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Deteccion molecular del virus de Lengua Azul en Culicoides insignis y en ovinos de Pucallpa, Peru.

Molecular detection of Bluetongue virus in Culicoides insignis and sheep of Pucallapa, Peru

INTRODUCCION

El cambio climatico y el calentamiento global estan generando cambios en la distribucion y abundancia de mosquitos vectores y los arbovirus que ellos transmiten (Hunter, 2003). La propagacion y migracion de muchas especies de mosquitos ha incrementado la presencia y diseminacion de agentes virales hacia paises donde no existian reportes de algunas infecciones, ocasionando la ocurrencia de enfermedades emergentes o reemergentes de importancia para la salud animal y publica (Purse et al., 2005). Entre la amplia gama de mosquitos vectores, se cree que los mosquitos Culicoides spp son particularmente mas sensibles a cambios climaticos (Purse et al., 2008), debido a que son poiquilotermos y utilizan una gran variedad de habitats con areas semiacuaticas para su desarrollo; por tanto, las tasas demograficas y las interacciones con los hospederos son sensibles a variaciones sutiles de temperatura y humedad (Purse et al., 2015).

El genero Culicoides Latreille, 1809 (Diptera: Ceratopogonidae) esta compuesto por aproximadamente 1400 especies (Harrup et al., 2015). Treinta especies han sido asociadas a nivel mundial a la transmision del virus de Lengua azul (VLA). Uno de ellos es C. sonorensis, el principal vector en America del Norte (Tabachnick, 1996). En contraste, en America del Sur existe muy poca informacion sobre los vectores implicados en la transmision de VLA, siendo Culicoides insignis el posible vector predominante (Gorchs y Lager, 2001), seguido de C. pusillus (Ronderos et al., 2003). En el Peru se han descrito 31 especies de Culicoides, entre ellas C. insignis en Loreto y C. pusillus en Cajamarca y Madre de Dios (Felippe-Bauer et al., 2008), pero no se ha evaluado su implicancia como vectores en la transmision de VLA u otros agentes virales.

La enfermedad de Lengua azul afecta a rumiantes domesticos y silvestres, siendo los ovinos los mas susceptibles. Es producida por el VLA, miembro del grupo Orbivirus de la Familia Reoviridae (Ratinier et al., 2011). VLA posee un genoma ARN de doble cadena dividido en 10 segmentos que codifican 7 proteinas estructurales y 4 proteinas no estructurales. Las proteinas esturcturales VP2 y VP5 forman parte de la capside externa y son altamente variables, determinando los serotipos del virus. Las proteinas VP7 y VP3 forman parte del core interno y son las mas abundantes, inmunogenicas y constituyen el antigeno del grupo Orbivirus. Tambien los epitopos especificos para VLA, enfermedad hemorragica epizootica, y peste equina africana (Ratinier et al., 2011; Purse et al., 2015). Los anticuerpos inducidos por la VP7 posinfeccion y detectado por pruebas serologicas especificas indica positividad al VLA, pero no identifica al serotipo o serotipos presentes en una determinada zona o area.

VLA presenta 27 serotipos identificados hasta el momento. Esta alta frecuencia de serotipos es debido a su genoma segmentado donde los procesos de recombinacion son frecuentes (Caporale et al., 2014; Purse et al., 2015; Schulz et al., 2016). El VLA es transmitido por dipteros del genero Culicoides. El virus replica en las celulas del sistema vascular de su hospedero mamifero, ocasionando edemas en la cabeza, coronitis en las patas, problemas reproductivos y, ademas, restringe el comercio internacional de animales en pie y de germoplasma por estar en la lista de enfermedades de declaracion obligatoria ante la Organizacion Mundial de Salud Animal (OIE) (Tabachnick, 1996; Wilson y Mellor, 2009). La enfermedad es endemica en zonas tropicales y subtropicales donde el virus persiste entre algunas especies de Culicoides spp y vertebrados domesticos y silvestres, los cuales se infectan, pero no desarrollan la enfermedad.

En las ultimas dos decadas, el VLA ha ocasionado severos brotes en rumiantes domesticos y silvestres en paises europeos, ubicados fuera del rango de 40[grados]N y 35[grados]S, como sucedio en Espana, Belgica y Alemania, debido a la migracion de Culicoides spp a latitudes cada vez mayores donde los rumiantes son susceptibles (Purse et al., 2005; Meroc et al., 2009). En los brotes causados por un solo serotipo del VLA en paises europeos, mas de 800 000 cabezas de ovinos fueron afectados. Asi mismo, los brotes ocurridos en Belgica entre 2006 y 2007 ocasionaron perdidas por 180 millones de euros al ano (Wilson y Mellor, 2009).

