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Deteccion del virus del amarillamiento de las nervaduras de la hoja de la papa en diferentes organos de Solanum tuberosum grupo Phureja cv Criolla Colombia utilizando RT-PCR convencional y en tiempo real.

Potato yellow vein virus detection in different organs of Solanum tuberosum Phureja group cv Criolla Colombia by conventional and real time qRT-PCR

Introduccion

PYVV es un virus re-emergente con genoma tripartita ARNss+ con un tamano de aproximadamente 17kb (Livieratos et al., 2004). Sus particulas virales son de morfologia filamentosa que se limitan al floema (Salazar et al., 2000). Pertenece a la familia Closteroviridae, genero Crinivirus (Martelli et al., 2011). PYVV es el agente causal de la enfermedad del amarillamiento de las nervaduras de la papa (Potato Yellow Yein Disease, PYVD) (Salazar et al., 2000) y se transmite por medio de la mosca blanca Trialeurodes vaporariorum, Westwood (Hemiptera: Aleyrodidae), de forma semipersistente, tambien presenta transmision vegetativa por medio del tuberculo-semilla (Salazar et al., 2000).

PYVD fue reportada por primera vez en Colombia por Alba (1950) en Antioquia. Actualmente, se ha dispersado a paises vecinos como Venezuela, Ecuador y Peru debido al incremento de las poblaciones del vector y del transporte indiscriminado de germoplasma (Salazar et al., 2000). PYVV afecta la produccion de papa hasta un 50% en Solanum tuberosum grupo Andigena cv Diacol Capiro (Salazar et al., 2000) y mas de 25% en S. tuberosum grupo Phureja cv Criolla Colombia (papa criolla) (Guzman et al., 2012), razon por la que ha sido declarado como patogeno cuarentenario en Europa y Estados Unidos (European and Mediterranean Plant Protection Organization, 1979; United States Department of Agriculture--Animal and Plant Helath Inspection Service, 2000).

La deteccion de PYVV se ha realizado en muestras de foliolo mediante NASH (Nucleic Acid Spot Hybridization) (Salazar et al., 2000), RT-PCR (Offei et al., 2004; Guzman et al., 2006-2012; Guzman y Rodriguez 2010; Wei et al., 2009), y en brotes de tuberculo mediante RT-PCR) y qRT-PCR (Lopez et al., 2006). A diferencia de otras tecnicas, qRT-PCR tiene alta sensibilidad, especificidad, reproducibilidad, no requiere de un procesamiento post-PCR para la visualizacion de los resultados; adicionalmente, permite hacer una estimacion precisa del numero de copias de un gen viral presente en el tejido analizado. Es util en diferentes estudios sobre biologia de virus, asociacion entre la intensidad de sintomas, acumulacion viral, evaluacion de resistencia, evaluacion de la carga viral en la transmisibilidad del virus por el vector y eficiencia de replicacion, entre otros. (Bustin, 2002; Heid et al., 1996; Mackay et al., 2002).

Hay poca informacion de la distribucion de virus en plantas de papa infectadas, varios autores han demostrado que algunos virus se distribuyen en la planta de manera heterogenea (Leisner et al., 1992; Singh y Singh, 1996 y 1998; Gosalves et al., 2003; Fox et al., 2005; Sanchez-Navarro et al., 2007; Kogovsek et al., 2011); Kogovsek et al (2011) hacen uso de la tecnica de qRT-PCR para analizar el titulo viral del Potato virus Y (PVY, Potyviridae) en diferentes organos de plantas de Solanum tuberosum infectadas con el virus, reportando que el PVY presenta mayores titulos virales en tallos y foliolos sintomaticos, en foliolos no sintomaticos y tuberculos hay menores titulos virales, lo que demuestra que su distribucion es heterogenea. Para PYVV se ha sugerido una distribucion heterogenea del virus dentro del tuberculo (Lopez et al., 2006).

Los ensayos de deteccion de PYVV se han limitado a material foliar y a brotes de tuberculo, pero no se han analizado otros organos. Teniendo en cuenta que PYVV se limita al floema de la planta, el objetivo del trabajo fue analizar la distribucion y acumulacion del virus mediante RT-PCR y qRT-PCR, en diferentes organos de plantas de papa criolla sintomaticas y NS infectadas con el virus, por transmision a traves del vector natural. Los resultados aportan al conocimiento sobre la distribucion y deteccion del PYVV en papa criolla y son utiles en programas de fitomejoramiento, procesos de indexacion de plantas de papa, programas de cuarentena y de certificacion de semillas de papa.

Materiales y metodos

Material vegetal y aislados virales

Se tomaron dos plantas de S. tuberosum grupo Phureja cv Criolla Colombia, provenientes del municipio de Chipaque (Cundinamarca) con una edad aproximada de dos meses que expresaban diferentes niveles de amarillamiento intervenal: una de sintomatologia moderada (M) y otra de sintomatologia severa (S). Estas fueron mantenidas en matera utilizando como sustrato una mezcla de tierra : cascarilla de arroz en relacion (3:1). Estas plantas se denominaron plantas donadoras de PYVV.

