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Deteccion del gen PrP de scrapie en ovinos junin.

DETECTION OF THE PRP GENE IN JUNIN SHEEP

INTRODUCCION

La tembladera o scrapie es una encefalopatia espongiforme transmisible (EET) que afecta a ovejas y cabras. Fue descrita por primera vez en 1732 (Detwiler y Baylis, 2003), y ha recibido especial atencion en anos recientes, debido a la alarma social generada por la posible transmision al hombre desde el bovino. La sintomatologia incluye prurito, hiperexcitabilidad, temblores y falta de coordinacion en la marcha, para acabar en paralisis y muerte. La enfermedad presenta largos periodos de incubacion y da lugar a la degeneracion progresiva del sistema nervioso central que, en etapas avanzadas de la enfermedad, adquiere el caracteristico aspecto espongiforme (Portela et al., 2006).

El nombre de prion deriva de proteina infecciosa (Prusiner, 1995). Los priones son glucoproteinas de membrana que se anclan a ella por una molecula de glicosil-fosfatidilinositol y cumplen funciones biologicas que estan relacionadas con la sinapsis (Brown, 2001) y con rutas de transduccion de senales de membrana relacionadas con la apoptosis (Thellung et al., 2000). En el ovino se ha establecido la influencia del gen Prion (PrP o PRNP), en la capacidad de resistir o padecer la enfermedad. Los cambios de bases que se producen en tres codones (posiciones 136, 154 y 171) de la proteina prion van a determinar, en mayor o menor medida, la susceptibilidad de cada animal de padecer dicha enfermedad.

Se han establecido cinco grupos de riesgo de contraer la enfermedad con base al genotipo de cada animal, donde el grupo 1 incluye animales catalogados como muy resistentes o de muy bajo riesgo de contraer la enfermedad, y en el grupo 5 se incluyen los animales muy sensibles o de alto riesgo (Dawson et al., 1998). La variacion que presentan los cinco haplotipos denominados ARQ, VRQ, AHQ, ARR y ARH establecen que, en general, los animales ARR/ARR son los mas resistentes y los VRQ/VRQ son los mas sensibles a padecer la enfermedad (Dawson et al., 1998).

En Francia (Francois et al., 2002), Islandia (Thorgeirdottir et al, 1999), Inglaterra (McIntyre et al., 2009), Bulgaria (Sirakov et al, 2011), Pakistan (Babar et al, 2009), Alemania (Luhken et al., 2004) y Estados Unidos de Norteamerica (Thompson y Gasser, 2008) se ha evaluado la frecuencia de los tipos geneticos del gen Prion en diversas razas de ovinos presentes en sus respectivas areas geograficas. En la Union Europea se promueven programas de erradicacion de la enfermedad en ovinos, siendo un requisito realizar el genotipado de los animales que ingresan o salen de los paises miembros (Comision Europea, 2003).

En el Peru se tiene cerca de 10 millones de ovinos, entre carneros y corderos (INEI, 2012), los que representan un recurso importante de subsistencia en las regiones alto andinas del pais. El grupo racial con mayor numero de inividuos es el tipo criollo (81.0%), seguido de las razas Corriedale (11.4%),

Hampshire Down (2.6%), Black Belly (0.9%) y otras razas (4.1%) en la que se incluye a la raza Junin (INEI, 2012). El ovino Junin es considerado como la primera raza desarrollada en la region andina y una de las pocas razas creadas en el hemisferio occidental durante el siglo pasado. Se formo por seleccion masiva dentro de un gran rebano cerrado, como animal adaptado a las condiciones ambientales de sierra alta y puna. El ovino Junin produce carne y lana, es fertil y de crecimiento acelerado, criado a campo abierto en pasturas naturales (Villareal y Gamarra, 1978).

El objetivo del presente trabajo fue determinar los genotipos del gen Prion en ovinos Junin, con la finalidad de establecer la frecuencia de genotipos de resistencia o susceptibilidad de padecer la enfermedad de scrapie.