En el Peru, la presencia de VLA solo ha sido demostrada serologicamente en ovinos, camelidos y en animales silvestres de areas tropicales (Rosadio et al., 1984; Rivera et al., 1987, 2013). Recientemente, Navarro et al. (2018) identificaron a Culicoides insignis en areas cercanas a granjas de ovinos seropositivos al VLA en Pucallpa, Ucayali, sugiriendo ser los potenciales vectores involucrados en la transmision de VLA. El objetivo del presente estudio fue detectar el ARN del virus de Lengua azul en ovinos seropositivos y en Culicoides insignis capturados en areas cercanas a los ovinos en Pucallpa en un contexto de vigilancia epidemiologica del VLA.

MATERIALES Y METODOS

Lugar del Estudio

El estudio fue realizado en tres granjas de ovinos de pelo seropositivos a VLA en la localidad de Santa Rosa de Lima, distrito de Campo Verde, provincia Coronel Portillo, Peru, ubicado una altitud media de 193 m. Los ovinos fueron nativos de la zona; sin embargo, en la decada del 80 se importaron ovinos de pelo de Brasil que fueron distribuidos en diversas zonas del tropico central del pais (H. Rivera, 2016, Lima comunicacion personal), pudiendo haber descendientes cruces de estos animales en la muestra. La captura de los mosquitos fue relizada en la misma localidad.

Muestras

En una primera etapa se colectaron muestras de sangre de ovinos mayores a seis meses y aparentemente sanos (n=46) provenientes de tres granjas de ovinos. Las muestras fueron obtenidas de la vena yugular o cefalica utilizando tubos al vacio sin anticoagulante y centrifugadas a 800 g por 5 min para la obtencion del suero en la Estacion Pucallpa del Centro de Investigacion IVITA. Los sueros resultantes fueron transportados al laboratorio de virologia de la Facultad de Medicina Veterinaria (FMV) de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM) en Lima y conservados en congelacion a -20[grados]C hasta su analisis.

En una segunda etapa se realizo la captura de 1143 Culicoides spp en las granjas positivas a VLA, de los cuales 1000 fueron hembras y 43 fueron machos. Los machos fueron descartados del estudio pues las hembras sonn las vectores. La captura se hizo siguiendo la metodologia utilizada por Navarro et al. (2018). Ademas, se tomaron muestras de sangre adicionales de ovinos seropositivos (n=15) de la vena yugular o cefalica utilizando tubos al vacio con anticoagulante EDTA. Los mosquitos capturados se identificaron con el apoyo de la Seccion de Entomologia del Instituto de Medicina Tropical Daniel Alcides Carrion de la Facultad de Medicina de la UNMSM y el Instituto de Ecologia (INECOL) de Xalapa, Veracruz (Mexico). Las hembras fueron agrupadas en pools (100 especimenes por pool). En total se tuvieron 10 pools de C. insignis y 1 pool de Culicoides spp. Tanto los pools de mosquitos Culicoides como la sangre entera de los ovinos fueron conservados en nitrogeno liquido (-196[grados]C).

Deteccion de Anticuerpos

Para la deteccion de anticuerpos contra el grupo Orbivirus (virus de Lengua azul y virus de la Enfermedad Hemorragica Epizootica [VEHE]) se utilizo la prueba de inmunodifusion en gel agar (IDGA) (VMRD, EEUU). Asi mismo, los sueros fueron analizados por la prueba de ELISA de competicion, basada en un anticuerpo monoclonal competitivo, el cual es especifico para distinguir anticuerpos contra VLA (VMRD, EEUU). El desarrollo de ambas pruebas fue siguiendo las especificaciones del fabricante.

ARN Total de las Muestras

Los pools de Culicoides fueron machacados en un mortero con nitrogeno liquido y fueron homogenizados con 1.5 ml de PBS (pH 7.4). El machacado fue centrifugado a 2000 g por 10 min a 4[grados]C. El sobrenadante fue filtrado en membrana de nitrocelulosa con diametro de poro de 0.22 [micron]m. La suspension obtenida y la sangre de ovino fueron utilizadas para la extraccion de ARN total empleando el kit comercial Norgen's Total RNA Purification (Cod. 37500, Norgen, Canada).