Adicionalmente, se utilizaron plantas de S. tuberosum grupo Phureja Clon 1 obtenidas a partir de cultivo de meristemos in vitro adquiridas en el Laboratorio de cultivo de tejidos y de biologia molecular de plantas del IBUN. Estas plantas se denominaron plantas receptoras de PYVV.

Transmision de PYVV con vector natural T. vaporariorum

Los ensayos de transmision se realizaron en el invernadero (no controlado) de la Facultad de Agronomia de la Universidad Nacional de Colombia en jaulas entomologicas selladas con malla anti-afido (velo suizo que se utiliza de rutina como malla aislante de vectores). Las temperaturas ambientales fluctuaron entre 5 y 27[grados]C.

Se establecio una cria de T. vaporariorum en plantas de calabacin (Cucurbita pepo). Aproximadamente 200 adultos aviruliferos de T. vaporariorum (confirmados previamente como negativos para PYVV por RT-PCR del gen CP) fueron liberados en una jaula entomologica que contenia dos plantas madres donadoras de PYVV (S o M), confirmadas previamente por RT-PCR como positivas para el gen CP de PYVV. Aunque la mosca blanca transmite al virus de una manera semipersistente, es decir en pocos minutos u horas, en el presente estudio, las moscas blancas se mantuvieron en jaula entomologica durante un periodo de 48 horas para garantizar que se alimentaran del material infectado con PYVV y poder obtener individuos viruliferos (confirmados por RT-PCR).

Se liberaron 50 adultos viruliferos de T. vaporariorum en la jaula con un tamano aproximado de 1m x 1m, donde se mantenian 1 2 plantas receptoras (confirmadas como negativas por RT-PCR para el gen CP de PYVV), y se dejaron por un periodo de 48 horas para garantizar el proceso de alimentacion en la planta donadora y de la transmision a las plantas receptoras.

Posteriormente, se utilizo el insecticida Karate[R] 1.5 cc/L para eliminar la mosca blanca de la jaula entomologica donde se mantenian las plantas receptoras. Estas se mantuvieron en jaulas entomologicas en el invernadero de la facultad de Agronomia UN, y se les realizo un seguimiento de expresion de sintomas, desde la aparicion de amarillamiento de nervaduras secundarias en el apice de las hojas. Ademas, se realizo un seguimiento a la infeccion del virus mediante la deteccion del gen CP de PYVV por RT-PCR.

Para evaluar la acumulacion del virus en diferentes organos se seleccionaron tres plantas receptoras cuando completaron 4 meses de edad, las cuales fueron positivas para CP-PYVV mediante RT-PCR, una planta no sintomatica (NS), una con expresion moderada (M) de sintomas y una con expresion severa (S). Se realizo un muestreo aleatorio de diferentes organos de cada planta tomando foliolo, peciolo, tallo aereo y subterraneo, raiz, pedunculo floral, petalo, antera (tabla 1).

Deteccion de PYVV por RT-PCR convencional y en tiempo real

La extraccion ARN se realizo de material foliar de las plantas donadoras y receptoras para confirmar la presencia/ausencia de PYVV por RT-PCR y de los diferentes organos de las plantas infectadas descritas en la tabla 1, para lo cual se utilizo el reactivo Trizol[R] (Invitrogen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Todos los extractos fueron tratados con 20 U de DNasa I durante 15min a 37[grados]C para descartar la contaminacion con DNA.

El gen CP de PYVV se amplifico a partir de los extractos de ARN de los diferentes organos de las plantas analizadas, utilizando RT-PCR convencional y en tiempo real con los iniciadores y sondas TaqMan[R] descritos en la tabla 2.

Retrotranscripcion

La sintesis de cDNA se llevo a cabo en un volumen final de 10 [micron]l adicionando una mezcla de 1X buffer de reaccion (Epicentre), 1mM de dNTPs (Bioline), 10mM de DTT (Epicentre), 0.4 [micron]M de primer 3' (tabla 2), 1.6U de RNase inhibitor (Fermentas), 8U de MMLV HP (Epicentre) y 100ng de ARN. Se incubo durante una hora a 42[grados]C seguida de una denaturacion a 70[grados]C por 10min. El cDNA se repartio en dos fracciones: una para RTPCR convencional y otra para la reaccion de qRT-PCR.