MATERIALES Y METOD

Toma de Muestras y Procesamiento

Se recolectaron 56 muestras de sangre de ovejas mayores de 2 anos, provenientes de un nucleo de crianza privada. Las muestras de sangre fueron colectadas mediante puncion de la vena yugular, empleando tubos vacutainer[R] de 3 ml con K-2 EDTA al 15%. Las muestras fueron conservadas a -20[grados]C y transportadas al Laboratorio de Biologia y Genetica Molecular de la Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM), Lima.

Extraccion de ADN

Para la extraccion de ADN se utilizo el kit comercial DNeasy[R] Blood & Tissue Kit (QIAGEN[R]), siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentracion y la tasa de pureza (relacion entre la concentracion de acidos nucleicos y concentracion de proteinas) de las muestras se determino mediante espectrofotometria a 260 y 280 nm. Tambien se evaluo su calidad mediante electroforesis en un gel de agarosa, con un marcador de ADN de concentracion conocida (ADN del fago [lambda] cortados con la enzima Hind III).

Amplificacion del Gen PrP mediante PCR

Con la PCR (reaccion en cadena de la polimerasa) se obtuvo un gran numero de copias de un fragmento de ADN; en este caso, una region de aproximadamente 300 pb del gen Prion, que incluye las posiciones 136, 154 y 171. Para ello, se prepararon mezclas de reaccion con 7.5 [micron]l de Mix Multiplex 2X, 4.5 [micron]l de agua ultrapura, 0.75 [micron]l de cada primer (F y R) y 1.5 [micron]l de ADN de ovino. Las condiciones de amplificacion fueron: 95[grados]C durante 5 min, continuando con 30 ciclos a 95[grados]C durante 30 s, 63[grados]C durante 30 s y 72[grados]C durante 1 min, finalizando con un ciclo de 72[grados]C durante 10 min. Se confirmo la presencia del gen PrP haciendo una electroforesis en gel agarosa al 2%.

Determinacion de Genotipos del Gen PrP

Los productos de PCR fueron analizados mediante digestion enzimatica con endonucleasas de restriccion que reconocen los polimorfismos del gen PrP en estudio. Para determinar los polimorfismos de los codones 136 y 154, el producto de la PCR es digerido con la enzima BspHI (T[flecha hacia abajo]CATAG) a 37[grados]C durante 2 h, como en el protocolo de Hunter (1997). En el caso del codon 136, si la enzima realiza un corte en el fragmento de ADN se tipifica como alelo V y si no realiza el corte se tipifica como A. Para el codon 154, si la enzima BspHI corta el producto de PCR en esta posicion se tipifica como alelo H y si no realiza el corte se tipifica como R.

Los polimorfismos para el codon 171 se determinan segun Yuzbasiyan-Gurkan et al. (1999), mediante la combinacion de los resultados obtenidos por la digestion del producto de la PCR con la enzima BslI (CCNNNNN[flecha hacia abajo]NNGG) a 55[grados]C, durante 2 h y del producto de la PCR con AccI (GT[flecha hacia abajo]MKAC) a 37[grados]C durante 2 h. Si la enzima BslI corta, se le tipifica como alelo R, en caso contrario podria ser alelo Q o H. Para diferenciar los alelos Q y H se emplea la enzima AccI que al realizar corte se tipifica como alelo Q, en caso contrario como alelo H. Los fragmentos de restriccion generados son separados por electroforesis en un gel de agarosa al 3%. La deteccion de los fragmentos se realiza por tincion con bromuro de etidio (0.5 [micron]g/mg) y fotografiado bajo luz UV

[FIGURA 1 OMITIR]

[FIGURA 2 OMITIR]

RESULTADOS

La Fig. 1 muestra el ADN en las muestras de sangre, obteniendose concentraciones de ADN de 25 a 100 ng. Se logro amplificar el gen PrP de todas las muestras de sangre. El tamano esperado del producto de PCR fue de 300 pb aproximadamente (Fig. 2).

Se encontraron cuatro haplotipos para el gen Prion, siendo el de mayor frecuencia el ARR (48.2 %) y el de menor frecuencia el VRQ (5.4%). La frecuencia para los AHQ y ARQ fue de 10.7 y 35.7%, respectivamente.

