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Deteccion especifica de Arcobacter butzleri en carne de pollo mediante una tecnica de PCR.

Introduccion

El creciente aumento en el numero de aislamientos de Arcobacter spp. procedentes de alimentos de origen animal, agua y heces de individuos con gastroenteritis, ha potenciado la importancia de estos microorganismos como posibles agentes patogenos de transmision al hombre por via alimentaria (Vandenberg et.al, 2004). La mayoria de los aislamientos corresponden a A. butzleri, seguidos de A. cryaerophilus, A. skirrowii, y la recientemente descrita especie A. cibarius (Wesley, 1996; Ho et.al. 2006; Houf y Stephan, 2007).

La identificacion de Arcobacter spp. por metodos convencionales se encuentra limitada debido a los exigentes requerimientos nutritivos de estas bacterias y a su baja actividad metabolica. Ademas, debido a que los arcobacters comparten numerosas caracteristicas morfologicas y bioquimicas con especies del genero filogeneticamente proximo Campylobacter, es frecuente que se produzca una identificacion erronea de las cepas de Arcobacter y, por tanto, una subestimacion de su incidencia real en los alimentos. (Prouzet-Mauleon et.al. 2006).

Las tecnicas de de analisis del ADN y, concretamente, las basadas en la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), son herramientas cada vez mas extendidas en el analisis microbiologico de los alimentos (Hill, 1996) ya que ofrecen una enorme rapidez, sensibilidad y especificidad. Por ello, el objetivo de este trabajo de investigacion ha consistido en el desarrollo de una tecnica de PCR para la deteccion e identificacion de Arcobacter butzleri en carne fresca de pollo, empleando cebadores especificos de especie disenados en un fragmento del gen 16S ARN ribosomico.

Material y metodos

En este trabajo se disenaron los cebadores Arcobutz-FW y Arcobutz-RV para la amplificacion de un fragmento especifico de 195 pb en el gen 16S ARNr de A. butzleri (Arcobutz-FW: 5'-AGTTGTTGTGAGGCTCCAC-3; Arcobutz-RV: 5' GCAGACACTAATCTATCTCTA-3'). Ademas, se empleo como control positivo de amplificacion la pareja de cebadores Bact-FW/Bact-RV, disenados para amplificar en bacterias un fragmento conservado de 290 pb en este mismo gen (Bact-FW: 5' CAGCAGCCGCGGTAATA-3; Bact-RV: 5'-TGGACTACCAGGGTATCTAA-3).

En primer lugar, se determino la sensibilidad de la tecnica de PCR para detectar A. butzleri en carne fresca de pollo inoculada con concentraciones de [10.sup.4], [10.sup.3], [10.sup.2] y 10 ufc/g de A. butzleri. La extraccion del ADN de las muestras de pollo se realizo empleando el kit Wizard DNA clean-up system (Promega). Las reacciones de amplificacion por PCR se realizaron en un volumen total de 25 [micron]l, con 15 pm de cada cebador y 2 ml de ADN. La PCR se llevo a cabo en un termociclador (Tecnne Ltd. Cambridge, Reino Unido), programado para realizar una desnaturalizacion inicial de 94[grados]C durante 3 min, seguida de 40 (Arcobutz-FW y Arcobutz-RV) o 20 (Bact-FW/Bact-RV) ciclos que comprendian las siguientes etapas: 94[grados]C, 1 min para desnaturalizar; 55[grados]C, 1 min para permitir la union de los cebadores y 72[grados]C, 1 min para extender la cadena de ADN. La ultima extension se prolongo durante 7 min. Los fragmentos resultantes se separaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1.5%.

La tecnica de PCR desarrollada se aplico al analisis de 42 muestras comerciales de carne fresca de pollo (alitas, muslos y pechugas, incluyendo piel) adquiridas en diversos comercios minoristas. Una vez homogeneizadas en AB (Arcobacter Broth, Oxoid), las muestras se analizaron directamente, y tras someterse a un pre-enriquecimiento selectivo en caldo AB suplementado con CAT (Cefoperazona-Anfotericina-Teicoplanina, Oxoid) durante 18 h a 30[grados]C en microaerobiosis. Paralelamente, se efectuo el aislamiento y enumeracion de A. butzleri a partir de las muestras mediante la incubacion aerobica de las mismas, antes y despues del enriquecimiento, en placas de agar selectivo CIN/CAT modificado (CefsulodinaIrgasan-Novobiocina + CAT, Oxoid), durante 2-3 dias a 30[grados]C.

Resultados

Los resultados obtenidos en la tecnica de PCR descrita demostraron una adecuada especificidad de los cebadores Arcobutz-FW/Arcobutz-RV, ya que amplificaron el fragmento esperado de 195 pb en A. butzleri sin producir senal de amplificacion en otras especies de Arcobacter, Campylobacter y Helicobacter, ni en otros microorganismos presentes en los alimentos. Los cebadores Bact-FW/Bact-RV amplificaron el ADN (290 pb) de todas las bacterias incluidas en el analisis, confirmando su utilidad como control positivo de amplificacion (Tabla 1)

Tras determinar la funcionalidad y especificidad de la tecnica de PCR, se determino su sensibilidad para detectar A. butzleri en muestras de referencia de carne fresca de pollo inoculadas experimentalmente con distintas concentraciones de esta bacteria comprendidas entre [10.sup.4] y 10 ufc/g. El limite de deteccion conseguido fue de aproximadamente [10.sup.3] ufc/g (Figura 1).