PCR

Las reacciones de PCR contenian 1.6 [micron]l de cDNA, 1X de buffer N[H.sub.4] (Bioline), 2.5mM de Mg[Cl.sup.2] (Bioline), 0.4 pM de dNTPs (Bioline), 0.4 [micron]M de cada primer (F2/3') (tabla 2) y 1U de Biolasa (Bioline) en un volumen final de 10 [micron]l. La amplificacion consistio de una denaturacion inicial a 94[grados]C durante 3min, seguido por 35 ciclos de denaturacion a 94[grados]C durante 1 min, alineamiento a 55[grados]C durante 1 min y extension a 72[grados]C durante 1 min y una extension final a 72[grados]C durante 10 min. Como control positivo se incluyo una muestra foliar de S. tuberosum grupo Phureja cv Criolla Colombia con sintomas de PYVD y como controles negativos una muestra foliar de una planta de Calamondino (Citrofortunella madurensis, Lour) infectada con el virus Citrus tristeza virus (CTV) de la familia Closteroviridae; y una muestra foliar de S. tuberosum grupo Phureja cv Criolla Colombia libre de virus (obtenida por cultivo in vitro de meristemos).

PCR en tiempo real

Las reacciones de qRT-PCR se realizaron con el equipo LightCycler 480[R] (Roche), usando la quimica de sondas TaqMan[R] para la deteccion de un fragmento de 79 pb del gen CP de PYVV, como control interno de la reaccion se amplifico un fragmento de 79 pb del gen Citocromo oxidasa (COX, gen de expresion constitutiva en la planta). Se utilizaron las sondas e iniciadores reportados por Lopez et al., (2006) con algunas modificaciones en el marcaje de las sondas (tabla 2).

Para la reaccion se utilizo 1X de buffer N[H.sub.4] (Bioline), 5.5 mM de MgCh (Bioline), 0.5 mM de dNTPs (Bioline), 0.3 [micron]M de cada primer, 0.24 [micron]M de la sonda (tabla 2), 1U de Biolasa (Bioline), 2 [micron]l de cDNA en un volumen final de 10pl. Los ciclos de amplificacion consistieron de una denaturacion durante 10 min a 95[grados]C, 45 ciclos de amplificacion con una denaturacion a 95[grados]C por 10 s y alineamiento a 55[grados]C por 30 s (siguiendo los protocolos estandar del laboratorio de virus vegetales IBUN). En las reacciones se incluyeron los controles descrito en la tabla 3.

Adicionalmente cada una de las muestras fue amplificada con una pareja de iniciadores para el gen COX con el objetivo de confirmar que las extracciones de ARN fueron realizadas apropiadamente y poder descartar falsos negativos en las amplificaciones del gen CP de PYVV.

Construccion de la curva estandar para la cuantificacion absoluta

Para determinar el numero de copias del gen CP de PYVV, se construyo una curva estandar utilizando diluciones seriadas de transcritos del gen CP de concentracion conocida.

Para la obtencion de los transcritos se utilizo un plasmido pGEM-T[R] (Promega) en el que el inserto era el gen completo de la proteina mayor de la capside (donado por la estudiante de doctorado en Biotecnologia UN, Patricia Rodriguez del laboratorio de Virus Vegetales del IBUN). El plasmido se linearizado con la enzima de restriccion PstI (Promega) cuyo sitio de reconocimiento permite que el promotor T7 de la RNA polimerasa quede corriente arriba del inserto; la restriccion se realizo de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Posteriormente, el plasmido linearizado fue purificado utilizando el kit Wizard[R] DNA Clean-Up System (Promega). Finalmente, se realizo la transcripcion in vitro teniendo en cuenta la siguiente mezcla de reaccion: 1 [micron]g de DNA, 0.5 mM rNTPs (Invitrogen), 5X de buffer de reaccion (Invitrogen), 50 U de RNase inhibitor (Invitrogen), 10 mM de DTT (Invitrogen) y 30 U de RNA polimerasa T7 (Invitrogen) en un volumen final de 50 pl, el cual fue incubado durante 1 h a 37[grados]C, segun indicaciones de la casa comercial.

Se realizaron diluciones seriadas del transcrito obtenido, las cuales servirian como patrones en la construccion de la curva estandar despues de la determinacion de su concentracion utilizando el kit Quant-iTTM RiboGreen[R] RNA Assay (casa comercial Invitrogen).

La curva estandar se obtuvo graficando el valor Ct (en ingles threshold cycle) de cada una de las diluciones versus el logaritmo del numero de copias del gen CP de PYVV. Cada punto de la curva estandar se corrio por duplicado. Para validar la cuantificacion absoluta se corrio en tres ensayos independientes. La estimacion del numero de copias del gen CP de los estandares utilizados para la construccion de la curva estandar se hizo de acuerdo a la siguiente ecuacion:

Numero de copias gen CP = [(cantidad de transcrito x acogadro)/#pares debases x (1 x [10.sup.3]) x 340]

En donde la cantidad de transcrito de ARN se expresa en mg, el numero de avogadro corresponde a 6.02 X [10.sup.23], pb a numero de pares de bases del transcrito, es un factor de conversion para convertir de g a mg, 340 es el peso molecular promedio de un nucleotido en una hebra sencilla de ARN. Se determino el titulo viral en cada una de las muestras de las plantas por la interpolacion del valor Ct en la curva de calibracion normalizada.

