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Deteccion de anticuerpos sericos en toros inmunizados contra campylobacteriosis.

Resumen

En el presente ensayo se evaluo la repuesta serica vacunando 169 toros jovenes para carne, virgenes de 12-24 meses de edad, inmunizados con vacunas a celula entera de Campylobacter fetus. El trabajo se realizo en cuatro establecimientos libres de campylobacteriosis de la provincia de Buenos Aires (Argentina). Se utilizaron tres vacunas comerciales nacionales, conteniendo cepas inactivadas de C. fetus y sus subspecies: vacunas A (n= 84), B (n=19) y C (n=58) (suspension de C. fetus subsp. fetus, intermedius y venerealis, inactivadas con formol). Las vacunas A y B poseian como vehiculo hidroxido de aluminio, la vacuna C presentaba adyuvante oleoso. Tambien se utilizo una vacuna experimental (D) (n=8) dual, oleosa, elaborada por el INTA Balcarce, conteniendo antigenos inactivados de C. fetus subsp. fetus, C. fetus subsp, venerealis y Tritrichomonas foetus. Todas las vacunas se aplicaron por via subcutanea, dos dosis con intervalo de 21 dias. Los animales se sangraron a los dias 0, 21, 42, 93 y 123 post primera dosis vacunal (DPV). Los sueros fueron procesados por ELISA indirecto. Los valores de absorbancia expresados en densidad optica fueron transformados a valores ELISA (VE). La vacuna experimental dual D demostro un incremento importante en los VE de los anticuerpos sericos con respecto las vacunas A, B y C (p< 0,05). Las vacunas B y C tuvieron mejor respuesta a los 21 y 42 dias DPV respecto a la vacuna A (p< 0,05). A los 93 DPV, los animales del grupo C tuvieron un debil incremento de VE en comparacion con aquellos animales de los grupos A y B (p< 0,05). El desempeno general tendio a ser mayor en los animales inmunizados con la vacuna experimental que aquellos del grupo de vacunas comerciales. Se observaron VE muy bajos en general en las vacunas comerciales utilizadas. El metodo ELISA fue adecuado para la evaluacion de la respuesta inmune sistemica en los toros vacunados.

Palabras clave: bovino, campylobacteriosis, inmunizacion, vacunas.

Abstract

Serological response induced by whole--cell vaccines against Campylobacter fetus administered to 169 beef virgin bulls, aged from 12 to 24 months, was evaluated. The assay was performed in four Campylobacter--free beef cattle farms from Buenos Aires, Argentina. Three commercial national inactivated vaccines against C. fetus were used. Vaccines A (n= 84), B (n=19) and C (n=58) contained C. fetus subsp, fetus, intermedius and venerealis antigens. Adjuvant in vaccines A and B was aluminum hydroxide, whereas vaccine C contained an oil--based adjuvant. An experimental vaccine (D) (n=8) containing C. fetus subsp, fetus, C. fetus subsp, venerealis and Tritrichomonas foetus inactivated antigens in an oil--based adjuvant developed at INTA Balcarce was also used. Bulls were vaccinated twice subcutaneously at three--week intervals. Blood samples were collected at 0, 21, 42, 93, and 123 days after first vaccine dose (FVD). Indirect ELISA was used to detect systemic C. fetus antibodies. Optical densities of the samples were converted to ELISA values (EV). Bulls of group D showed high EV values, with the highest systemic immune response compared to animals of groups A, B and C (p< 0.05), during all the sampling period. EV from animals injected with vaccines A, B, and C demonstrated a better performance compared to vaccine A (p< 0.05). At 93 days FVD, animals of group C had a lower increment of EV in comparison to those of groups A and B (p< 0.05). Immunization performance tended to be better in experimental rather than commercial vaccines, the later producing very low EV values. The ELISA method was adequate for the evaluation of the systemic immune response in vaccinated bulls.

Key words: cattle, campylobacteriosis, immunization, vaccine.

Sera antibodies detection in bulls immunized against campylobacteriosis

INTRODUCCION

Las perdidas gestacionales en bovinos son causadas por una variedad de agentes infecciosos que afectan a la economia de productores de todo el mundo (4, 5,7, 15). La campylobacteriosis genital bovina permanece como problema en rodeos para carne y leche de numerosos paises (6,16, 18). La enfermedad causa muerte del embrion, abortos y reduccion de la fertilidad en bovinos (7, 16). Campylobacter fetus tiene dos subespecies conocidas, C. fetus subsp, venerealis (con tropismo genital exclusivo, solo se transmite por via venerea) y C. fetus subsp, fetus (reside en el tracto intestinal de bovinos/ovinos y puede ocasionalmente encontrarse en la cavidad prepucial del toro por contaminacion fecal) (16). Existe ademas una variedad tolerante a la glicina denominada C. fetus subsp, venerealis biovar, intermedius; dicha tolerancia es debida a mutacion o transduccion de material genetico (19, 24).