Sintesis de ADN Complementario (ADNc)

El ARN extraido fue utilizado como molde para la sintesis de ADN complementario (ADNc) empleando el kit comercial GoScript[TM] Reverse Transcription System (Promega, EEUU) y el cebador antisentido BTV-S7-1.R (Cuadro 1). Previamente se desnaturo 5 [micron]l del ARN extraido a 97[grados]C por 5 min, y luego fue mantenido a 4[grados]C por 5 min para anadirle 5 [micron]l de la mezcla de reaccion para la transcripcion reversa, segun se indica en el Cuadro 3. El protocolo de retrotrascripcion fue 25[grados]C por 5 min, 42[grados]C durante 45 min y luego 4[grados]C por 5 min.

PCR y PCR Anidado

Las pruebas de PCR y PCR anidado fueron realizadas empleando el kit comercial GoTaq[R] Colorless (Promega, EEUU) y los cebadores especificos para amplificar la secuencia del segmento 7 de VLA, donde el primer par de cebadores amplifican un producto de 1156 pb y el segundo par de 1070 pb (Cuadro 1).

Para la primera PCR, la elaboracion de la mezcla de reaccion siguio las instrucciones del fabricante con 0.8 [micron]M de cada cebador BTV-S7-1F y BTV-S7-1R (Cuadro 1). Las condiciones para la amplificacion de los cebadores fueron 95[grados]C durante 5 min como desnaturacion inicial, seguido de 40 ciclos de 95[grados]C durante 40[grados] s, 44[grados]C durante 1 min, 72[grados]C por 2 min y una extension final de 72[grados]C por 10 min.

Para el PCR anidado se siguieron igualmente las instrucciones del fabricante, con 0.8 [micron]M del segundo par de cebadores BTV-S7-2F y BTV-S7-2R (Cuadro 1). Se utilizo 5 [micron]l del ADN amplificado de la primera PCR en diferentes diluciones. Las condiciones para la amplificacion de los cebadores fueron 95[grados]C durante 5 min como desnaturacion inicial, seguido de 40 ciclos de 95[grados]C durante 40[grados] s, 54[grados]C durante 1 min, 72[grados]C por 2 min, y una extension final de 72[grados]C por 10 min.

Todos los productos de PCR fueron sometidos a electroforesis en gel de agarosa (1.5% de agarosa en 0.5X TBE) por 1 h y tenidos con bromuro de etidio para su visualizacion por irradiacion UV.

RESULTADOS

Analisis Serologico

El 50% (23/46) de las muestras de suero de ovino presentaron anticuerpos contra VLA o VEHE (Cuadro 3), mediante la prueba de IDGA. Las muestras positivas y debiles positivas por IDGA fueron analizadas por el ELISA de competicion, resultando que el 96% (22/23) presentaron anticuerpos contra VLA (Cuadro 4).

En el presente estudio no se incluyen los resultados del analisis del secuenciamiento del segmento 7 y del segmento 2 del ARN del VLA detectado en el pool de C. insignis y en la sangre del ovino de la misma area para conocer la relacion molecular del viral en ambas especies y conocer el serotipo presente.

Deteccion del Segmento 7 del VLA

En solo uno de los 11 pooles de Culicoides spp y en una de las 15 muestras de sangre de ovino se observo la banda de 1070 pb que corresponde al segmento 7 de VLA (Figura 1).

DISCUSION

El ecosistema, asi como la presencia de ovinos, caballos y aves de corral en el lugar de estudio fueron condiciones favorables para la presencia y actividad de los mosquitos del genero Culicoides (Mellor et al., 2000; Purse et al., 2015). Al examen clinico, los ovinos de las granjas no presentaron lesiones en los epitelios de la boca ni en los bordes coronarios de las patas. Por otro lado, las granjas se caracterizaron por la presencia de humedales, charcos, arbustos y heces en descomposicion; caracteristicas que representan las diferentes zonas de descanso y reproduccion de mosquitos (Purse et al., 2015).

El 50% de los ovinos presentaron anticuerpos contra el grupo Orbivirus detectado por la prueba de IDGA, y de estos, el 96% correspondio a anticuerpos contra VLA determinado por ELISAc, ya que solo una muestra positiva al serogrupo Orbivirus fue negativa a anticuerpos contra el VLA (Cuadros 3 y 4). La prueba de ELISAc posee 99% de especificidad y 100% de sensiblidad en la deteccion del VLA, ya que interviene un anticuerpo monoclonal que detecta un epitopo especifico en la proteina VP7 del VLA (Reddington et al., 1991; VMRD, 2005), a diferencia de la prueba de IDGA. La muestra de suero del animal seropositivo por IDGA, pero negativo a ELISAc, podria tratarse de una reaccion cruzada entre VEHE y VLA.

