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Deteccion y secuenciacion del genoma del potato virus y (PVY) que infecta plantas de tomate en Antioquia, Colombia.

Detection and genome sequencing of Potato virus Y (PVY) infecting tomato in Antioquia, Columbia

INTRODUCCION

El Potato virus Y (PVY) (Potyvirus, Potyviridae) es uno de los virus mas limitantes en los cultivos de plantas solanaceas en todo el mundo, incluyendo papa (Solanum tuberosum), tomate de arbol (Solanum betaceum), tabaco (Nicotiana tabacum), pimenton (Capsicum spp.) y tomate (Solanum lycopersicum) (Singh et al., 2008; Ayala et al., 2010; Jaramillo et al., 2011).

Los reportes de los efectos del PVY en los cultivos de tomate son muy variables; asi por ejemplo Thomas y McGrath (1988) indican que este virus ha causado epidemias en Australia con niveles de infeccion hasta del 100% y perdidas del 50% en la produccion de frutos, mientras que Morel et al. (2000) registran que el PVY fue un virus marginal en cultivos de tomate de los paises del mediterraneo, pero que luego de 1980, la llegada de nuevas variantes necrosantes ha cambiado la situacion a tal punto que en Valencia (Espana), despues del Tomato mosaic virus (ToMV), el PVY se registra como el segundo virus mas incidente en este hospedero (Soler et al., 2010).

Los sintomas inducidos por el PVY consisten en mosaicos con diferentes niveles de severidad, acompanados de rugosidad y deformacion de las hojas, e incluso necrosis sistemica en algunas plantas como tabaco y papa. Las plantas mas infectadas pueden presentar defoliacion y enanismo severo (Kerlan, 2008; Singh et al., 2008). Algunos genotipos virales de PVY (Ej. [PVY.sup.NTN], [PVY.sup.Wi]) pueden inducir necrosis en la superficie de los tuberculos de papa, una enfermedad denominada como PTNRD, por sus siglas en ingles (Tuber Necrotic Ringspot Disease of Potato) (Schubert et al., 2007). Especificamente en tomate, las cepas de [PVY.sup.O] y [PVY.sup.C] inducen deformacion de hojas jovenes, seguido por moteados necroticos y algunas veces necrosis de venas; mientras que [PVY.sup.N/NTN] causan mosaicos severos con presencia de parches amarillos intervenales y manchas blanquecinas en los frutos, lo que afecta su calidad comercial (Shukla et al., 1994). El PVY es transmitido mecanicamente y por propagacion asexual (ej. tuberculos de papa, esquejes), asi como por mas de 100 especies de afidos de forma no persistente, siendo los miembros de la especie Myzus persicae los mas eficientes (Kerlan, 2008).

Los viriones de PVY se caracterizan por presentar particulas filamentosas de aproximadamente 730 nm de longitud, con una molecula de ARN de cadena sencilla de 9700-9800 nucleotidos (nt), con poli-A en el extremo 3' y una proteina VPg unida covalentemente al extremo 5' (Karasev y Gray, 2013). Su genoma se expresa por una poliproteina que es procesada por tres proteasas de origen viral (NIa, HC-Pro y P1) dando origen a 11 proteinas funcionales (P1, HCPro, P3, PIPO,6K1, CI, 6K2, NIa-VPg, NIa-Pro, NIb y CP); las dos ultimas correspondientes a la replicasa viral RdRp (RNA-dependent RNA polymerase) de 59,7 kDa y la proteina de la capside (CP) de 30 kDa (Crosslin y Hamlin, 2011).

El PVY es un virus altamente variable a nivel biologico y molecular, debido a sus altas tasas de mutacion y recombinacion genetica (Glais et al., 2002; Karasev y Gray, 2013). Tradicionalmente, los aislamientos del virus han sido divididos en cuatro razas principales: [PVY.sup.O] corresponde a la raza ordinaria y causa un mosaico general en papa y tabaco; PVYN causa necrosis de venas en tabaco y mosaicos suaves en papa; [PVY.sup.C] produce estriado puntiforme en papa y [PVY.sup.Z] que causa sintomas no necroticos pero es serologicamente diferente a [PVY.sup.O] (Singh et al., 2008). [PVY.sup.N] presenta ademas al menos dos variantes, denominadas como [PVY.sup.NTN] y [W.sup.i] (Singh et al., 2008; Karasev y Gray, 2013). Este ultimo genotipo es nombrado en Norteamerica como [PVY.sup.N:O] ya que induce necrosis de venas en tabaco, pero tiene una reaccion serologica similar a la raza [PVY.sup.O] ; se ha demostrado que dicha variante es producto de eventos recombinatorios entre aislamientos de [PVY.sup.N] y [PVY.sub.O] (Schubert et al., 2007).

