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Deteccion de la variabilidad genetica de Bremia lactucae Regel. mediante RAPD e ISSR en plantaciones de lechuga.

Titulo corto: Variabilidad genetica de Bremia lactucae Regel

Short title: Genetic variability of Bremia lactucae Regel

1. Introduccion

Las enfermedades de los cultivos son factores limitantes en la produccion que pueden ser ocasionadas por bacterias, hongos, virus, fitoplasmas y nematodos (Michelmore, 2002), siendo las enfermedades causadas por hongos, las que causan mayores perdidas. Tal es el caso del mildiu inducido por Bremia lactucae Regel en la lechuga (Lebeda and Petrzelova, 2004; Grube and Ochoa, 2005), el cual se presenta en campo e invernadero, principalmente en regiones con temperaturas bajas y humedad relativa alta (Wu et al., 2000; Michelmore, 2002). Bremia lactucae Regel presenta alta variabilidad genetica debido a la presencia de dos grupos de compatibilidad (B1 y B2) y a su capacidad homotalica, lo que puede dar lugar a la presencia de una gran diversidad de razas fisiologicas (Crute, 1987; Michelmore and Hubert, 1987; Yuen and Lorbeer, 1987). El aumento en la variabilidad probablemente ha sido el resultado de la falta de cultivares de lechuga, y sobre todo la falta de rotacion de fungicidas, lo que a su vez genera resistencia del patogeno (Brown et al., 2004).

A pesar de que esta enfermedad ha sido reportada en nuestro continente desde 1875, en Mexico se carece de informacion sobre las razas que se presentan en la lechuga, asi como de estudios que indiquen su distribucion geografica, la intensidad con la que esta se presenta en las principales variedades de lechuga, y por consiguiente su variabilidad genetica, el desconocimiento de esta situacion dificulta su manejo y su control. Con los avances de la biologia molecular, se han desarrollado tecnicas como la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), que pueden utilizarse en la caracterizacion y evaluacion de la diversidad genetica de Bremia lactucae (Hoelzel, 1994). Ademas, los marcadores moleculares proveen informacion acerca de la variabilidad genetica dentro de una poblacion, facilitando el entendimiento y la prediccion del desarrollo de una enfermedad, asi como su relacion filogenetica (Huff et al., 1994; Legaria et al., 2005). Entre estos marcadores se encuentran los RAPD (Polimorfismo Amplificado al Azar del DNA, que es una de las metodologias ampliamente utilizadas en la PCR para diferentes propositos (Valadez y Kahl, 2000); en la micologia se ha utilizado para diferenciar poblaciones a nivel de especie, razas, formas especiales y variacion genetica (Pietrek and Zinkernagel, 2002). Sin embargo, no existen antecedentes de su aplicacion en la deteccion de la variabilidad genetica del mildiu en Mexico.

Otra tecnica prometedora y novedosa es la denominada Inter-Secuencias Simples Repetidas PCR (ISSR-PCR o ISSR por sus siglas en ingles Inter Simple Sequence Repeat), que permite la deteccion de polimorfismo en diferentes locus sin el conocimiento previo de la secuencia de ADN (Wu et al., 1994; Zietkiewicz et al., 1994; Moreno et al., 1998). Las caracteristicas por las que son aceptables los ISSR, como nuevos marcadores se relacionan con su amplia distribucion a traves del genoma, ademas son altamente polimorficos, es decir, detectan variabilidad en comparacion con otros marcadores moleculares, como los RFLP y RAPD (Tenzer et al., 1999). Wagner (2005) utilizo los ISSR para describir exitosamente las poblaciones de Bremia lactucae en distintas regiones de Alemania. En Mexico, el mildiu se encuentra presente en la mayoria de las zonas productoras de lechuga, cuando las condiciones temperatura y humedad son favorables, puede manifestarse desde plantula hasta postcosecha. Generalmente se reproduce asexualmente pero en presencia de los dos grupos de compatibilidad ocurre la reproduccion sexual. En America, unicamente se reporta uno de los dos grupos. A nivel mundial el numero de razas tiende a incrementarse por su alta capacidad de mutacion y a pesar de la existencia de variedades comerciales con resistencia genetica a la mayoria de las razas, el ataque de aquellas que copian la resistencia del material vegetal, suele causar perdidas cuantiosas en el cultivo. Los estudios sobre este patogeno en nuestro pais son incipientes, salvo la informacion que proporcionan las empresas productoras y/o comercializadoras de semilla, se desconoce que razas existen; por tanto, la adquisicion del material propagativo se hace confiando en la informacion proporcionada por dichas empresas (Salazar, 2011).