[FIGURA 1 OMITIR]

La tecnica de PCR desarrollada tambien se utilizo para determinar la presencia de A. butzleri en muestras comerciales de carne fresca de pollo. Dado que el numero de arcobacters que suelen encontrarse en la carne es generalmente bajo (Corry y Atabay, 2001), para conseguir niveles detectables de A. butzleri en las muestras comerciales fue necesario realizar un pre-enriquecimiento de las mismas en un medio liquido selectivo durante 18h a 30[grados]C en condiciones de microaerobiosis. Bajo las condiciones descritas, la tecnica de PCR detecto presencia de A. butzleri en un 85,7% (36 de 42) de las muestras de pollo analizadas. Se consiguio una total concordancia entre los resultados de la deteccion por PCR y por el metodo convencional de siembra en placas de agar selectivo.

Conclusiones

La tecnica de PCR desarrollada en el gen mitocondrial 16S ARNr ha permitido la deteccion especifica de Arcobacter butzleri en un elevado numero de muestras comerciales de carne de pollo. El empleo de esta tecnica podria ser de gran utilidad para determinar de forma rapida la prevalencia de este patogeno emergente en los productos carnicos comercializados y, en consecuencia, contribuir a que las industrias consideren la importancia de su control dentro de los sistemas de gestion de la seguridad alimentaria.

Agradecimientos

Este trabajo ha sido financiado por la Direccion General de Universidades de la Comunidad de Madrid (Programa de Vigilancia Sanitaria 0505/AGR/000265) y por la Universidad Complutense de Madrid (Proyecto Santander-Complutense PR34/07-15902).

Bibligrafia

--Corry, JEL y Atabay HI. . 2001. Poultry as a source of Campylobacter and related organisms. J. Appl. Microbiol., 90: 96S-114S.

--Hill, WE. The polymerase chain reaction: applications for the detection of foodborne pathogens. 1996. Crit. Rev. Food. Sci. Nut. 36:123-173.

--Ho, TKH, Lipman LJA y Gaastra W. 2006. Arcobater, what is known and unknown about a potential foodborne zoonotic agent!. Vet. Microbiol., 115:1-13.

--Houf, K y Stephan R. 2007. Isolation and characterization of the emerging foodborne pathogen Arcobacter from human stools. J. Microbiol. Methods, 68: 408-413.

--Prouzet-Mauleon, V, Labadi L, Bouges N, Menard A. y Megraud F. 2006. Arcobacter butzleri: Underestimated enteropathogen. Emerg. Infect. Dis., 12: 307--309.

--Vandenberg, O, Dediste A, Houf K, Ibekwem S, Souayah, H, Cadranel, S, Douat, N, Zissis G, Butzler JP y Vandamme, P. 2004. Arcobacter species in humans. Emerg. Infect. Dis., 10:1863-1867.

--Wesley, IV. Helicobacter and Arcobacter species: risks for foods and beverages. 1996. J. Food Prot., 59:1127-1132.

D. Pentimalli (2), R. Martin de Santos (1) e I. Gonzalez Alonso (1)

(1) Departamento de Nutricion, Bromatologia y Tecnologia de los Alimentos. Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid; (2) Dpto. di Sanita Pubblica. Facolta di Agraria. Universita degli studi di Parma, Italia
Tabla 1: Especificidad de la tecnica de PCR desarrollada para la
deteccion de Arcobacter butzleri. Se muestran los resultados de la
amplificacion del gen 16S ARNr con los cebadores de A. butzleri
(Arcobutz-FW/RV) y con el control positivo de bacterias
(BactFW/Bact-RV), al analizar cultivos puros de varias cepas
bacterianas

                                    Arcobutz-FW/ RV   Bact-FW/ RV
Cepa bacteriana                     (195 pb)          (290pb)

Arcobacter butzleri LMG 9910        +                 +
Arcobacter butzleri LMG 10828       +                 +
Arcobacter cryaerophilus LMG 7537   -                 +
Arcobacter cryaerophilus LMG 9863   -                 +
Arcobacter skirrowii LMG 8538       -                 +
Arcobacter skirrowii LMG 6621       -                 +
Arcobacter cibarius CECT 7203       -                 +
Arcobacter cibarius LMG 21996       -                 +
Arcobacter cibarius LMG 21997       -                 +
Campylobacter coli                  -                 +
  (aislamiento clinico)
Campylobacter jeuni                 -                 +
  (aislamiento clinico)
Campylobacter jejuni LMG 8841       -                 +
Campylobacter fetus LMG 6442        -                 +
Campylobacter lari LMG 8845         -                 +
Helicobacter pullorum LMG 16318     -                 +
Helicobacter pylori LMG 18041       -                 +
Escherichia coli CECT 515           -                 +
Listeria innocua CIP 103575         -                 +
Yersinia enterocolitica CECT 559    -                 +
Salmonella enteritidis CECT 4300    -                 +
Pseudomonas fluorescens B52         -                 +

LMG: Lab. Voor Microbiologie, Gent (Belgium); CECT: Coleccion
Espanola de Cultivos Tipo, Valencia

(Espana); CIP: Coleccion del Instituto Pasteur, Paris (Francia)
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Author:Pentimalli, D.; Martin de Santos, R.; Gonzalez Alonso, I.
Publication:Revista Complutense de Ciencias Veterinarias
Article Type:Report
Date:Jul 1, 2008
Words:1459
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