La diferenciacion de las subespecies se basa en la caracterizacion fenotipica y genotipica. Las vaquillonas virgenes son muy susceptibles a la infeccion, desarrollando endometritis, mortalidad embrionaria temprana y abortos en la mitad de la gestacion (7, 9, 23). Trabajos realizados por nuestro grupo permitieron identificar el rol que le cabe a C. fetus subsp, fetus como el agente mas frecuentemente aislado de fetos abortados por campylobacteriosis en bovinos de la region (7).

Es importante el desarrollo de vacunas para el control de las enfermedades de transmision sexual en bovinos. La campylobacteriosis en los toros es cronica, subclinica, cursa sin afectar su libido ni fertilidad y es mas frecuente en toros adultos y viejos (5, 9). La vacunacion sistemica en toros arrojo resultados promisorios (3, 20). Diferentes trabajos realizados sobre vacunacion en hembras mostraron resultados satisfactorios (14). Otros autores evidenciaron el rol de los anticuerpos protectores contra este organismo (2, 20). Las vacunas deben contener cepas autoctonas antigenicamente aptas; su importancia radica en que eliminan el estado de portador de la hembra (1). Si bien existen vacunas nacionales e importadas para la profilaxis de la campylobacteriosis tanto para hembras como machos, la informacion sobre la eficiencia de estas vacunas a nivel nacional es escasa (8) no existiendo informacion actualizada sobre la respuesta humoral a la vacunacion en toros.

El objetivo de este trabajo fue evaluar en toros el comportamiento humoral de algunas vacunas comerciales y una vacuna experimental contra la campylobacteriosis.

MATERIAL Y METODOS

Animales, vacunaciones y muestreos. El ensayo se realizo en cuatro establecimientos libres de campylobacteriosis ubicados en el sudeste de la Provincia de Buenos Aires (Argentina) durante los anos 2003-2005. Se utilizaron 169 toros virgenes, de 12 a 24 meses de edad, de razas Aberdeen Angus y Hereford, clinicamente aptos. Los animales mantuvieron muy buena condicion corporal (6-7) durante todo el ensayo. Se utilizaron tres vacunas comerciales nacionales inactivadas, conteniendo cepas de C. fetus y sus subspecies. A continuacion se detalla la composicion de las vacunas segun lo descripto en los marbetes comerciales al momento de su empleo: vacuna A (Campy 3, Laboratorio Rosenbusch, Serie: 07/02, dosis: 2 ml subcutanea, composicion: C. fetus subsp, fetus, intermedius y venerealis, inactivadas con formol en vehiculo de hidroxido de aluminio), vacuna B (Vibriosan, Laboratorio Sanidad Ganadera, Serie 2306, dosis: 3 ml subcutanea, suspension de C. fetus subs. fetus, intermedius y venerealis, inactivadas con formol en gel de hidroxido de aluminio como adyuvante), vacuna C (Campylobacter 40, Laboratorio Centro Diagnostico Veterinario SA, Serie 003, dosis: 5 ml subcutanea, composicion: 40 mg por dosis de C. fetus subsp, fetus, intermedius y venerealis, inactivados y con adyuvante oleoso Marcol 52, Arlacel C y Tween 80). Finalmente, se uso la vacuna D dual experimental, oleosa (Marcol 52, Span 80) (40% aceite, 60% antigeno en fase acuosa), inactivado, elaborada en el INTA Balcarce con cepas de C. fetus subsp. fetus, C. fetus subs. venerealis (30 mg peso seco de antigeno de C. fetus x dosis vacunal) y T. foetus (Campero et al., sin publicar). En todos los casos, las vacunas se aplicaron mediante dos dosis por via subcutanea en el lado izquierdo de la tabla del cuello, con intervalo de 21 dias y en volumenes segun indicaciones de los elaboradores (Tabla 1). Las vacunas comerciales fueron adquiridas directamente de veterinarias de la zona. Se realizaron muestreos sanguineos, a saber: a los dias 0, 21, 42, 93 y 123 post primera dosis vacunal (DPV). Los sueros se mantuvieron a -20[grados]C hasta el momento de su uso.