Analisis estadisticos

Se calculo el promedio del numero de copias para cada organo evaluado, la desviacion estandar y coeficiente de variacion (CV%) inter-ensayo (porcentaje de la desviacion estandar en comparacion con el promedio del numero de copias) utilizando el programa R (R Development Core Team, 2008). La distribucion de todos los datos fue evaluada utilizando el test de normalidad Shapiro Wilk. Debido a que los resultados no presentaron una distribucion normal se realizaron comparaciones para evaluar si se presentaban diferencias en la carga viral entre los organos mediante la aplicacion de una prueba Mann-Whitney acompanada de la correccion de Bonferroni a nivel de significancia (p < 0.05) para controlar la tasa de error (Yuan et al., 2006).

Resultados

Transmision de PYVV utilizando el vector natural

Solamente despues de 21 dias post-transmision (dpt), PYVV se detecto en las plantas receptoras a traves de amplificacion del gen CP de PYVV por RT-PCR convencional (figura 1). Los ensayos de deteccion por RT-PCR incluyen plantas receptoras que no expresaron sintomas (NS), trasmitidas a partir de plantas donadoras M (Carriles 2 al 6); plantas que expresaron sintomas, trasmitidas a partir de plantas donadoras S (Carriles 7 al 13).

A pesar de la deteccion del virus en algunas de las muestras a los 21dpt, la expresion de sintomas se observo en algunos foliolos a partir de los 28 a 32 dpt. y a nivel sistemico entre los 42 a 45 dpt (figura 2).

De las doce plantas utilizadas como receptoras, solamente se observo la expresion de amarillamiento intevenal en el 58.3% de las plantas (7/12), en las cuales se detecto el virus mediante RT-PCR. PYVV tambien fue detectado en dos plantas que no expresaron sintoma de amarillamiento intervenal, lo que indica que el porcentaje de transmision de PYVV fue del (75%) (9/12). Sin embargo, otros autores como (Gamarra, 2002) informa que la eficiencia de trasmision de PYVV es baja de 6% utilizando Solanum tuberosum Grupo Andigena (variedad Diacol-Capiro). En el presente estudio, el porcentaje de transmision y la expresion de sintomas en las plantas receptoras despues de la transmision, dependio de la planta donadora de PYVV y de su titulo viral, es decir, que cuando se utilizo planta donadora S el porcentaje de transmision fue del 100% (7/7) y todas las plantas receptoras expresaron sintoma de amarillamiento intervenal. Sin embargo, con la planta donadora M el porcentaje de transmision solo fue del 40% (2/5) y ninguna de las plantas expreso sintomas (tabla 4).

Deteccion del gen CP de PYVV por RT-PCR en diferentes organos de plantas con diferente nivel de expresion de sintomas

A partir del ensayo de transmision se seleccionaron tres plantas receptoras en las que se habia detectado el virus por RT-PCR: una S, una M y una NS; las cuales fueron evaluadas mediante RT-PCR para analizar la distribucion del virus en los diferentes organos (tabla 1).

El virus se detecto en todos los organos evaluados de las tres plantas (figura 3). En la planta S se detecto el virus en el 92.3% (109/118) de las muestras analizadas, en la planta M en el 95.5% (85/89), y en la planta NS solo se detecto el PYVV en el 46.6% de las muestras (32/60).

qRT-PCR para la deteccion de PYVV en diferentes organos de plantas con diferente nivel de expresion de sintomas

En todas las muestras evaluadas se amplifico el control interno (COX), los valores Ct fueron similares con un promedio de 15.9 [+ o -] 0.46 (figura 4A). El coeficiente de variacion inter-ensayo no fue mayor al 7% indicando una buena reproducibilidad.

Aunque por RT-PCR convencional el virus se logro detectar en todos los organos analizados de las tres plantas evaluadas, la deteccion no se dio en la totalidad de las muestras, lo que si se consiguio en la tecnica de qRT-PCR, la cual permitio la deteccion del virus incluso en las muestras que habian resultado negativas por RTPCR convencional (41/267), en donde el porcentaje de falsos negativos fue del 15.4%.

Para poder hacer la cuantificacion absoluta del gen CP de PYVV se construyo una curva estandar con diluciones de transcritos de concentracion conocida que iban desde 106 hasta 1010 (figura 5).