La presente investigacion tuvo como objetivo detectar la variabilidad genetica de Bremia lactucae en plantaciones de lechuga de Salamanca y San Miguel de Allende, mediante RAPD e ISSR.

2. Materiales y metodos

2.1 Incidencia y severidad

Durante el ciclo otono-invierno del 2012, en los campos de cultivo de lechuga ubicados en los municipios de Salamanca y San Miguel de Allende, se evaluo la incidencia y la severidad del mildiu (Bremia lactucae Regel) en 15 variedades de lechuga, para ello se determino el numero de lesiones por hoja en un total de 25 plantas por unidad experimental, una vez evaluados estos parametros, las hojas fueron recogidas e incubadas a 4 [grados]C durante cuatro dias para favorecer la esporulacion y tener suficiente micelio para realizar la extraccion de ADN y el analisis molecular por RAPD e ISSR. Se analizaron las variables ambientales temperatura, humedad relativa, humedad en la hoja y precipitacion. Estos parametros fueron tomados de las estaciones meteorologicas automatizadas. La Mina en San Miguel de Allende y Los Aguilares en Salamanca, dispuestas por la Fundacion Guanajuato Produce. Las lecturas se registraron cada 15 minutos de manera continua durante las 24 horas del dia en los diferentes meses de muestreo, agosto, septiembre, octubre, noviembre y diciembre. El analisis diario de las condiciones microclimaticas se realizo a intervalos de cuatro horas, de la siguiente manera: 0 h a 4:00 AM, 4:15 a 8:00 AM, 8:15 a 12:00 PM, 12:15 a 16:00 PM, 16:15 a 20:00 PM, y 20:15 a 23:45 PM. Esto permitio detectar el patron que tuvieron las variables climaticas a nivel de parcela, las cuales favorecen el crecimiento del hongo. Paralelamente, se correlacionaron las variables ambientales sobre la incidencia y severidad del mildiu. El analisis de correlacion se realizo con el paquete estadistico SAS (2002).

2.2 Extraccion de ADN y analisis molecular

El micelio de Bremia lactucae Regel, se obtuvo de las hojas enfermas colectadas. Los aislados con los que se trabajaron en Salamanca fueron Montecristo: B-M, FallGreen: B-FG, Summertime: B-SM, Magnum: B-MG, KingHenry: B-KG, y Napoleon: B-N; y en San Miguel de Allende se obtuvieron Sundavil: B-SD Rayder: B-R, Siskiyou: B-SK, Rayder: B-RR, Vertemar: B-V, Alfa: B-A, Magnum: B-MG, Sundavil: B-S, Summertime: B-SM. El tejido con micelio fue secado en camaras deshidratadoras, las cuales se mantuvieron a temperatura ambiente, posteriormente fue guardado en tubos Eppendorf[R] hasta su uso. A partir del micelio obtenido se realizo la extraccion de ADN utilizando dos tecnicas, primero se realizo una lisis con el proposito de eliminar fenoles siguiendo la metodologia descrita por Lee et al. (1991) y modificada por Rojas (1998). El producto de la lisis se utilizo para la extraccion de ADN con el metodo de Ahrens and Seemuller (1992) modificado. La concentracion del ADN fue cuantificada en un espectrofotometro a una longitud de onda de 260 nm (Perkin Elmer[R] Mod. Lambda Bio-10), y su calidad verificada mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%, antes de realizar la PCR. Para conocer la diversidad de Bremia lactucae mediante la tecnica de RAPD se probaron al azar 10 iniciadores de la serie A de Operon Technologies (A-01 a A-07, y de A-15 a A-17). La mezcla de reaccion se realizo en un volumen final de 25 [micron]L constituido por 13,05 [micron]L de agua desionizada esteril, 2,5 u.L de Buffer 1 X, 1,25 [micron]L de Mg[Cl.sup.2] 1,5 mM, 2,0 [micron]L dNTP 0,2 mM, 2,0 [micron]L de iniciador 20 pmol, 0,2 [micron]L de enzima DNA polimerasa 1U (Biotecnologias Universitarias[R]) y 4,0 u.L de ADN a una concentracion de 20 ng[micron]L. Con la finalidad de obtener mejores resultados se utilizo ademas la tecnica de ISSR o Microsatelites cuyos iniciadores fueron DBB-[CGA]5, BDD-[CCA]5, BDD[CAC]5, BVD-[CAG]5, GGAT4, GATA4, BDB [CAC]5, BDV-[CAG]5, HVH-[TGT]5, CAG5,