En Colombia, el PVY se ha identificado como uno de los principales virus que afectan los cultivos de papa y otras solanaceas en la region Andina (Ayala et al., 2010; Gil et al., 2011; Villamil-Garzon et al., 2014). Henao-Diaz et al. (2013), utilizando analisis de secuencias de la region CP, reportaron la ocurrencia de tres variantes principales de PVY en este pais denominadas como II-Int, I-Col y IV-Col, las dos ultimas aparentemente son endemicas al no asociarse filogeneticamente con ninguna secuencia de referencia de los linajes geneticos que representan las razas tradicionales de PVY; mientras II-Int hace parte del linaje [PVY.sub.N/NTN], ampliamente reportado en diferentes paises del mundo (Ogawa et al., 2008; Karasev y Gray, 2013).

Recientemente, utilizando metodologias de secuenciacion de nueva generacion (NGS) a partir de micro-ARNs, fue reportada la secuencia completa del genoma de un aislamiento de PVY presente en una infeccion mixta con Potato yellow vein virus (PYVV) en plantas de Solanum phureja en Cundinamarca, Colombia, siendo confirmada su afinidad filogenetica con cepas de [PVY.sup.NTN] de Europa y Norteamerica (Villamil et al., 2014).

A pesar de que el PVY ha afectado cultivos de tomate en diferentes regiones andinas de Colombia (Jaramillo et al., 2007) y de paises limitrofes como Brasil (Lourencao et al., 2005) y Venezuela (Nava et al., 1997), hasta el momento se desconocen las caracteristicas moleculares de las cepas que infectan este hospedero en la region Andina, asi como su afinidad filogenetica. Por esta razon, en el presente estudio se evaluo la ocurrencia del PVY en una region montanosa del oriente del departamento de Antioquia, Colombia y se analizo su genoma viral completo utilizando el sistema NGS Illumina HiSeq2000.

MATERIALES Y METODOS

Muestras. En cada uno de tres lotes de cultivo de tomate var. Chonto en estado de floracion, ubicados en la zona rural de los municipios de Marinilla (dos lotes) y El Penol (un lote) al oriente del departamento de Antioquia, Colombia, se obtuvieron en forma aleatoria 15 muestras foliares de plantas con el fin de evaluar la presencia de PVY mediante pruebas de TAS-ELISA. En esta region confluyen cultivos de tomate con los de otras plantas solanaceas susceptibles a la infeccion por PVY como papa, tomate de arbol y pimenton. Una vez en el laboratorio, de cada lote bajo analisis se realizaron tres muestras compuestas (5X) con el fin de realizar su maceracion con nitrogeno liquido para la extraccion del ARN total.