El valor Ct para el gen CP estuvo entre 14.57 y 24.47 (valor promedio de 18.89 [+ o -] 2.22) (figura 4B), con un numero de copias del gen CP entre 9.17 x [10.sup.6] y 4.86 x [10.sup.9] (valor promedio de 5.22 x [10.sup.8] [+ o -] 7.05 x [10.sup.7]). La gran mayoria de falsos negativos obtenidos en la tecnica convencional provenian de plantas NS, las cuales presentaron un promedio del numero de copias del gen CP de 4 x [10.sup.7], el cual fue significativamente menor (Prueba Mann Whitney, p<0.05) en casi un grado de magnitud, que las muestras provenientes de plantas sintomaticas (figura 6, Prueba Mann Whitney, p<0.05). El numero de copias del gen CP en plantas con sintomas de amarillamiento intervenal (figura 6) no se vio afectado por la intensidad del sintoma, la diferencia del titulo viral entre la planta con sintoma severo y la planta con sintoma moderado no fue estadisticamente significativa (Prueba Mann Whitney, p=0.184).

Acumulacion de PYVV en diferentes organos de plantas infectadas

Los resultados de la figura 7 y de la tabla 5 indican que el titulo viral acumulado en los diferentes organos de la planta NS, no presentaron diferencias estadisticamente significativas (Prueba de Mann Whitney, p=0.136), lo que sugiere que la distribucion del virus en esta planta es homogenea, ademas, cada organo de esta planta presenta un titulo viral significativamente menor que el acumulado en plantas sintomaticas (Prueba Mann Whitney, p<0.05)

Al comparar el titulo viral acumulado en diferentes organos de plantas sintomaticas (figura 7 y tabla 5) se encontro diferencias estadisticamente significativas entre organos de la zona radical y los de la zona ae rea (Prueba Mann Whitney, p>0.05), sugiriendo una acumulacion heterogenea, con mayor acumulacion en organos de la zona aerea.

Discusion

El objetivo de este trabajo era evaluar la distribucion de PYVV en diferentes organos de plantas infectadas, para lo cual era necesario contar con plantas que solo estuvieran infectadas por este patogeno, debido a que infecciones mixtas pueden afectar algunos aspectos como la expresion de sintomas (reduccion o exacerbacion), rango de hospederos (Garcia-Cano et al., 2006), y diferencias de tropismo y del titulo viral acumulado en diferentes organos (Wege y Siegmund, 2007); estudios serologicos realizados en muestras de accesiones de bancos de germoplasma del grupo Phureja, han demostrado que algunas plantas mantenidas en campo pueden estar infectadas con uno o varios virus dentro de los que se reportaron: Potato virus S (PVS, Flexiviridae), Potato Leafroll virus (PLRV, Luteoviridae), Potato virus Y (PVY) y Potato virus X (PVX, Flexiviridae) (Guzman et al., 2010); a traves de estudios de secuenciacion profunda, Silvestre et al., (2012) encontraron que PYVV puede estar en coinfeccion con PVY; para garantizar que las plantas analizadas solo estuvieran infectadas con PYVV, se realizo transmision a plantas libres de virus utilizando el vector natural que es T. vaporariorum, el cual no podria transmitir PVY porque su vector es Myzus persicae (Hemiptera: Aphidae). (Van Hoof, 1980).

La eficiencia de transmision (porcentaje de plantas infectadas por el virus durante la transmision) obtenida en este ensayo fue del 75% (9/12 plantas), aunque no fue del 100%, es posible que en condiciones naturales y climaticas adecuadas la transmision de PYVV por vector pueda ser mas alta. La metodologia utilizada en este trabajo permitio la obtencion de una eficiencia alta comparada con la obtenida por otros autores, que realizaron ensayos de transmision de PYVV, Gamarra (2002) reporto un 6%, mientras que Arciniegas et al. (2008) reporta un porcentaje de transmision del 12%.

Con respecto a la expresion de sintomas, los resultados fueron similares a los obtenidos por Arciniegas et al. (2008) en donde la expresion se dio entre los 28 y 32 dias. En este trabajo se encontro que cuando la planta donadora era M, no se observo sintomas en las plantas receptoras (a pesar de esto se confirmo la presencia del virus mediante RT-PCR en algunas plantas que no expresaron sintomas), contrario a lo que si ocurrio cuando la planta donadora era S. Esto podria indicar que el titulo viral de la fuente de inoculo esta relacionado con la expresion de sintomas en la planta receptora, por lo tanto las plantas donadoras M tendrian un menor titulo viral que las plantas S, lo que influye sobre todo cuando la transmision no es persis tente o es semipersistente como en PYVV (Salazar et al., 2000; Diaz et al., 1990; Tamayo y Navarro 1984) debido a que no hay replicacion del virus dentro del insecto y por lo tanto, durante el periodo de adquisicion, el titulo viral alcanzado por el insecto vector deberia ser proporcional al titulo viral de la planta fuente de inoculo.