seleccionados en funcion de los resultados obtenidos por Wagner (2005). En el caso de los ISSR o microsatelites, la mezcla de reaccion se aforo a un volumen final de 25 [micron]L y consto de 14,05 [micron]L de agua desionizada esteril, 2,5 [micron]L de Buffer 1 X, 1,25 [micron]L de Mg[Cl.sup.2] 1,5 mM, 2,0 [micron]L dNTP 0,2 mM, 2,0 [micron]L de iniciador 20 pmol, 0,2 [micron]L de enzima DNA polimerasa 1 U (Biotecnologias Universitarias[R]) y 3,0 [micron]L de ADN a una concentracion de 20 ng[micron]L. La amplificacion de los RAPD e ISSR se realizo en un termociclador (Modelo 2400 Perkin Elmer[R]), el programa de amplificacion para los RAPD fue de un ciclo inicial de 95[grados]C por 2 minutos; 30 ciclos de 95[grados]C por 1 minuto para separar, 35[grados]C por 30 segundos y un ciclo de extension final de 72][grados]C por 10 minutos. Para el caso de los ISSR se empleo un ciclo inicial a 94[grados]C por 1 minuto, seguido de 40 ciclos a 94[grados]C para separar; 40[grados]C durante 1 minuto para alinear; 72[grados]C por 1 minuto; finalmente un ciclo de extension a 72[grados]C por 8 minutos.

La separacion de fragmentos de los RAPD e ISSR se realizo por electroforesis en un gel de agarosa ultrapura (Invitrogen[R]) al 3,5% a 85 voltios durante 1 hora. El gel fue tenido con bromuro de etidio durante 40 minutos, enjuagado en agua destilada esteril y visualizado en un transiluminador de luz ultravioleta (Modelo Gel Doc 2000, Bio Rad[R]). Para el analisis de las bandas se utilizo el programa Quantity One 4.0.3 y la documentacion de los productos amplificados, mediante un analizador de imagenes. Las bandas observadas para cada iniciador ISSR se analizaron mediante el codigo binario, asignando el valor de 1 a la presencia de una banda y 0 a su ausencia; el analisis estadistico de la matriz de ceros y unos se realizo mediante el paquete computacional sistema de analisis multivariado y taxonomico numerico (NTSYS-pc) version 2,10 p. La distancia genetica se estimo al transformar la matriz binaria en matriz de similitud mediante el coeficiente de apareamiento simple. El dendograma se obtuvo por el Metodo del Promedio Aritmetico entre Agrupamientos, tipo UPGMA (Unweighted PairGroup Method Arithmetic Averages) (Sneath and Sokal, 1973). La confiabilidad del dendograma, se probo mediante el Boostrap con 2000 replicas, usando el programa WINBOOT (Yap, 1991).

3. Resultados y discusion

3.1 Analisis de la incidencia y severidad

La incidencia del mildiu en los lotes muestreados en campo, durante el ciclo otono-invierno del 2012, fue del 100%, presentandose en mayor proporcion en las hojas basales y en menor proporcion en las internas, siendo favorecida por humedad relativa superior al 80%, con temperaturas favorables de 10 a 15 [degrees]C, y humedad relativa de 100% en las hojas durante 2 a 4 horas tal como lo mencionan Wu et al. (2001). En cuanto a la severidad en las variedades cultivadas en Salamanca, hubo diferencias estadisticamente significativas (p < 0,05), la cual fluctuo de 8,75% a 22,5%, siendo las variedades Montecristo, FallGreen, Summertime las mas susceptibles, mientras que la variedad Napoleon fue la mas resistente. En lo que respecta a la severidad del mildiu observada en las variedades cultivadas en San Miguel de Allende, se encontraron diferencias altamente significativas (p < 0,0001), la cual fluctuo de 7,5% a 16,25%, siendo las variedades Rayder, Siskiyou y Rayder las mas susceptibles, y la variedad Sundavil la mas resistente. La variacion de la severidad del mildiu pudo deberse al manejo proporcionado, al genotipo y a las condiciones ambientales (Hans-Jurgen and Hoyningen-Huene, 1986). Subbarao et al. (1997); Hans-Jurgen and Hoyningen-Huene (1986), mencionan que algunos de los factores importantes en la incidencia y severidad del patogeno son las condiciones ambientales y el manejo, debido a ello se hizo un analisis de la temperatura, humedad relativa, humedad en la hoja y precipitacion de ambos municipios. La severidad de Bremia lactucae en el ciclo otonoinvierno (agosto a diciembre del 2012) en los municipios de Salamanca y San Miguel de Allende presento variaciones a traves del tiempo, encontrandose una mayor expresion de sintomas en el mes de agosto y menor en diciembre. Las temperaturas minimas, humedad relativa y humedad en la hoja mas altas se registraron en el horario de 4:15--8:00 AM, en todos los meses, las cuales se consideran optimas para la infeccion del mildiu, segun Wu et al. (2005). Estas variables favorecieron el desarrollo de Bremia lactucae, en los dos municipios tal como lo mencionan (Wu et al., 2001; Su et al., 2004; Wu et al., 2005).