Pruebas de TAS-ELISA y confirmacion de PVY por RT-PCR. En las 45 muestras foliares individuales de tomate se evaluo la presencia de PVY con pruebas de TAS-ELISA (Triple Antibody Sandwich) de la compania Agdia, siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados colorimetricos fueron cuantificados en un equipo Multiscan RC/MS/EX (Labsystem), incluyendo en cada prueba un control positivo y un control negativo, consistentes de tejidos vegetales suministrados en forma liofilizada por Agdia. Para la definicion de las muestras positivas, se utilizo la formula del valor de corte (cut-off) reportada por Bioreba (www.bioreba.com) [Cut-off = (promedio + 3 desviaciones estandar) x 1,1]. La naturaleza viral del control positivo y de una de las muestras positivas para PVY fue confirmada por RT-PCR convencional y secuenciacion de Sanger, con los cebadores PVYCPF (5'ACC ATC AAG SAA ATG ACA CA 3') y PVYCPR (5'CGG AGA GAC ACT ACA TCA CA 3') que amplifican el gen completo (801 pb) de CP (Glais et al., 2002), siguiendo el protocolo reportado por Henao et al. (2013). Adicionalmente, en cinco de las muestras que resultaron positivas por TAS-ELISA, representadas por tres muestras de Marinilla y una del Penol, mas el control positivo (Cuadro 1) fue reconfirmada la presencia de PVY con un procedimiento de inmunocaptura RT-PCR en tiempo real (IC-RT-qPCR), a partir de la liberacion post-ELISA de las particulas virales putativas, siguiendo el procedimiento descrito por Wetzel et al. (1992), en el que se utilizan 70 [micron]L de buffer de liberacion (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, 1% Triton X 100) e incubacion a 70[grados]C durante 10 min. Las condiciones de las reacciones de retrotranscripcion y PCR fueron aquellas previamente reportadas por Medina et al. (2015), utilizando los primers PVY-1 FP (5'CCA ATC GTT GAG AAT GCA AAA C 3') y PVY-1 RP (5'ATA TAC GCT TCT GCA ACA TCT GAG A 3') (Singh et al., 2013) que amplifican una porcion de 74 pb de la region CP de PVY.

Deteccion de PVY por RT-qPCR. Se evaluo la presencia de PVY en las tres muestras compuestas de cada lote mediante pruebas de RT-qPCR con SYBR Green I, a partir del ARN total extraido con el kit GeneJET Plant RNA Purification (Thermo), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las condiciones de amplificacion fueron aquellas reportadas por Medina et al. (2015), siendo definidas como muestras positivas las que presentaron valores de ciclo umbral (threshold cycle--Ct) menores de 35 y amplicones con temperatura de fusion (Tm) de [+ o -] 2[grados]C respecto al control positivo, siguiendo los criterios de Schena et al. (2004). Todas las reacciones de RT-qPCR incluyeron un control negativo libre de cDNA viral. La naturaleza viral de dos de los amplicones que cumplieron estas condiciones y del control positivo fue reconfirmada por secuenciacion de Sanger.

Secuenciacion NGS. A partir de las muestras compuestas que resultaron positivas para PVY en las pruebas de RT-qPCR se realizo una mezcla aleatoria de ARN total, siendo determinada su concentracion y pureza por lecturas de absorbancia a 260 nm y 280 nm en un equipo Nanodrop 2000C (Thermo). Posteriormente las muestras fueron tratadas con el kit TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero Plant kit (Illumina) para eliminar el ARN ribosomal y evaluado su RIN (RNA Integrity Number) en un equipo 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Las librerias de ADNc se construyeron con el kit TruSeq RNA Sample Preparation (Illumina) y la secuenciacion masiva fue realizada en un equipo HiSeq 2000 (Illumina, Macrogen). Una vez obtenidas las secuencias se removieron las bases con baja calidad (Phred <30) utilizando el programa SeqTK (https://github.com/lh3/seqtk) y las lecturas de secuencias o reads correspondientes al genoma de PVY fueron identificadas por mapeo contra genomas de referencia utilizando el programa Bowtie2 (Langmead y Salzberg, 2012) y por comparaciones con las bases de datos moleculares con BLASTX (Gish y States, 1993). Los genomas completos de las variantes de PVY detectadas en el estudio fueron ensamblados utilizando rutinas en lenguaje de programacion Perl escritas por nuestro grupo para este fin.

Analisis filogeneticos. Las secuencias obtenidas por NGS para los genomas completos de PVY y por secuenciacion de Sanger para la region CP fueron utilizadas como base para realizar analisis filogeneticos a partir de su alineamiento con respecto a secuencias de cepas de PVY de referencia (Ej. [PVY.sup.O], [PVY.sup.N/NTN],[ PVY.sup.N:O/Wi] y [PVY.sup.C]), asi como con cepas de este virus obtenidas en tomate y disponibles en GenBank. Los alineamientos se realizaron con el programa Clustal W y los analisis de agrupamiento con el algoritmo de maxima verosimilitud y el modelo Jukes-Cantor utilizando el programa Mega 6.0 (Tamura et al., 2013).