Test de ELISA. Los sueros fueron analizados mediante el test de ELISA indirecto segun lo descripto por Hum et al. (18) con minimas modificaciones (12). El antigeno utilizado fue obtenido mediante sonicacion de cultivos liquidos de C. fetus subsp, venerealis, C. fetus subsp, venerealis biotipo intermedius y C. fetus subsp. fetus, cepas tipificadas por pruebas bioquimicas, PCR y AFLP. Las placas de poliestireno (Immulon 1B x 96 pocillos) fueron sensibilizadas con los antigenos especificos previamente mencionados y adicionados los sueros problemas y los sueros controles positivos y negativos respectivos, previamente diluidos (dilucion optima previa titulada 1:500) en solucion salina bufferada (SSB) con 0.05% de Tween 20 y gelatina al 0,2% (SSB-TwG). Las placas se lavaron con SSB--TwG (x3). Luego se utilizo antisuero IgG bovina conjugado con peroxidasa (Whole IgG rabbit anti--bovine, Sigma, St. Louis, Mo, USA) a la dilucion optima de 1:2000 en SSB--TwG. Se empleo como cromogeno el acido 5--aminosalicilico haciendo la lectura de las placas en un espectrofotometro (Multiskan Thermo Labsystem, Finlandia) a traves de un filtro de 450 nm.

Analisis estadistico. Se utilizo el limite confianza del 95% (p<0,05). Los valores de absorbancia expresados en densidad optica fueron transformados a valores ELISA (VE) cuyos promedios se graficaron. Los datos promedios de los VE fueron analizados mediante test de varianza para medidas repetidas en el tiempo utilizando el procedimiento MIXED del SAS (13, 21).

[FIGURA 1 OMITIR]

RESULTADOS

Los resultados de la serologia se expresaron como VE (Figura 1). Se observo que las vacunas B y C tuvieron mejor respuesta a los 21 y 42 dias post primera dosis vacunal (DPV) respecto a la vacuna A. Por su parte, la vacuna experimental dual D demostro un incremento en los anticuerpos sericos, persistiendo los mismos elevados en los sucesivos muestreos, respecto al resto de las vacunas (p< 0,05). Con esta vacuna experimental se observo una diferencia muy elevada con respecto a los VE obtenidos ya a los 42 DPV, llegando a valores proximos al maximo luego de la aplicacion de la segunda dosis y persistiendo hasta el final del ensayo Las vacunas B y C tuvieron mejor respuesta a los 21 y 70 DPV con respecto a la vacuna A (p< 0,05). Se observo una mayor persistencia de titulos vacunales a los 110 DPV en los animales inmunizados con la vacuna C con respecto a los vacunados con A y B (p< 0,05).

DISCUSION

Este estudio senala la produccion de anticuerpos sericos medidos por el metodo de Elisa indirecto en toros vacunados por via sistemica con vacunas comerciales y una vacuna experimental, inactivadas y especificas, contra campylobacteriosis. Nuestro grupo ha participado en forma activa en los ultimos anos mediante ensayos en el medio para demostrar la eficacia de algunas vacunas comerciales contra campylobacteriosis en vaquillonas. En un trabajo previo efectuado en vaquillonas, se demostro que las vacunas comerciales se comportaron de manera similar y originaron un menor nivel de anticuerpos comparados con una vacuna experimental (8).

Ensayos realizados por nuestro grupo con dos vacunas polivalentes comerciales (C. fetus fetus y venerealis, Leptospira pomona, virus IBR-BVD, H somnus) en vaquillonas naturalmente desafiadas por servicio con toro infectado, confirmaron que ni las vaquillonas vacunadas ni los animales controles tuvieron un importante incremento en los niveles de anticuerpos sistemicos (12). Si bien el numero de animales utilizados fue bajo y el periodo de servicio corto, estos resultados sugieren una pobre inmunidad generada con este tipo de vacunas. Otros trabajos efectuados con vacunas duales experimentales elaboradas por nuestro grupo permitieron confirmar una adecuada respuesta serica a C. fetus medida por Elisa (Campero et al. sin publicar) (13). Los ensayos de vacunacion en toros en nuestro medio los hicimos con una vacuna experimental en la decada de 1980 sin existir trabajos actualizados (20).

El toro transmite y difunde la campylobacteriosis por el servicio natural o a traves de la inseminacion artificial con semen infectado (15). La curacion espontanea de toros jovenes infectados suele ocurrir aunque el fenomeno es mas raro en toros adultos (9,16) pudiendo atribuirse al escaso desarrollo de las criptas prepuciales (5). Dado que C. fetus no es invasor tisular a nivel prepucial ni peniano, la respuesta inmune local es escasa y por ende, la infeccion suele ser cronica, especialmente en toros de [mayor que o igual a] 4 anos de edad (5). La inmunizacion sistemica contra C. fetus estimula la produccion de anticuerpos sericos y locales hacia antigenos de superficie del organismo (1,22). Las vacunas oleosas estimulan una solida respuesta sistemica a la IgG1 e IgG2 y tambien similares anticuerpos en la vagina y utero (14). Es por ello que se asume que la inmunizacion parenteral es importante para evitar la infeccion (10.11), perdidas reproductivas (8) y aun podra curar la infeccion en hembras (22).