De manera general, durante el periodo de muestreo (agosto a diciembre del 2012) en el intervalo de 12:15 a 16:00 PM, en ambos municipios tanto la temperatura como humedad relativa y humedad en la hoja no fueron las optimas para el patogeno. En el transcurso del ciclo de muestreo se detecto que el comportamiento de las condiciones ambientales para los ultimos meses, noviembre y diciembre, no fueron tan favorables para el patogeno, situacion que coincidio con la severidad detectada en campo, lo cual concuerda con lo sostenido por Crute (1987), quien menciona que el mildiu es la enfermedad mas importante de la lechuga y un problema particularmente fuerte en los meses de agosto a noviembre. Wu et al. (2001), al respecto senala que las lechugas son mas susceptibles durante las estaciones con temperaturas de frescas a frias.

Al correlacionar las variables ambientales de temperatura, humedad relativa y humedad en el municipio de Salamanca, los resultados estadisticos muestran que tanto la temperatura (r=0,9847 con p=0,0023) como la humedad relativa (r=0.9735 con p=0,0051), tuvieron una correlacion significativa sobre la severidad del patogeno, debido a que estas condiciones microclimaticas favorecieron la presencia de este patogeno en el campo de cultivo. La falta de precipitacion permitio deducir que probablemente los riegos fueron los precursores de prolongar la humedad relativa y la humedad en la hoja, influyendo negativamente en la sanidad de la planta, tal como senalan Scherm and Van Bruggen (1994). Al respecto, Subbarao et al. (1997) reportaron que con el riego por goteo tanto la humedad relativa como la humedad en la hoja son menores en comparacion con el riego por gravedad.

En San Miguel de Allende, se encontro una correlacion positiva de la temperatura (r=0,9651 con p < 0,0078) sobre la severidad de B. lactucae en las variedades de lechuga cultivadas en esta zona. En lo que respecta a la humedad en la hoja tanto en el municipio de Salamanca como en San Miguel de Allende, esta no tuvo una correlacion significativa sobre la severidad de Bremia lactucae, contrario a lo reportado por Wu et al. (2005), quienes mencionan una correlacion positiva entre la humedad de hoja con la severidad e incidencia del mildiu. Esto fue debido a que los sensores que registran la humedad de la hoja se encuentran fuera de la parcela y la humedad en si es generada dentro del cultivo.

Salazar et al. (2011) reportaron la presencia del patogeno en los Estados de Guanajuato, Zacatecas y Puebla donde la incidencia promedio fue de 43,11%, 100% y 21,5%, respectivamente. Desafortunadamente se tiene poca informacion respecto a la distribucion del patogeno en Mexico.

3.2 Analisis mediante RAPD

Los iniciadores utilizados para la amplificacion del patogeno Bremia lactucae fueron los de la serie A de Operon Technologies: A-01, A-02, A03, A-04, A-05, A-06, A-07, A-15, A-16, A-17.

Ninguno de estos, logro amplificar alguno de los 15 aislados, esto fue debido a que las secuencias del iniciador no reconocieron ningun sitio blanco en el genoma de este patogeno tal como lo menciona Legaria et al. (2005).