En America del Sur, anticuerpos contra el VLA han sido detectados en ovinos de Ecuador (8%), Venezuela (94.7%) y Argentina (95%), en bovinos de Colombia (51. 8%), y en bufalos (25.9-93%) y pecaries (39%) de Brasil (Lager, 2004). Cabe mencionar que algunos de estos resultados serologicos han sido realizados mediante la prueba de IDGA, por lo que es dificil afirmar que los anticuerpos detectados sean inducidos por VLA, ya que existen evidencias de la presencia del VEHE en la region sudamericana (Homan et al., 1985; Verdezoto et al., 2018). No obstante, estos estudios demuestran la amplia distribucion del VLA, asi como, uno o mas vectores competentes de su transmision en el continente sudamericano (Meiswinkel et al., 2004; Darpel et al., 2011). El desarrollo de los signos clinicos de la enfermedad depende si la infeccion es endemica o no. La infeccion es endemica en el tropico y subtropico por las constantes infecciones y reinfecciones por el virus de uno u otro serotipo y, como consecuencia, los animales presentan anticuerpos, pero rara vez presentan signos clinicos (MacLachlan, 2004; Caporale et al., 2014).

Navarro et al. (2018), en un estudio previo, capturaron 7930 mosquitos, de los cuales el 94.8% fueron identificados como Culicoides insignis, indicando la abundancia de esta especie de mosquitos en el area de estudio. Resultados similares fueron reportados en el noreste de Brasil (98%) (Silva y Carvalho, 2013), 86% en la amazonia brasilena (Carvalho et al., 2017) y 91.8% en Coratei-Paraguay (Ronderos et al., 2003), entre otros, lo cual indica que C. insignis es una especie de amplia distribucion en la region (Lager, 2004) y, que al parecer, esta presente en toda la amazonia peruana (Felippe-Bauer et al., 2008). C. insignis es tambien la especie involucrada en la transmision del VLA en el sureste de los EEUU, el Caribe, y en America Central y del Sur (MacLachlan et al., 2007), de alli que estos mosquitos podrian ampliar su rango de distribucion altitudinal debido al cambio climatico (Lorca-Oro et al., 2014), yendo hacia zonas de mayor altitud, constituyendo un riesgo para el desarrollo de la ganaderia andina en general.

La deteccion de una banda de 1070 pb correspondiente al segmento 7 que codifica la proteina estructural interna VP7 del VLA detectado en un pool (1/1000) (0.1%) de C. insignis y en una muestra (1/15) (6.6%) de sangre de ovinos (Figura 1) indican que C. insignis es al menos uno de los potenciales vectores de VLA y que los anticuerpos detectados en los ovinos de las granjas en estudio fueron inducidos por la VP7 que es la proteina interna (core) mas abundante, inmunogenica y conservada entre los 27 serotipos existentes del virus (Bouet-Cararo et al., 2014). La presencia de la banda correspondiente al segmento 7 en muestras de C. insignis, a diferencia del pool de Culicoides spp, indica que este mosquito podria ser uno de los principales vectores en Peru, como lo es en otros paises de America del Sur y del Caribe (Lager, 2004; Meiswinkel et al., 2007).

La deteccion de la banda del segmento 7 del ARN viral en un pool de C. insignis y en una muestra de sangre de ovino podria deberse a un bajo indice de infeccion de VLA en estos mosquitos durante la epoca del muestreo, como lo indica Gerry et al. (2001). Sin embargo, en estudios de infeccion experimentales en C. insignis con dos serotipos distintos se demostro que la tasa de infeccion con el serotipo 2 fue entre 45 y 62% y con el serotipo 11 entre 20 y 60% (Tanya et al., 1992). Otro estudio similar a nivel de campo con C. sonorensis, otro vector en America del Norte, America Central y en la region del Caribe, se encontro que el indice de infeccion del serotipo 10 fue de 0.4% en un periodo de tres anos con variaciones en un lapso de cuatro semanas de 0 a 2.2%, en zonas donde la enfermedad de Lengua azul es mayormente de tipo subclinico (Gerry et al., 2001), situacion muy similar al Peru, donde existen animales seropositivos, pero sin enfermedad clinica.