Asimismo, se encontraron 7 genotipos, que, de acuerdo a los grupos de resistencia, 4 pertenecieron a genotipos de resistencia y 3 a genotipos de susceptibilidad (Fig. 3). Asi, el 17.9% pertenecio al grupo de resistencia R1, 10.7% al grupo R2 y 53.6% al grupo R3. En los grupos de susceptibilidad, el 14.2% pertenecio al grupo R4 y el 3.6% al grupo R5.

Finalmente, se encontro que el 82.1% de los animales mostraron algun genotipo de resistencia, en tanto que 17.9% de las ovejas presento un genotipo de susceptibilidad.

DISCUSION

La sintomatologia del scrapie incluye signos de rapida identificacion; sin embargo, no se ha reportado en forma fehaciente la presencia de esta enfermedad en ovinos en el Peru, aunque tampoco se puede descartar su presencia (R. Rosadio, Lima, comunicacion personal). Se conoce que la proteina Prion resiste temperaturas extremas, compuestos organicos y otros que normalmente son capaces de desnaturalizar o destruir las proteinas (Arancibia et al, 2004). Ademas, se ha demostrado que la proteina infecciosa puede transmitirse a traves de contacto con tejidos infectados, secreciones, e incluso por exposicion a aerosoles liberados por animales infectados (Haybaeck et al, 2011).

El presente estudio permitio identificar 4 de los 5 haplotipos reportados a nivel mundial (Belt et al., 1995) y 7 de los 15 genotipos identificados para el gen Prion (Dawson et al, 1998). ARR fue el haplotipo mas frecuente (48.2%), seguido del haplotipo ARQ (35.7%). Ianella et al. (2012) encontraron los mismos haplotipos y en el mismo orden de frecuencia, cuando evaluaron los haplotipos y genotipos en 13 razas de ovinos de Brasil, siendo uno de los pocos estudios realizados a nivel de Sudamerica. Los haplotipos ARR y ARQ son considerados de resistencia y AHQ de resistencia intermedia, mientras que VRQ es un haplotipo de susceptibilidad para el scrapie (Baylis y Goldmann, 2004).

En relacion con los 7 genotipos encontrados (Fig. 3), 4 de ellos (ARR/ARR, ARR/ AHQ, ARR/ARQ, ARQ/AHQ) son considerados genotipos de resistencia y ARQ/ ARQ, ARR/VRQ y ARQ/VRQ son considerados genotipos de susceptibilidad (Dawson et al., 1998). De esta forma, el 82.1% de las ovejas fueron consideradas como resistentes a scrapie, en tanto que el 17.9% fue considerado como susceptible.

Aunque estos valores solo corresponden a un grupo de 56 muestras, puede servir de punto de partida para futuras investigaciones, asi como establecer un programa de prevencion seleccionando animales resistentes a la enfermedad. El programa de seleccion en EEUU ha permitido disminuir los casos positivos a scrapie de 0.12% a 0.02% en algunos rebanos (American Sheep Industry Association, 2013). A nivel de America del Sur, Brasil ha reportado casos de scrapie o enfermedades causadas por priones desde 1978 (Ianella et al, 2012). Si bien se desconoce el total de casos reportados, es evidente que la proteina infecciosa esta circulando en America del Sur y, por lo tanto, puede aparecer en el pais. Brasil ha realizado el genotipado de 1400 ovejas de 13 razas (Ianella et al., 2012) y Uruguay (Artigas et al., 2011) viene realizando algunas pruebas, siendo los unicos estudios de este tipo en esta parte del continente.