En los ensayos de deteccion del virus en los diferentes organos de plantas receptoras se encontro que la tecnica de RT-PCR en tiempo real, siendo mas sensible permitio la deteccion de PYVV en muestras que habian sido negativas (falsos negativos) por la tecnica RT-PCR convencional, las muestras que fueron falsos negativos por la tecnica convencional presentaron un titulo viral menor (4 x [10.sup.7]) que las que lograron ser detectadas mediante esta tecnica (6 x [10.sup.8]), lo que expone una de las restricciones de la tecnica convencional la cual depende de un limite en el numero de copias para lograr un resultado positivo, conllevando a falsos negativos, que en este caso fue del 15,8%.

Los resultados de la tecnica de RT-PCR en tiempo real indicaron que en la planta NS, la distribucion del virus en los organos analizados fue homogenea, este patron de distribucion con un bajo titulo viral podrian estar relacionados con la ausencia de expresion de sintomas en estas plantas, hay que tener en cuenta que estos ensayos fueron realizados en condiciones de laboratorio, pero en condiciones naturales, las plantas NS podrian ser el resultados de eventos de transmision en donde el inoculo presenta bajo titulo viral (menor de 4 x [10.sup.7]), o plantas que presentan infecciones tardias que hasta ahora estan comenzando el desarrollo de la enfermedad.

Por otro lado, las plantas que expresaron sintomas presentaron una distribucion diferencial del virus (distribucion heterogenea), aspecto reportado por otros autores; Singh y Singh (1996 y 1998) detectaron el virus Potato virus A (PVA, Potyviridae) en tuberculos y otros tejidos de plantas de papa con una distribucion heterogenea; de la misma manera, Kogovsek et al. (2011) reportaron la deteccion de PVY en diferentes organos de plantas infectadas, el cual presento una distribucion heterogenea con mayor acumulacion en los foliolos; para nuestro caso la mayor concentracion se presento en la zona aerea; esto podria ser una estrategia de dispersion, porque al mantenerlo en esta zona, el virus quedaria mas accesible a la mosca blanca, contribuyendo de esta manera con la dispersion del mismo, este aspecto no habia sido estudiado previamente en PYVV, pero si en otros virus como por ejemplo Carnation etched ring virus (CERV, Caulimoviridae) y Carnation vein mottle virus (CVMV, Potyviridae), que son transmitidos por miembros de la familia Aphididae, estos presentaron una menor acumulacion viral en la zona radical (Sanchez-Navarro et al., 2007), en casos de virus que son transmitidos por hongos que habitan en el suelo o nematodos, se ha descrito que estos se concentran principalmente en la zona radical, como es el caso de los Carmovirus que son transmitidos por hongos del suelo (Gosalvez et al., 2003) y Tobravirus que son transmitidos por nematodos (Schmitt et al., 1998; MacFarlane y Popovich, 2000).

El foliolo fue uno de los organos que presento mayor carga viral en plantas sintomaticas, y este es el organo del que prefiere alimentarse la mosca blanca, sumado a esto PYVV es un patogeno limitado al floema y la mosca blanca se alimenta del floema (Cohen et al., 1996), estos aspectos podrian resultar en un mayor exito de transmision. Los habitos alimenticios de la mosca blanca reforzarian la idea de que el virus se acumula en las plantas de manera que sea muy accesible al vector, apoyando el concepto de un proceso de coevolucion entre el vector y el virus (Lovisolo et al., 2003).

Hay que tener en cuenta que este virus tambien puede ser transmitido vegetativamente a traves de tuberculo-semilla, aspecto que no se evaluo en este trabajo porque ya se habia abordado previamente; GuzmanBarney et al. (2012) en un trabajo realizado en material colectado en un cultivo del municipio de Mosquera (Cundinamarca), reportaron que el virus se acumula en los tuberculos de manera heterogenea en la zona radical, tanto en plantas sintomaticas como NS como en plantas sintomaticas, los titulos virales reportados en ese trabajo se encontraron entre 3.42 x [10.sup.2] a 6.01 x [10.sup.8], lo que podria explicar la falta de expresion de sintomas en algunos individuos de la progenie obtenidos a partir de plantas sintomaticas.

Seria interesante hacer ensayos de deteccion del virus en semilla sexual, lo que permitiria dilucidar algunos aspectos de transmision de este virus (transmision sexual), porque hasta el momento no se ha demostrado si PYVV puede ser transmitido de esta manera, aunque la probabilidad de que PYVV presente este tipo de transmision es baja, no se puede descartar que algunos eventos de dispersion sean llevados a cabo a traves de este mecanismo. No hay muchos reportes sobre la deteccion de virus fitopatogenos en semilla sexual, Maruthi et al. (2005) reportaron que no se logro detectar Cassava brown streak virus (CBSV, Ipomovirus) en muestras de semilla aunque el virus fue detectado en muestras de flores y frutos, segun estos autores posiblemente existe un mecanismo que excluye el virus del embrion y por esta razon este virus no es transmisible sexualmente, en este trabajo el virus se logro detectar en el organo reproductor masculino (antera), es posible que PYVV tenga un mecanismo similar al de CBSV pero esto estaria por confirmarse.