RESULTADOS Y DISCUSION

Pruebas de TAS-ELISA y confirmacion de PVY por RT-PCR. El virus PVY fue detectado mediante pruebas de TAS-ELISA en dos de los tres lotes de tomate var. Chonto provenientes de los municipios de Marinilla (L2) y El Penol (L3) con un nivel de incidencia del 13,3%, es decir, se encontro en seis de las 45 muestras evaluadas (Figura 1). La validez de las pruebas fue confirmada por el alto valor de absorbancia obtenido para el control positivo (0,93) y los bajos niveles alcanzados para los controles negativos (promedio = 0,166; SD = 0,011); definiendose en el histograma de frecuencias de absorbancia a 405 nm, un nivel de 0,334 como el valor de corte del ensayo. Utilizando RT-PCR con los primers PVY CPF y PVY CPR se obtuvieron los fragmentos del tamano esperado de 801 pb para el control positivo y una de las muestras evaluadas (TM2.11) procedente del municipio de Marinilla. La naturaleza viral de dichos amplicones fue confirmada por comparacion con las bases de datos moleculares, presentandose para el control positivo una identidad del 100% con respecto a varios aislamientos de la raza ordinaria de este virus ([PVY.sup.O]) (ej. HQ912915 y JQ954367) mientras que para la muestra TM2.11 dicho valor fue de 99% con cepas de [PVY.sup.NTN] (ej. KM396648, JF927752 y JN936432).

[FIGURA 1 OMITIR]

Las pruebas de IC-RT-qPCR, utilizando como molde los productos de la post-ELISA, resultaron positivas para las cuatro muestras evaluadas con valores de Ct de 29,09 a 33,02 y de 23,02 para el control positivo; este ultimo presento una temperatura de fusion (Tm) de 77,5[grados]C, mientras que en las muestras estos valores fueron de 77 [+ o -] 0,5[grados]C, validandose asi su identidad como amplicones de la region CP de PVY (Cuadro 1). La naturaleza viral de los amplicones de IC-RT-qPCR resulto positiva para PVY por secuenciacion de Sanger, encontrandose niveles de identidad del 95 a 99% con respecto a secuencias de [PVY.sup.NTN] de Colombia previamente depositadas en GenBank por Gil et al. (2011) (ej. JF939837, HQ335262 y HQ335259), mientras que el control positivo presento 100% de identidad con las accesiones de PVY: KJ741195, KJ741026 y KJ741031.

Deteccion de PVY por RT-qPCR. Con el uso de RT-qPCR a partir de ARN total se detecto el PVY en todas las muestras compuestas de los tres lotes de tomate evaluados, obteniendose valores de Ct en el rango de 14,31 a 29,79 (Cuadro 1; Figura 2A). Estos valores fueron inferiores a aquellos encontrados para las pruebas de IC-RT-qPCR, lo que indica la obtencion de un mayor titulo de genomas virales cuando se extrae directamente el ARN de los tejidos vegetales. A diferencia del TAS-ELISA, esta prueba detecto el PVY en muestras del primer lote, lo cual corrobora varios reportes en los que se indica que la RT-qPCR ofrece niveles superiores de sensibilidad, del orden de [10.sup.4] a [10.sup.8] veces, con respecto a pruebas de ELISA (Mumford et al., 2000; Bertolini et al., 2008). Asi por ejemplo, especificamente para PVY, Kogovsek et al. (2008) en un estudio tendiente a disenar pruebas de RT-qPCR para diferenciar aislamientos recombinantes de [PVY.sup.NTN], encontraron que las pruebas en tiempo real presentaban sensibilidades superiores entre [10.sup.5] y [10.sup.7] veces con respecto a las pruebas de ELISA comerciales, mientras que Medina et al. (2015) al evaluar la capacidad de las pruebas de RT-qPCR para detectar este virus en tuberculos-semilla de dos variedades de papa (ICA-Capiro y Criolla Colombia) en Antioquia, registraron que esta prueba detecto el PVY en el 80,6% de las muestras, mientras que con TAS-ELISA tan solo se encontro en el 37,5% de estas. La especificidad de los amplicones de RT-qPCR fue confirmada por el analisis de las curvas de desnaturalizacion utilizando la herramienta de HRM (High Resolution Melting), al encontrarse que los valores de Tm de todas las muestras se presentaban en el rango de 77[grados]C [+ o -] 1,5[grados]C, es decir, en valores cercanos al encontrado para el Tm del control positivo de Agdia (77,5[grados]C) (Figura 2B). Sin embargo, la amplitud del rango de temperaturas de fusion, claramente indican la ocurrencia de diferentes variantes de PVY que estan infectando plantas de tomate en el oriente Antioqueno. Tal como ocurrio para las pruebas de IC-RT-qPCR, la naturaleza de dos de los amplicones y del control positivo fue ademas reconfirmada por secuenciacion de Sanger (Accesiones KJ865800, KJ847046 y KJ847048, Identidad = 98-100%).