3.3 Analisis mediante ISSR

Los ISSR mostraron 96 bandas obtenidas de los aislados de Bremia lactucae pero solo 88 fueron consideradas como polimorficas, mismas que equivalen al 91,6% de polimorfismo (Tabla 1).

De los 10 iniciadores ISSR, los que presentaron mayor informacion fueron DBB-[CGA]5 (19 bandas), BDD-[CAC]5 (17 bandas), BVD-[CAG]5 (20 bandas), BDD-[CCA]5 (19 bandas), con un porcentaje de polimorfismo de 100%, 94,1%, 100% y 100%, respectivamente. Este nivel de polimorfismo indica la existencia de alta variabilidad genetica entre los 15 aislados analizados, coincidiendo con los resultados publicados por Legaria et al. (2005). El nivel de polimorfismo mediante ISSR revelo mas informacion, lo cual concuerda con lo encontrado por Moreno et al. (1998), quienes mencionan que los ISSR superan a los RAPD en cuanto al nivel de polimorfismo. Similarmente, Pietrek and Zinkernagel (2002) al analizar algunas especies del hongo Peronospora valerianellae (Fuckel), encontraron que los RAPD son menos reproducibles que los ISSR. Por su parte, Salimat et al. (1995) al trabajar con el hongo Eleusine corocana (L.Gaertn), reportan que la tecnica de ISSR detecta mas regiones polimorficas, por lo tanto los ISSR son los indicados para detectar variabilidad genetica entre aislados del mismo hongo.

En la Figura 1 se observan las bandas obtenidas con el iniciador BDD-CCA5, considerado como uno de los mejores en cuanto a polimorfismo (100%). El numero de bandas amplificadas de ADN en los aislados de Bremia lactucae procedentes de Salamanca (Figura 1A) fue de 3 a 19 y en San Miguel de Allende (Figura 1B) de 0 a 19. Lo anterior coincide con lo encontrado por Groppe et al. (1995), al estudiar la variabilidad genetica del hongo Epichloe spp (Tul. & C. Tul).

En los aislados de Salamanca se pudo observar una banda de 3054 pb, la cual estuvo presente en el aislado B-FG, mientras que en el aislado B-SM se aprecio una banda de 2036 pb. En lo que respecta a los aislados B-MG, B-KG y B-N, a pesar de proceder del mismo lote y mes de colecta (noviembre), presentaron un perfil de bandeo diferente, lo cual es indicativo de la alta variabilidad genetica existente entre los aislados del mismo lugar (Figura 1A). Lo anterior concuerda con lo encontrado por McDonald et al. (1999) al detectar alta diversidad genetica en aislados del hongo Rynchosporium secalis (Oudem) procedentes del mismo lote.

Solo los aislados B-SD, B-R y B-SK procedentes del lote Santa Martha en San Miguel de Allende compartieron una banda de 1018 pb, la cual estuvo ausente en todos los demas. El aislado B-V obtenido de la variedad Vertemar no presento ninguna banda (Figura 1b), esto es resultado de la amplia diversidad genetica, algo similar encontraron Sicard et al. (2003) ellos reportaron la existencia de alta variabilidad en 38 aislados de Bremia lactucae procedentes de California, aun cuando procedian de la misma localidad.

Los aislados de Salamanca B-FG y B-M presentaron mayor similitud genetica con una distancia de 0,78 de similaridad, colectadas en el mes de agosto. Estas distancias de similaridad concuerdan con lo encontrado por Tenzer et al. (1999) en el hongo Venturia inaequalis (Cooke) G. Wint, quienes mencionan que valores cercanos a 1 significan que son poblaciones muy emparentadas geneticamente, mientras que los cercanos a 0, se refiere a poblaciones poco emparentadas.

Los aislados B-KG y B-SM tuvieron menor similitud genetica con una distancia de 0,40, las cuales, aunque procedieron del mismo municipio (Salamanca), se colectaron en diferente epoca (noviembre y agosto, respectivamente). Esta baja similitud posiblemente fue debida a que los aislados fueron colectados en diferente epoca en la cual las condiciones ambientales tambien eran distintas, tal como lo senala McDonald et al. (1999).