La deteccion de plantas infectadas por virus y su eliminacion es un paso importante en los programas de manejo y control para poder evitar su dispersion, por lo tanto, la incorporacion de tecnicas de deteccion con un alto grado de sensibilidad que permitan la deteccion del virus tanto en plantas sintomaticas como en no sintomaticas, es de vital importancia en procesos de diagnostico para la deteccion de plantas infectadas. Este resultado es util para el mantenimiento y sanidad de los bancos de germoplasmas, en procesos de fitomejoramiento, indexado de plantas contra PYVV, programas de cuarentena y en certificacion de semilla. Ademas, esta tecnica no solamente es util en procesos de diagnostico, tambien ha sido de gran utilidad en estudios de expresion de genes y en estudios que evaluan diversos aspectos de la biologia de virus, en este caso se utilizo para evaluar la distribucion del virus en plantas infectadas lo que ademas de aportar informacion del virus, es una base para la seleccion de organos en los procesos de deteccion.

Conclusiones

Es de resaltar que este es el primer trabajo sobre la deteccion y distribucion de PYVV utilizando tiempo real, en diferentes organos de plantas de papa criolla que expresaban sintomas de amarillamiento de venas y sin la expresion de los sintomas (no sintomaticas) pero infectadas por el virus. La informacion generada puede ser de gran importancia para dilucidar algunos aspectos relacionados con la transmision del virus a partir de semilla-tuberculo como por transmision por vector y aun con la posibilidad de transmision sexual pues se detecto en anteras. Faltan trabajos complementarios y mas amplios sobre estos aspectos de la biologia y distribucion viral en la planta. Tambien, los resultados de este trabajo pueden ser utiles en programas de fitomejoramiento, de indexado de plantas de papa contra PYVV, programas de cuarentena y de certificacion de semillas de papa libres de virus.

Por primera vez se detecta al virus PYVV en diferentes organos como peciolo, pedunculo floral, antera, petalo y raiz; de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja (variedad Criolla Colombia) utilizando las tecnicas moleculares de RT-PCR convencional y q-RT-PCR, siendo esta ultima la mas sensible debido pues permitio la deteccion en muestras de plantas que habian dado resultado negativo por la tecnica convencional de RT-PCR. Adicionalmente, es la primera vez que se analiza la distribucion del virus PYVV como homogenea o heterogenea en los organos analizados y en las plantas sintomaticas y no sintomaticas. Las plantas no sintomaticas presentaron titulos virales menores y en distribucion mas homogenea dentro del organo que las plantas que expresaban sintomas. Por lo tanto se pueden realizar otros estudios que aporten a la comprension de la biologia de PYVV dentro de la planta, puesto que anteriormente solo se habia reportado el uso de RT-PCR con fines del diagnostico viral. La tecnica de qRT-PCR permitio la deteccion viral en un mayor porcentaje de muestras (mayor al 90%) y una mayor sensibilidad para la deteccion viral en todos los organos evaluados comparado con la tecnica de RT-PCR convencional (15.8% de falsos negativos).

Recibido: agosto 10 de 2013

Aprobado: mayo 2 de 2014

Agradecimientos

Esta investigacion se realizo gracias al apoyo economico y tecnico del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia y a Colciencias (201010016538). Al Instituto de Biotecnologia de la Universidad Nacional de Colombia. A Carlos Barragan por el apoyo en los ensayos de transmision, a Patricia Rodriguez por su apoyo en la construccion de la curva estandar y a Angela Villamil, por los valiosos aportes realizados.

Referencias bibliograficas

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Hernandez-Guzman Anngie Katherine, Biologa, MSc. Laboratorio de Virus Vegetales, Instituto de Biotecnologia (IBUN), Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogota, Colombia.

Guzman-Barney M. Monica, Biologa, MSc., PhD. Laboratorio de Virus Vegetales, Instituto de Biotecnologia (IBUN), Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogota, Colombia. E-mail: mmguzmanb@unal.edu.co.

Tabla 1. Numero de muestras analizadas para evaluar la
acumulacion del virus en diferentes organos de plantas
infectadas

Zona           Organo         Plantas por expresion
                              de sintoma

                              NS   M    S

Radical   Tallo subterraneo   2    6    9
Radical   Raiz                7    4    18
Aerea     Foliolo             24   27   36
Aerea     Peciolo             24   27   39
Aerea     Tallo aereo         3    7    10
Aerea     Petalo              0    6    2
Aerea     Pedunculo floral    0    6    2
Aerea     Antera              0    6    2

Tabla 2. Secuencias de los iniciadores y sondas utilizados en las
reacciones de RT-PCR convencional y en tiempo real.