Secuenciacion NGS. La secuenciacion NGS del transcriptoma de tomate genero una libreria pareada de 5.571.097 reads (100 nt/read) para un total de 1.114.219.400 nt. Los analisis de mapeo contra genomas de referencia y de BLASTX identificaron la presencia de dos variantes de PVY (PVY_Var A y PVY_Var B) en este hospedero en proporcion 3:2; cuyos genomas completos fueron ensamblados de novo a partir de 2.954 y 1.943 reads pareados, con un promedio de profundidad (numero promedio de nucleotidos obtenidos para cada sitio secuenciado del genoma) de 59,6X y 39,2X, para PVY_Var A (accesion KT290511) y PVY_Var B (accesion KT290512), respectivamente (Figura 3), segun informacion presentada en las secuencias que fueron depositadas en GenBank. Para nuestro conocimiento y segun se deriva de busquedas en GenBank estos son los primeros genomas completos de PVY obtenidos directamente a partir de plantas de tomate infectadas con este virus en America y el segundo en el mundo, luego de la accesion EU482153 de Italia, pues solamente se presentan registros de secuencias de PVY en tomate para algunas regiones codificantes como CP y NIb.

[FIGURA 2 OMITIR]

[FIGURA 3 OMITIR]

Los genomas de las dos variantes de PVY encontradas tienen 9726 nt (Figura 3) y comparten 97,5% de identidad en toda su secuencia de nt; aunque en la region que codifica para P1 la identidad cae en algunos sitios hasta cerca del 88% y presenta una identidad promedio de 93,9% en nt y 94,37% en aminoacidos (aa) (Figura 4). Dichos genomas presentan un marco de lectura abierto (ORF) que codifica para una poliproteina de 3061 aa, flanqueado por regiones no traducidas (UTR) 5' y 3' de 218 y 325 nt (excluyendo la cola de poli-A), respectivamente (Figura 3), con un alto grado de conservacion al presentarse solo una transicion (T9643C) en la region 3' UTR (ver accesiones KT290511 y KT290512). En el extremo 5' UTR se detectan las secuencias especificas de Potyvirus denominadas como potyboxes A y B (Turpen, 1989) con las secuencias TCAATACAACAT en las posiciones 43-54 y TCAAACAA entre los sitios 100 y 107.

[FIGURA 4 OMITIR]

La region codificante para la poliproteina corresponde a las posiciones 219-2404 de los dos genomas secuenciados en este trabajo. En esta region se encuentran localizadas la mayoria de las sustituciones entre las dos variantes de PVY (214 transiciones y 27 transversiones). Entre ambas variantes, la poliproteina comparte una identidad global del 98,7% a nivel de aa y presenta sitios de corte proteoliticos con motivos conservados similares a los reportados por Adams et al. (2005a) y ubicados en las posiciones 284, 740, 1105, 1157, 1791, 1843, 2031, 2275 y 2794, para dar origen a cada una de las proteinas maduras de PVY: P1, HC-Pro, P3, 6K1, CI, 6K2, NIa-VPg, NIa-Pro, NIb y CP (Figura 3).