En la Figura 2 se muestra el dendograma del analisis realizado para el municipio de Salamanca, en el que se integraron las poblaciones del patogeno en tres grupos. El grupo I correspondio al de mayor severidad, el cual al parecer fue influenciado por los factores ambientales imperantes en el mes de agosto (temperatura de 16[grados]C, humedad relativa de 91% y humedad en la hoja de 6,91%) este fue conformado por los aislados B-M, B-FG y B-SM; El grupo II fue conformado por el aislado B-MG, de la variedad Magnum la cual mostro un grado de severidad menor al encontrado en el grupo I. Este grupo fue determinado por las condiciones ambientales imperantes en el mes de muestreo (temperatura de 7,9 [grados]C, Humedad relativa de 80% y humedad en la hoja de 0,91%). El grupo III conformado por los aislados B-KG y B-N de las variedades KingHenry y Napoleon, presentaron la mayor resistencia al ataque del mildiu y, al igual que los demas grupos, este tendio a agruparse por las condiciones ambientales imperantes durante la colecta (temperatura de 7,9 [grados]C, humedad relativa de 80% y humedad en la hoja de 0,91%).

En lo que respecta al analisis realizado en San Miguel de Allende, los aislados con mayor similitud genetica fueron B-A y B-MG con una distancia de 0,82. Esto probablemente debido a que los dos aislados de Bremia lactucae fueron del lote Mina 3 colectadas en octubre. Los aislados con menor similitud genetica fueron B-V y B-R, con una distancia de 0,46. Estos valores son similares a los reportados por Gobbin et al. (2003) basados en los marcadores moleculares de ISSR en el hongo Plasmopara viticola (Bert. & Curt), cuyas distancias geneticas estuvieron en el rango de 0,24 a 0,89.

En San Miguel de Allende, las poblaciones de Bremia lactucae se integraron en cinco grupos (Figura 3), esto concuerda con lo reportado por Heilmann et al. (2006), quienes al trabajar con aislados de Colletotrichum coccodes (Wallr.) S. Hughes, encontraron que cuando se forman varios grupos se indica la existencia de alta variabilidad genetica en la zona, situacion que tambien fue encontrada en Salamanca. El grupo I correspondio al de mayor severidad y fue determinado por los factores ambientales predominantes en septiembre (temperaturas de 11[grados]C, humedad relativa de 92% y humedad en la hoja de 9,6%), en el que se ubicaron los aislados B-SD y B-SK, provenientes de las variedades Sundavil y Siskiyou. El grupo II conformado por los aislados B-A y B-MG, provenientes de las variedades Alfa y Magnum respectivamente, ambos aislados fueron colectados en el mes de octubre donde las condiciones ambientales imperantes fueron, temperaturas de 10[grados] humedad relativa de 91% y humedad en la hoja de 8,9%. El comportamiento que presento el aislado B-A de la variedad Alfa era de esperarse ya que segun la casa productora de semillas, esta variedad solo posee resistencia a las razas 1 a la 5 de Bremia lactucae. El grupo III estuvo conformado por los aislados B-S y B-SM, de las variedades Sundavil y Summertime, ambos aislamientos se colectaron en el mes de octubre (periodo en el que las condiciones ambientales no fueron tan optimas para su desarrollo (temperaturas de 5,3[grados]C, humedad relativa de 74% y humedad en la hoja de 4,7%), ambas variedades son consideradas como unas de las variedades resistentes al mildiu. El grupo IV estuvo conformado por los aislados B-R y B-RR, provenientes de la variedad Rayder, solo que una fue obtenida de lote Santa Martha y la otra de Mina 5; ambos materiales presentaron el mismo grado de severidad, aunque el aislado B-R fue colectado en Septiembre, mientras que el aislado B-RR fue colectado en octubre, algo similar fue reportado por Bardin et al. (1999), al trabajar con el hongo Erysiphe cichoracearum (DC. Ex Merat) en el cultivo de melon, ellos mencionan, que el agrupamiento de la severidad se dio por la variedad. El grupo V, estuvo integrado por el aislado B-V, de la variedad Vertemar, la cual manifesto el menor grado de severidad del patogeno; al parecer este comportamiento fue influenciado por los factores ambientales predominantes del mes de octubre (temperaturas de 10[grados]C, humedad relativa de 91% y humedad en la hoja de 8,9%).