En el presente trabajo, el empleo de 3 vacunas comerciales (dos con vehiculo en hidroxido de aluminio y la tercera en vehiculo oleoso) aplicadas en forma sistemica no incrementaron en forma marcada los anticuerpos sistemicos. Considerando el bajo numero de animales utilizados y la falta de los desafios intraprepuciales con cepas activas de C. fetus, hace que solamente podamos juzgar en forma parcial los resultados obtenidos. Por ende, no se pretende con este trabajo ni validar ni invalidar ninguno de los productos comerciales/experimental empleados. Si bien la inmunidad local a nivel prepucial no se determino en este trabajo, la inmunidad sistemica estimulada por las vacunas comerciales analizadas no tuvo una adecuada respuesta serica.

La menor antigenicidad de las vacunas comerciales frente a la vacuna experimental dual elaborada por el INTA Balcarce, se deberia probablemente a la calidad y cantidad de antigeno en su composicion. El efecto del adyuvante oleoso resulta de interes dado que las dos vacunas oleosas (C comercial y D experimental) tuvieron los mayores VE promedios con respecto a las otras dos vacunas comerciales. Sin embargo, se desconoce si dichos titulos son suficientemente protectores para prevenir la enfermedad. El inconveniente de los adyuvantes oleosos (usualmente se suele utilizar la combinacion de Marcol 52, Arlacel C y Tween 80) en vacunas para bovinos suele ser la presencia de diferentes grados de granulomas locales en el area de aplicacion (3x4 cm) y la mayor probabilidad que se presenten fenomenos de anafilaxia post vacunacion.

La vacuna B actualmente se elabora con adyuvante oleoso (Vibriosan oleoso) con similar composicion de subespecies de C. fetus mencionadas previamente, por lo que seria de esperar una mejor respuesta antigenica motivada por el cambio de adyuvante, mientras que la vacuna C actualmente sigue teniendo vehiculo oleoso pero posee solo dos subespecies de C. fetus en su composicion. Trabajos previos utilizando el hidroxido de aluminio evidenciaron que el mismo induce una inmunidad menos duradera y deberia ser administrado como maximo a los 10-15 dias previos al servicio (1).

Las vacunas A y B no mencionan la cantidad de antigeno (mg de masa antigenica) en sus formulaciones comerciales. Trabajos previos con vacunas comerciales mono o trivalentes a C. fetus tuvieron pobre desempeno en vaquillonas porque no fueron elaboradas con cepas regionales (8). Existen referencias sobre los escasos resultados al vacunar toros cronicamente infectados pese a que fueron vacunados en dos ocasiones y tuvieron altos titulos sericos por ELISA (17). La presencia de un peso seco antigenico minimo es de importancia al evaluar una vacuna (11). Trabajos experimentales en vacunas contra campylobacteriosis comprobaron que 40 mg de antigeno por dosis en vehiculo oleoso generaron buena proteccion contra infecciones genitales en hembras (8, 11). La seleccion de cepas aptas de C. fetus para la elaboracion de vacunas es primordial para una buena inmunidad.

El test de ELISA indirecto usado es una buena herramienta para medir la respuesta inmune sistemica en bovinos vacunados con C. fetus. La insuficiente informacion especifica provista por algunos elaboradores y la ausencia de ensayos en bovinos crea un cierto grado de escepticismo sobre la eficacia de dichas vacunas en bovinos desafiados o su empleo en rodeos infectados con campylobacteriosis. Se necesitan otros trabajos ampliatorios que aporten informacion adicional para establecer la efectividad de las vacunas comerciales en condiciones de infeccion natural.

Agradecimientos. Nuestro sincero agradecimiento a los propietarios y al personal de campo de los establecimientos Flores Chicas y La Cerradilla por su importante apoyo para realizar parte de este ensayo. A personal auxiliar de las reservas ganaderas 6 y 7 del INTA Balcarce por su apoyo en las tareas de muestreo de los animales.

Recibido: 5 febrero 2010 / Aceptado: 12 marzo 2010

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[1] Grupo de Sanidad Animal, Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria, INTA, Casilla de Correo 276, Balcarce (7620), Argentina. Weterinario actividad privada.

E-mail: ccampero@balcarce.inta.gov.ar
Tabla 1. Tipo de vacuna, adyuvantes, dosis y numero de
animales.

vacuna y adyuvante dosis (ml) n establecimiento

A Campy 3 OHAI 2 84 Reservas 6 y 7, INTA
B Vibriosan OHAI 3 19 Cabana "Flores Chicas"
C Campy 40 oleosa 5 58 Cabana "La Cerradilla"
D Dual oleosa Inta 8 8 Reserva 6, INTA

total 169
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Author:Campero, C.M.; Morrell, E.; Morsella, C.; Paolicchi, F.; Cano, D.; Lazaro, L.
Publication:Revista Veterinaria
Date:Jul 1, 2010
Words:3614
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