Tabachnick (2013) lista varios posibles efectos del clima sobre los vectores y sus posibles influencias sobre la transmision de enfermedades. Es asi que el incremento de la temperatura influye directamente sobre la capacidad vectorial, incluso la ubicacion y tipo de trampas de captura (McDermott et al. 2015). Un ejemplo es C. brevitarsis, el cual posee baja competencia vectorial; es decir, que la habilidad del vector para soportar la replicacion viral es baja; sin embargo, debido a que posee un alto indice de picadura por dia es un importante vector de VLA en Australia. En contraste, C. fulvus cuya competencia es mayor, pero posee una capacidad vectorial baja, sobre todo debido a su baja abundancia y distribucion geografica, lo cual disminuye su potencial de transmision (Mullens et al., 2015).

La deteccion del segmento 7 del VLA en una muestra de ovino de apariencia normal indica que el animal estuvo viremico al momento del muestreo. El periodo de viremia en el ovino raramente persiste por mas de 14 dias, a diferencia del bovino cuyo estado de viremia puede ser de 90-120 dias (Alvarez et al., 2017). En Brasil, con un ecosistema similar a la amazonia peruana, han ocurrido brotes de la enfermedad clinica de Lengua azul en ovinos de Parana y de Rio de Janeiro, con signos clinicos de letargia, hipermotilidad intestinal, pirexia, edema facial e hiperemia, pequenas ulceraciones en la lengua y laminitis (Clavijo et al., 2002; Alvarez et al., 2014). Asimismo, cervidos neotropicales en cautiverio han manifestado la enfermedad de Lengua azul en Brasil (Kawanami, 2016).

La enfermedad de Lengua azul es conocida hace mas de 100 anos, cuando afecto a ovinos Merinos introducidos a Sudafrica. Su distribucion es global desde la mitad del siglo 20 con excepcion de la Antartida. Su amplia distribucion e impacto en la ganaderia justifico para ser incluida en la Lista de Enfermedades de Declaracion Obligatoria a la OIE (Maclachlan, 2010). En el Peru no hay reportes de seroprevalencia del VLA en los diversos ecosistemas fuera de las zonas tropicales, como los valles internadinos y andinos donde se desarrolla la ganaderia ovina, bovina y de camelidos, y menos aun reportes de ocurrencia clinica de la enfermedad de Lengua azul.

El Peru puede ser uno de los paises con mayores riesgos para la emergencia de enfermedades transmitidos por mosquitos ya que posee diversos ecosistemas propicios para el desarrollo de Culicoides, los cuales podrian encontrar una poblacion de ovinos u otros rumiantes susceptibles a VLA. Ante el inminente cambio climatico se considera necesario la determinacion de la seroprevalencia de VLA en zonas ganaderas, identificar los diversos serotipos presentes en el pais, levantar un mapa de la ubicacion de las diversas especies de Culicoides spp, etc., con el fin de conocer la epidemiologia y establecer la vigilancia sanitaria no solo de VLA, sino tambien de otras enfermedades emergentes transmitidas por mosquitos.

CONCLUSION

Se determino la presencia del seg 7 del virus Lengua azul en un pool (1/10) de hembras Culicoides insignis y en una muestra de sangre (1/15) de ovino seropositivo de granjas de crianza extensiva de Pucallpa, Ucayali.

http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v30i1.15690

Agradecimiento

Los autores agradecen al Blgo. Mg. Abraham Caceres por sus valiosas opiniones y aportes sobre la identificacion de los Culicoides spp capturados en Pucallpa, Ucayali. Asi mismo, los autores agradecen al MV Mg. Juan Rondon Espinoza por su apoyo en los trabajos de campo.

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(31.) Ratinier M, Caporale M, Golder M, Franzoni G, Allan K, Nunes SF, Armezzani A, et al. 2011. Identification and characterization of a novel nonstructural protein of Bluetongue virus. Plos Pathog 7: e1002477. doi: 10.1371/ journal.ppat.1002477

(32.) Reddington JJ, Reddington GM, MacLachlan NJ. 1991. A competetive ELISA for detecction of antibodies to the group antigen of Bluetongue virus. J Vet Diagn Invest 3: 144-147. doi: 10.1177/ 104063879100300207

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(34.) Rivera H, Cardenas L, Ramirez M, Manchego A, More J, Zuniga A, Romero M. 2013. Infeccion por orbivirus en huanganas (Tayassu pecari) de Madre de Dios. Rev Inv Vet Peru 24: 544550. doi: 10.15381/rivep.v24i4.2738