Reaccion     Gen       Primer/     Direccion        Secuencia
                        Sonda

RT-PCR     CP-PYVV    F2           Hacia       5'-CTC GAG GAT CCT
                                   adelante    CAT GGA AAT CCG
                                               AT-3'

                      3'           Hacia       5'-AAG CTT CTA CTC
                                   atras       AAT AGA TCC TGC
                                               TA-3'

qRT-PCR    CP-PYVV    591F         Hacia       5'-CGG AGA TTA TGT
                                   adelante    CAA TGG TTC GA-3'

                      670R         Hacia       5'-TTG CTG CAT TCT
                                   atras       TGA ACA GGT AA-3'

                      Sonda CP                 5'-6-FAM AAC CAA CAT
                      *(465:510)               TTC TGA TGA TGA TTT
                                               GAC TGC AA-3' BHQ1

           (+) Cox-   COX-F        Hacia       5'-CGT CGC ATT CCA
           Planta                  adelante    GAT TAT CCA-3'

                      COX-R        Hacia       5'-CAA CTA CGG ATA
                                   atras       TAT AAG AGC CAA AAC
                                               TG-3'

                      Sonda COX                5'-HEX TGC TTA CGC
                      *(533:580)               TGG ATG GAA TGC CCT
                                               3' BHQ2

Reaccion     Gen       Primer/      Tamano     Referencia
                        Sonda      esperado

RT-PCR     CP-PYVV    F2           759pb      Rodriguez et
                                              al., 2009

                      3'

qRT-PCR    CP-PYVV    591F         79pb       Lopez et al.,
                                              2006
                      670R

                      Sonda CP
                      *(465:510)

           (+) Cox-   COX-F        79pb
           Planta

                      COX-R

                      Sonda COX
                      *(533:580)

* Los valores entre parentesis corresponden a las longitudes
de onda en nanometros de excitacion : emision de los fluorocromos.

En el trabajo de Lopez et al. (2006) la sonda para detectar a
COX estaba marcada con JOE, en este caso el marcaje se hizo con
HEX

(+) Control interno de reaccion

Tabla 3. Controles incluidos en las reacciones de qRT-PCR

Tipo de              Molde                   Observacion
control

Positivo   S. tuberosum Grupo
           Phureja cv. Criolla
           Colombia infectada con
           PYVV RT-PCR positivo para
           el gen CP de PYVV

           Uno de los transcritos      Evaluacion de
           utilizados para la          reproducibilidad
           construccion de la curva
           estandar.

Negativo   Sin molde.                  Evaluacion de
                                       contaminacion de
                                       reactivos

           C. madurensis infectada     Evaluacion de reacciones
           con CTV                     cruzadas con otros virus
                                       de la familia
                                       Closteroviridae

           S. tuberosum grupo          Evaluacion de reacciones
           Phureja Clon 1 obtenida a   cruzadas con genes de la
           partir de cultivo de        planta
           meristemos in vitro

           *  RT-                      Evaluacion de
                                       contaminacion con DNA en
                                       los extractos de RNA

* Reaccion en la que se utiliza como molde RNA proveniente de una
planta que expresa sintomas para la enfermedad causada por PYVV,
en la que no se hace retrotranscripcion.

Tabla 4. Resultados de RT-PCR y sintomatologia de
las plantas receptoras despues de la transmision.

Sintomatologia   % de plantas   Sintomatologia
plantas           receptoras        plantas
donadoras         RT-PCR (+)      receptoras
                                  RT-PCR (+)

Moderada         40% (2/5)      No sintomaticas

Severa           100% (7/7)     Sintomaticas

Sintomatologia    Nivel de     Numero de
plantas          intensidad     plantas
donadoras        de sintomas

Moderada             NS            2

Severa                M            4

                      S            3

Los valores entre parentesis equivale a la relacion
de plantas que fueron RT-PCR (+) sobre plantas totales.

Tabla 5. Contraste organo especifico en el numero de copias
del gen CP de PYVV acumulado en plantas sintomaticas. El signo
"+" indica diferencias significativas (p<0.05,) y "-" lo
contrario (p>0.05). El organo, la intensidad de expresion de
sintomas y la combinacion de estos dos factores afectan la
acumulacion del virus. (Prueba de Friedman, p<0.05)

Organo              Antera   Foliolo   Peciolo   Pedunculo
                                                  floral

Foliolo               +
Peciolo               +         -
Pedunculo floral      +         -         -
Petalo                +         -         -          -
Tallo Subterraneo     -         +         +          +
Raiz                  -         +         +          +
Tallo                 +         +         -          +

Organo              Petalo      Tallo      Raiz
                             Subterraneo

Foliolo
Peciolo
Pedunculo floral
Petalo
Tallo Subterraneo     -
Raiz                  +           -
Tallo                 -           +         +
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Author:Hernandez-Guzman, Anngie Katherine; Guzman-Barney, Monica M.
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Jul 1, 2014
Words:7592
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