Trypanosoma rangeli y T. cruzi.

Al comparar los grupos de anastomosis en los geles SDS-PAGE, se aprecian diferencias en el patron de distribucion de las bandas. Sin embargo, los Western blot no permiten identificar a los grupos de R. solani evaluados. Esto es un indicador de que las diferencias apreciadas en los geles responden a proteinas que no revisten importancia en el desarrollo de los anticuerpos. De igual manera se puede concluir que los anticuerpos no son especificos en la deteccion dentro de los grupos de anastomosis, y que los mismos reaccionan por igual a los representantes de los grupos de R. solani estudiados (AG-3, AG-2-1 y AG-8); sin embargo, ai comparar la reactividad con otras especies (Fusarium oxysporum, Colletotrichum gloeosporioides y Botrytis cinerea), se concluye que la inmunodeteccion es especifica para R. solani. La deteccion de cantidades minimas (500ng) del antigeno y el corto tiempo para observar los resultados en el revelado del Western blot y el Dot blot, permiten intuir sobre la alta sensibilidad del metodo. Resultados similares consiguieron Thornton et al. (2004) al realizar pruebas de inmunodeteccion con anticuerpos monoclonales para la identificacion de R. solani AG-4, cuyos anti-cuerpos tambien reaccionaron con los grupos AG 1, 2-1, 2-3,2,3,4,5,6,7, 8, 9, 10, 11 y AG-BI.

[FIGURA 6 OMITIR]

[FIGURA 7 OMITIR]

La evaluacion de los anticuerpos en la deteccion de R. solani AG-3 de Mucuchies en esquejes de papa permitio comprobar la eficiencia del metodo en condiciones controladas. Fue un paso importante para establecer el procedimiento de deteccion en tuberculos contaminados naturalmente y las pruebas de diagnostico rapido (Dot blot).

De las bandas precipitadas en los diferentes Western blot en condiciones controladas, solo la de 34kDa se observa en las pruebas de deteccion en tuberculos contaminados naturalmente, lo que permite definir como la banda (proteina) mas importante al momento de realizar los estudios inmunologicos con R. solani. La resolucion de la prueba disminuye al utilizar material enfermo del tallo con sintomas de cancro. La prueba rapida de deteccion (Dot blot) permite realizar el diagnostico de manera rapida, y economica; la misma arrojo similares resultados que el Western blot y puede ser llevada a cabo en condiciones minimas de equipamiento. Otra ventaja del diagnostico conel Dot blot es el mayor numero de muestras que puede ser procesado en cada prueba.

Los resultados obtenidos demuestran el potencial que tiene el desarrollo de estudios inmunologicos y la aplicabilidad de las pruebas para la deteccion de patogenos de plantas en Venezuela, especialmente para aquellos organismos de crecimiento limitado en medios de cultivo o cuando se requieren respuestas rapidas para la toma de decisiones en las medidas de control.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen la colaboracion prestada por Nestor Anez y el equipo de trabajo del Laboratorio de parasitologia "J.F. Torrealba", ULA, Venezuela.

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Chrystian Carrero. Ingeniero Agronomo, Universidad del Zulia, Venezuela. M.Sc. en Manejo de Bosques y Doctor en Biotecnologia de Microorganismos Universidad de Los Andes (ULA), Venezuela. Profesor, ULA, Venezuela. Direccion: Laboratorio de Fitopatologia, Instituto de Investigaciones Agropecuarias (IIAP). Santa Rosa-La Hechicera, Merida, Venezuela. Apdo. Postal 77. e-mail: cfcarrer@ula.ve

Pabio Garcia. Licenciado en Biologia, ULA, Venezuela. Doctor en Ciencias Biologicas, Universidad de La Laguna, Espana. Profesor, ULA, Venezuela.

Agustina Rojas. Licenciada en Biologia y Doctorante en Biotecnologia de Microorganismos, ULA, Venezuela. Investigadora, ULA, Venezuela.

Henry Pino. Ingeniero Agronomo, Instituto Politecnico "Santiago Marino", Venezuela.
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Author:Carrero, Chrystian; Garcia-Lugo, Pablo; Rojas, Agustina; Pino, Henry
Publication:Interciencia
Date:Jan 1, 2011
Words:4390
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