La proteasa P1 (284 aa) es la proteina mas variable de estos genomas, con un 94% de identidad a nivel de aa entre ambas variantes. Los bajos niveles de conservacion de P1 han sido previamente observados en el genero Potyvirus (Rohozkova y Navratil, 2011) e incluso Adams et al. (2005b), senalan la ocurrencia de niveles de identidad en esta region tan bajos como 41,4% entre miembros de una misma especie potyviral. La proteina HC-Pro (456 aa) comparte un porcentaje de identidad del 99% entre ambas cepas y presenta cinco cambios de aa (expresados en nomenclatura IUPAC): R16Q, N130S, C195S, S247A y R269K. Contiene los motivos conservados FRNK (residuos 463-466) e IGN (residuos 531-533) asociados a la supresion del silenciamiento de genes y a la replicacion viral, respectivamente (Revers y Garcia, 2015). El ORF correspondiente a P3 contiene la secuencia [GA.sub.7]T en la posicion (2949-2957) que da origen a la proteina P3N-PIPO (247 aa) resultante de un cambio en el marco de lectura identificado previamente por Chung et al. (2008); esta region tiene un codon de parada ocre (UAA) en la posicion 3179. La P3 (365 aa) presenta un 99,4% de identidad, con solo dos cambios: K183R y R206Q. La proteina de inclusion cilindrica CI (634 aa) es una de las mas conservadas entre especies de Potyvirus segun lo reporta Adams et al. (2005b) y por tanto es propuesta como base para la identificacion de especies en este grupo, cuando no sea posible la secuenciacion del genoma completo. En este trabajo, solo un cambio (I427T) fue observado entre las dos variantes de PVY identificadas en plantas de tomate.

La region CI contiene los motivos DECH (residuos 1331-1334) y GSGKSTGLP (residuos 1245-1253) tipicos de la superfamilia de helicasas SF2 (Revers y Garcia, 2015). Para la proteina viral de union al genoma Vpg (188 aa) se observan dos cambios: M115L y R105K y un nivel de identidad entre las variantes del 96,8% en nt y 98,9% en aa. Esta proteina esta involucrada en diferentes pasos del ciclo de infeccion potyviral, incluyendo su replicacion y movimiento sistemico (Rajamaki et al., 2014). NIa-Pro (244 aa) presenta cinco cambios (I21V, I104V, K119R, G184E, D194N), entre las dos variantes de PVY aqui caracterizadas y 98% de identidad. NIa-Pro, la cistein proteasa responsable del corte en los sitios P3/6K1, 6K1/CI, CI/6K2, 6K2/VPg, VPg/NIa-Pro, Nia-Pro/NIb, NIb/CP con secuencia de reconocimiento V-X-(HE)-(QE) (Adams et al., 2005a). NIb (519 aa), la replicasa viral, tiene un 99% de identidad a nivel de aa entre las dos variantes, con las siguientes sustituciones K233R, S364N, H429Y, D487N, R496K, F509L y presenta el motivo GDD conservado en las RdRp virales (residuos 2626-2628) y la secuencia de localizacion nuclear II (NSLII) TPISTPDGTIVKKFRGNNSGQPSTV (Revers y Garcia, 2015). Finalmente, la proteina de la capside (CP) (267 aa) tiene tres variaciones D3E, N11T y N138D y niveles de identidad de 96,5% en nt y 98,8% en aa, ademas de la presencia del motivo DAG (residuos 2780-2782) involucrado en la transmision por afidos de PVY (Revers y Garcia, 2015).

Los analisis de variacion realizados entre las secuencias de estas dos variantes con respecto a cepas representativas de diferentes razas de PVY reportadas en el mundo indican niveles de identidad de nt del 94,5% (97,6% en aa) y 90% (94,5% en aa) con respecto a aquellas de [PVY.sup.NTN] NTNON92 de Japon y Linda de Alemania, respectivamente; siendo las regiones del genoma mas variables, aquellas que codifican para CI y un hot-spot ubicado cerca al extremo 5' de NIb (Figura 4). Por su parte, los niveles promedio de identidad entre las cepas de PVY de tomate y representantes de [PVY.sup.C] y [PVY.sup.O] son del 83,3% (90,1% en aa) y 83,5% (90,2% en aa) respectivamente; con las regiones que codifican para la proteasa P1 las mas disimiles, con niveles de identidad entre 60 y 80% (Figura 4).

Analisis filogeneticos. El arbol filogenetico generado para la poliproteina de PVY presento cuatro clados principales, correspondientes a los linajes que representan las razas [PVY.sup.N/NTN], [PVY.sup.N:O], [PVY.sup.C] y [PVY.sup.O] El clado de [PVY.sup.N/NTN] incluyo cepas tanto del tipo principal N como de la variante NTN y se presento subdividido en dos grupos con 100% de soporte del analisis bootstrap, siendo el primero de ellos el que albergo las dos secuencias obtenidas en este trabajo (Figura 5A). De forma interesante, el aislamiento LYE84.2 de Islas Canarias (Espana) tambien obtenido en tomate por Abad y Jorda (2000), se ubico en el clado de [PVY.sup.C] y se presento distantemente relacionado con los aislamientos del presente trabajo sobre este hospedante.