En terminos generales, los agrupamientos obtenidos en los municipios de Salamanca y San Miguel de Allende, se dieron en base a la severidad del mildiu y a los factores ambientales imperantes en los diferentes meses de muestreo, es decir, que los genotipos se comportan de acuerdo con el ambiente. Lo anterior coincide con lo senalado por Legaria et al. (2005) al estudiar variabilidad genetica de la Pitahaya, encontraron que los genotipos se distribuyen espacialmente de acuerdo con las caracteristicas del ambiente. De manera similar, McDonald et al. (1999) encontraron que unos aislados del hongo Rynchosporium secalis (Oudem) se distribuian por las condiciones ambientales. Aunque en Mexico no se han hecho estudios referentes a este tema, es importante decir que con lo observado en campo, en ambas localidades, el problema se ve incrementado porque al encontrar esta diversidad genetica implica que se presenten epidemias tempranas, lo cual repercute en perdidas considerables del cultivo y por consiguiente la dificultad de su control en campo e invernadero. La extensa variabilidad genetica de Bremia lactucae en la zona de interes podria dar margen a la identificacion de razas o grupos presentes, apoyandose con diferentes estrategias como son el uso de plantas diferenciales y una vez caracterizadas, someter los aislados al analisis molecular empleando los iniciadores que en esta investigacion resultaron mas prometedores.

La mayor parte de trabajos sobre diversidad genetica se han centrado en California (Brown et al., 2004), lugar donde se ha encontrado que Bremia lactucae es un patogeno altamente variable con un gran numero de genotipos que difieren en virulencia, estos se han encontrado en Lactuca serriola y otras especies de compuestas silvestres (Lebeda and Petrzelova, 2004). En algunos estudios realizados en Europa se ha demostrado la presencia de numerosos fenotipos virulentos (Ilot et al., 1987).

4. Conclusiones

Los aislamientos de Bremia lactucae analizados en los dendogramas, confirmaron la existencia de diversidad genetica en las variedades de lechuga cultivadas en la Region de Guanajuato. En terminos generales, los agrupamientos obtenidos se dieron con base en la severidad del mildiu y a los factores ambientales imperantes en los diferentes meses de muestreo, es decir, que los genotipos se distribuyen de acuerdo con el ambiente, se encontro que las condiciones ambientales de temperaturas de 15 [degrees]C, humedad en la hoja del 100% y humedad relativa superior al 80% favorecen la presencia de Bremia lactucae en ambos sitios de estudio.

La tecnica de ISSR permitio detectar variabilidad genetica del mildiu (Bremia lactucae), pero no asi los RAPDS. Con los ISSR, se obtuvieron bandas polimorficas, los iniciadores que proporcionaron mayor polimorfismo fueron BVD-CAG5, DBB CGA5, BDD-CAC5, BDD-CCA5, con un porcentaje de 100%, 94,1%, 100% y 100% respectivamente. El nivel de polimorfismo aqui detectado puede dar una estimacion de la alta variabilidad genetica existente entre los aislados.

[FIGURA 1 OMITIR]

[FIGURA 2 OMITIR]

[FIGURA 3 OMITIR]

DOI: 10.5261/2013.GEN2.03

Received: 11 February 2013

Accepted: 01 April 2013

Referencias

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(1) Departamento de Fitopatologia, Colegio de Postgraduados. Carretera Mexico-Texcoco, Km 36,5, Montecillo. Estado de Mexico. 56230

(2) Departamento de Edafologia, Colegio de Postgraduados. Carretera Mexico-Texcoco, Km 36,5, Montecillo. Estado de Mexico. 56230

Corresponding author: susanmm@colpos.mx; susanmm110879@yahoo.com.mx
Tabla 1. Polimorfismos obtenidos con 10 iniciadores de Inter-Secuencias
Simples Repetidas (ISSR) en los 15 aislados de Bremia lactucae

Iniciador   Numero total      Bandas       Polimorfismo (%)
              de bandas     polimorficas
DBB-[CGA]5       19              19              100
BDD-[CAC]5       17              16              94.1
BVD-[CAG]5       20              20              100
BDD-[CCA]5       19              19              100
GGAT4       No amplifico
GATA4       No amplifico
BDB-[CAC]5        7              5                71
BDV-[CAG]5        8              6                75
HVH-[TGT]5        4              1                25
CAG5              2              1                50
Total            96              88              91,6

Donde H=A, C, T; B=C, G, T; V=A, C, G; D=A, G, T
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Author:Martinez-Martinez, S.; Alarcon, A.; Urrieta-Velazquez, J.A.; Rojas-Martinez, R.I.; Ferrera-Cerrato,
Publication:Spanish Journal of Rural Development
Date:Apr 1, 2013
Words:6010
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