La posibilidad de implementar estos analisis en un programa de seleccion facilitaria una rapida seleccion de animales con genotipos de alta resistencia a la enfermedad. Inclusive posibilitaria el analisis y trasferencia de embriones a madres con genotipo susceptible, pues fetos portadores del alelo ARR (resistencia a priones) que desarrollen en madres sucesptibles o que lleguen a desarrollar enfermedad pueden resistir y no acumular la proteina infecciosa (Wisniewski et al., 1996; Andreoletti et al., 2002). Por otro lado, los trabajos realizados en la seleccion de ovinos resistentes a scrapie concluyen que no han tenido efecto negativo contra caracteristicas productivas deseadas como la produccion de carne o lana (Moussaoui et al., 2005; Vitezika et al., 2006; Evoniuk et al., 2007; Sweeney y Hanrahan, 2008; Kastelic y Kompan, 2009; Boulton et al, 2010). puede infectar al hombre y generarle una nueva EET, pero se conoce la capacidad de adaptacion y transmision de los priones infecciosos (PrPsc) de los ovinos al ganado vacuno (Bradleyy Wilsmith, 1993; Brown et al., 2001) y finalmente al hombre, produciendo la nueva variante de Creuzfeldt Jakob (Bruce et al, 1997); por ello la necesidad de identificar los genotipos de las ovejas y orientar la seleccion de genotipos de resistencia. Debido a esto, se reconoce el alto riesgo de transmision de priones infecciosos interespecie y la necesidad de implementar medidas preventivas para evitar la transmision al hombre. La Union Europea, EEUU y otros paises (Comision Europea, 2003) han desarrollado planes de erradicacion de scrapie, a traves de la identificacion, seleccion/eliminacion de ovinos resistentes/susceptibles de padecer la enfermedad.

El ovino Junin fue desarrollado con las razas Columbia, Corriedale Americano, Panama y Warhill (Villareal y Gamarra, 1978), pero se desconoce los genotipos que podrian estar presentes en estas razas. Tampoco se conoce los genotipos que podrian estar presentes en otras razas en el medio como Black Belly, Corriedale, Hampshire Down, y en el ovino criollo, de alli que se hace necesario realizar estudios adicionales en estas razas.

El presente estudio constituye el primer reporte de la identificacion de haplotipos y genotipos de resistencia/susceptibilidad de scrapie en ovinos en el pais.

CONCLUSIONES

* Se encontraron 4 de los 5 haplotipos reportados (ARR, ARQ, AHQ y VRQ), y se encontraron 7 genotipos, de los cuales 4 fueron de resistencia y 3 de susceptibilidad al scrapie.

* El 82.1% de las muestras correspondio a un genotipo de resistencia a scrapie, en tanto que el 17.95% correspondio a un genotipo de susceptibilidad.

* El haplotipo ARR y el genotipo ARR/ ARQ fueron los mas frecuentes.

http://dx.doi.org/0.15381/rivep.v26i1.10917

Agradecimientos

Los autores agradecen al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia CONCYTEC (Contrato 306-2009CONCYTEC-OAJ) y al Vicerrectorado de Investigacion de la UNMSM por el financiamiento del estudio.

LITERATURA CITADA

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Kamilo Rivera J. (1), Lenin Maturrano H. (2,3,4), Juan Manuel Aguilar (3), Raul Rosadio A. (1,3)

(1) Laboratorio de Microbiologia y Parasitologia Veterinaria, (2) Laboratorio de Zootecnia y Produccion Agropecuaria, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima

(3) Instituto de Investigacion y Desarrollo de Camelidos Sudamericanos--CONOPA, Lima

(4) E-mail: lenin. maturrano@gmail. com

Recibido: 26 de marzo de 2014

Aceptado para publicacion: 4 de setiembre de 2014
Figura 3. Proporcion de genotipos y grupos de riesgo de acuerdo a
las combinaciones de importancia en la enfermedad de scrapie. R1,
R2 y R3 son genotipos resistentes y R4 y R5 son genotipos
susceptibles

            Frecuncia (%)

R1
  ARR/ARR   17.9
R2
  ARR/AHQ   10.7
R3
  ARR/ARQ   42.9
  ARQ/AHQ   10.7
R4
  ARQ/ARQ   7.1
  ARR/VRQ   7.1
R5
  ARQ/VRQ   3.6

Nota: Tabla derivada de grafico de barra.
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Author:Rivera J., Kamilo; Maturrano H., Lenin; Aguilar, Juan Manuel; Rosadio A., Raul
Publication:Revista de Investigaciones Veterinarias del Peru (RIVEP)
Date:Jan 1, 2015
Words:3743
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