Por otra parte, el arbol filogenetico realizado para CP, presento una topologia similar al anterior, aunque las cepas de [PVY.sup.O] y [PVY.sup.N:O] se ubicaron en un solo clado, dado que las regiones de recombinacion entre estas se ubican en otras regiones del genoma diferentes a CP (Karasev y Gray, 2013). Los aislamientos de PVY secuenciados en este trabajo, nuevamente se ubicaron en el clado representativo de [PVY.sup.N/NTN], pero en esta ocasion las dos variantes se ubicaron en subclados separados, aunque unicamente conformados por aislamientos de este virus previamente reportados por Gil et al. (2011) en cultivos de papa de diferentes regiones de Colombia (Figura 5B).

Estos resultados confirman los hallazgos de la ocurrencia de variantes unicas de PVY en la region Andina de Colombia (Gil et al. 2011; Henao et al., 2013) y ponen de manifiesto la posible patogenicidad cruzada de estos aislamientos entre diferentes hospedantes de plantas solanaceas que comparten agroecosistemas en las regiones montanosas de Antioquia, situacion que requiere ser evaluada experimentalmente, de manera que puedan valorarse sus implicaciones epidemiologicas y para el manejo de las virosis causadas por PVY en las zonas altoandinas. Finalmente, la secuencia del control positivo comercial empleado en los analisis de TOAS-ELISA y RT-qPCR se ubico en el clado [PVY.sup.O], lo que coincide con su origen en Estados Unidos (Agdia, Numero LPC 20001) y confirma su utilidad en los analisis aqui realizados.

[FIGURA 5 OMITIR]

De estos analisis filogeneticos se evidencia que los aislamientos de PVY de tomate presentan diferentes genotipos ([PVY.sup.N/NTN], [PVY.sup.C] y [PVY.sup.O]). Esta situacion coincide con los reportes de literatura que senalan haber encontrado linajes diversos de PVY en este hospedero. Asi por ejemplo, Mascia et al. (2010), indican la ocurrencia de una cepa de [PVY.sup.C] causante de necrosis foliar de tomate en Italia, que presentaba una region del genoma recombinante con una cepa ordinaria de PVY ([PVY.sup.O]) y que ademas causaba lesiones necroticas en los frutos, afectando drasticamente su calidad comercial. Ibaba y Gubba (2011) en un estudio tendiente a caracterizar la variacion de PVY en KwaZuluNatal (Sudafrica) reportaron que las plantas de tomate eran infectadas por cepas de [PVY.sup.O]; mientras que Aramburu et al. (2006) en Espana, encontraron cepas de PVY asociadas a [PVY.sup.N], [PVY.sup.NTN] y [PVY.sup.NP] en cultivos de tomate del nororiente de este pais. Tal como lo senalan estos ultimos autores, el tomate parece ser un hospedero poco restrictivo para el PVY, por lo que es posible y frecuente encontrar gran diversidad genetica en los aislamientos de este virus que lo infectan e incluso con ocurrencia de infecciones mixtas y presencia de cepas recombinantes, lo que complica aun mas la adopcion de medidas de manejo y el desarrollo de programas de mejoramiento genetico.

Hasta el momento la ocurrencia de PVY en cultivos de tomate de Colombia se ha registrado de forma marginal y por asociacion con reportes de la infeccion en cultivos de otros paises (Jaramillo et al., 2007), e incluso trabajos como los realizados por Morales et al. (2009) sobre los virus del tomate en Colombia solo reportan la presencia del potyvirus Pepper deforming mosaic virus (PepDMV) en este cultivo. Sin embargo, en este trabajo la deteccion de PVY mediante pruebas de TAS-ELISA y RT-qPCR en diferentes plantas de tomate de cultivos del oriente Antioqueno suponen que su incidencia es mayor a lo que hasta ahora se ha considerado en Colombia. Adicionalmente, la identificacion por NGS de los genomas completos de cepas necrosantes de PVY indican lo que se ha demostrado en paises tales como Brasil (Lourencao et al., 2005) y Espana (Aramburu et al., 2006), que la presencia de sintomas como mosaicos foliares severos, manchas cloroticas y necroticas en los frutos, pueden ser erroneamente asociados a otros agentes etiologicos en cultivos de tomate. Por estas razones, sera de gran interes en el corto plazo realizar analisis de incidencia utilizando tecnicas altamente sensibles como la de RT-qPCR en diferentes regiones cultivadoras de tomate de Colombia y otros paises andinos; asi como adelantar estudios biologicos de los efectos de cepas necrosantes y no necrosantes de PVY en las variedades de tomate cultivadas en esta region.