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(38.) Silva FS, Carvalho LPC. 2013. A population study of the Culicoides biting midges (Diptera: Ceratopogonidae) in urban, rural, and forested sites in a cerrado area of northeastern Brazil. Ann Entomol Soc Am 106: 463-470. doi: 10.1603/AN12047

(39.) Tabachnick WJ. 1996. Culicoides variipennis and Bluetongue-virus epidemiology in the United States. Annu Rev Entomol 41: 23-43. doi: 10.1146/ annurev.en.41.010196.000323

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(42.) Verdezoto J, Breard E, Viarouge C, Quenault H, Lucas P, Sailleau C, Zientera S, et al. 2018. Novel serotype of Bluetongue virus in South America and first report of epizootic haemorrhagic disease virus in Ecuador. Transbound Emerg Dis 65: 244-247. doi: 10.1111/ tbed.12625

(43.) Wilson AJ, Mellor PS. 2009. Bluetongue in Europe: past, present and future. Philos TR R Soc B 364: 26692681. doi: 10.1098/rstb.2009.0091

Dennis Navarro M. [1], Miguel Rojas M. [1], Jessica Jurado P. [1], Alberto Manchego S. [1], Mercy Ramirez V. [1], Ana Castillo E. [1], Hermelinda Rivera G. [1, 3]

[1] Laboratorio de Microbiologia y Parasitologia Veterinaria, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Peru

[2] Estacion Experimental del Centro de Investigacion IVITA, Pucallpa, Ucayali, Peru

[3] E-mail: hriverag@unmsm.edu.pe

Recibido: 6 de junio de 2018

Aceptado para publicacion: 2 de noviembre de 2018

Leyenda: Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa a 1.5% de productos de PCR anidado con cebadores especificos que amplifican el seg 7 de VLA. Donde: L: Marcador de peso molecular 2000--50 pb; 1: control positivo de VLA; 2, 3, 5, 6: blanco; 4: muestra de sangre de ovino; 7: pool de Culicoides insignis
Cuadro 1. Secuencia de nucleotidos de los cebadores utilizados para el
PCR anidado para la deteccion del segmento 7 del virus de Lengua azul
(VLA)

Identificacion      Longitud          Secuencia (5'-3')
del oligo           (pb (1))

BTV-S7-1F              22        GTT AAA AAT CTA TAG AGA TGG A
BTV-S7-1R              23        GTA AGT GTA ATY TMA GAG ACG TT

BTV-S7-2F              21         AGA GAT GGA CAC TAT CGC WGC
BTV-S7-2R              19          ACC CGT GCA AAG TGG ACT A

Identificacion      Amplicon        Fuente
del oligo             (pb)

BTV-S7-1F             1156      Modificado de
BTV-S7-1R                        Shaw et al.
                                    (2007)
BTV-S7-2F             1070         En este
BTV-S7-2R                          estudio

(1) Pares de bases

Cuadro 2. Mezcla de reaccion para la transcripcion reversa
(GoScript[TM] Reverse Transcription System)

Componente                              Por muestra     Concentracion
                                        ([micron]l)         final

Agua libre de nucleasas                     0.8               --
GoScript[TM] 5X Reaction Buffer             2.0               1X
MgCl2 25 mM                                 1.2             3.0 mM
PCR Nucleotide Mix 10 mM                    0.5             0.5 mM
GoScript[TM] Reverse Transcriptase             0.2               --
Primer reverso BTV-S7-1.R (20               0.4         0.8 [micron]M
   [micron]M)
Volumen de la mezcla por muestra            5.1               --

Cuadro 3. Frecuencia de ovinos
seropositivos al virus de Lengua azul
mediante inmunodifusion en gel de agar
(IDGA) (Pucallpa, Peru)

Granja                Ovinos               Positivos
                        (n)
                                        n            %

1                       15              7           46.7
2                       16              13          81.3
3                       15              3           20.0
Total                   46              23          50.0

Cuadro 4. Frecuencia de ovinos
seropositivos al virus de Lengua azul
mediante ELISA competitiva (ELISAc)
(Pucallpa, Peru)

Granja                Ovinos               Positivos
                        (n)
                                        n            %

1                        7              6           85.7
2                       13              13          100
3                        3              3           100
Total                   23              22          96.0
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Author:Navarro M., Dennis; Rojas M., Miguel; Jurado P., Jessica; Manchego S., Alberto; Ramirez V., Mercy; C
Publication:Revista de Investigaciones Veterinarias del Peru (RIVEP)
Date:Jan 1, 2019
Words:5461
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