CONCLUSIONES

Se encontro el PVY en el 13,3% de 45 muestras foliares de tomate var. Chonto procedentes de tres lotes de cultivo del oriente de Antioquia, Colombia. Este resultado, obtenido mediante pruebas de TAS-ELISA fue confirmado por pruebas de RT-qPCR, las que detectaron los amplicones de este virus entre los ciclos umbral (Ct) 14,31 y 33,8, y con valores de Tm de 77 [+ o -] 1,5[grados]C.

Los analisis bioinformaticos de los resultados de secuenciacion de nueva generacion del transcriptoma de tejido foliar de tomate permitieron identificar la ocurrencia de dos variantes del PVY en el oriente de Antioquia. Sus genomas tienen un tamano de 9726 nt, comparten 97,5% de identidad y presentan afinidad filogenetica con genotipos de las razas necrosantes de este virus ([PVY.sup.N] y [PVY.sup.NTN]). Para nuestro conocimiento, este reporte constituye el primero en America de secuencias de genomas completos de PVY que infectan en forma natural el tomate.

AGRADECIMIENTO

A la Vicerrectoria de Investigaciones de la Universidad Nacional de Colombia por el financiamiento a este trabajo (Proyecto 32098).

LITERATURA CITADA

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Laura Munoz-Baena [1], Pablo A. Gutierrez-Sanchez [1] y Mauricio Marin-Montoya [1]

Recibido: Julio 23, 2015 Aceptado: Febrero 1, 2016

[1] Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellin. Colombia. e-mail: lamunozba@unal.edu.co; paguties@unal.edu.co; mamarinm@unal.edu.co
Cuadro 1. Confirmacion por RT-qPCR de la presencia del Potato
virus Y (PVY) en tejidos foliares de plantas de tomate
procedentes del departamento de Antioquia, Colombia

Muestra   Municipio de procedencia   Valor de Ct *   Valor de Tm **

          IC-RT-qPCR (Post-ELISA)

C- ***                                    >35
TM1.8            Marinilla               33,02           76,75
TM2.3            Marinilla               33,80           77,02
TM2.11           Marinilla               29,09           76,93
TM3.1             El Penol               31,01           77,11

          RT-qPCR (ARN total)

C-                                        >35
TM1A             Marinilla                >35
TM1B             Marinilla               29,51           77,75
TM1C             Marinilla               29,79           77,57
TM2A             Marinilla               15,75           76,02
TM2B             Marinilla               28,17           77,84
TM2C             Marinilla               14,31           77,29
TM3A              El Penol               23,92           78,02
TM3B              El Penol               17,38           78,38
TM3C              El Penol               27,50           77,02

* Ct corresponde al ciclo umbral de amplificacion; Ct>35
representa resultados negativos en las pruebas de RT-qPCR. ** Tm
indica la temperatura de fusion, es decir aquella en la que el 50
% de la doble helice de los amplicones se encuentran
desnaturalizados. Las muestras subrayadas corresponden a los
amplicones obtenidos por RT-qPCR que fueron secuenciados y
confirmados como parte de la region que codifica para la capside
de PVY. *** C-son los controles negativos; los controles
positivos de Agdia para IC-RT-qPCR presentaron valores de Ct =
23,02 y Tm = 77,57; mientras que para RT-qPCR fueron de Ct =
20,17 y Tm = 77,5
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Author:Munoz-Baena, Laura; Gutierrez-Sanchez, Pablo A.; Marin-Montoya, Mauricio
Publication:BIOAGRO
Date:Aug 1, 2016
Words:6652
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