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Deteccion, identificacion y localizacion geografica de Begomovirus que afectan al tomate en Colombia.

Detection, identification and geographical localization of tomato-infecting Begomovirus in Colombia

Introduccion

Los Begomovirus pertenecen a la Familia Geminiviridae, y su genoma esta constituido por una o dos moleculas de ADN circular de cadena sencilla, son diseminados por la mosca blanca (Bemisia tabacci Genn. biotipo B) a plantas dicotiledoneas y replican su genoma en el nucleo de sus hospederos por un mecanismo de circulo rodante. Este hecho hace de estos virus un excelente modelo para estudiar muchos de los fenomenos moleculares que se verifican en plantas. El nombre de geminivirus proviene de la morfologia de su particula viral la cual, vista al microscopio electronico, se asemeja a dos poliedros fusionados por una de sus caras.

En la actualidad, los Begomovirus son considerados como la mayor amenaza para los cultivos de interes agricola ubicados en las zonas tropicales y templadas del planeta en donde se han registrado sensibles perdidas en cultivos de frijol, yuca, algodon, tabaco, aji, cucurbitaceas y solanaceas a causa de este virus (Seal et al., 2006).

El tomate (Solanum lycopersicum L) es la hortaliza mas difundida en todo el mundo y la de mayor valor economico. Las investigaciones de Polston y Anderson (1997) y Ribeiro et al. (2003) dejan entrever que el cultivo del tomate en Latinoamerica ha sido fuertemente afectado por virosis causadas principalmente por Begomovirus. Morales et al. (2002), advierten de la creciente amenaza que este tipo de virus genera para la agroindustria tomatera del pais, debido a que esta solanacea parece ser una especie particularmente susceptible a este grupo de fitopatogenos. En Colombia se han realizado escasos estudios sobre los Begomovirus que afectan el tomate. Se cuenta a la fecha con la caracterizacion parcial de un Begomovirus aislado en el Valle del Cauca, cuyo nombre propuesto es el de virus del mosaico amarillo del tomate (Martinez et al., 2008; Morales et al., 2002).

El objetivo de esta investigacion fue la deteccion, identificacion y ubicacion geografica de los Begomovirus que afectan los cultivos de tomate en las principales zonas productoras de Colombia. Este estudio es el primer paso de una serie que en principio busca conocer la identidad molecular de este grupo de fitopatogenos y el empleo de esta informacion para implementar programas de mejoramiento genetico tendientes a buscar materiales de tomate resistentes a estos virus.

Materiales y metodos

Recoleccion del material vegetal. La recoleccion de material vegetal se realizo en las principales zonas productoras de tomate ubicadas en los departamentos de Cundinamarca, Santander, Valle, Boyaca y Antioquia. El muestreo en campo se llevo a cabo mediante la recoleccion de hojas jovenes de plantas de tomate que presentaban sintomas tipicos de la enfermedad begomoviral tales como: enanismo, mosaicos amarillo brillante, moteados cloroticos, clorosis foliar marginal, enrollamiento foliar, deformaciones foliares y arrugamientos de las hojas (Polston y Anderson, 1997; Nava et al. 2006). Asimismo, fueron registrados los datos de ubicacion satelital del sitio de recoleccion de muestras vegetales mediante el uso de un equipo de GPS-CSX-60 (Garmin[R]) con barometro, esta ultima herramienta es util tambien para tomar los datos de altura del cultivo en metros sobre el nivel del mar. Las muestras colectadas en campo fueron llevadas al laboratorio en donde se almacenaron a -70[grados]C para su analisis posterior.

Extraccion de acidos nucleicos. A partir del tejido vegetal (hojas) previamente recolectado en campo y almacenado a -70[grados]C, se aislo el ADN total empleando dos estrategias metodologicas: el protocolo propuesto por Dellaporta et al. (1983) y el DNeasy Plant Kit (QIAGEN[R]), siguiendo para ello las instrucciones del fabricante. A fin de verificar la calidad y cantidad de los ADN totales extraidos, se realizo una electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (p/v) siguiendo los protocolos descritos por Sambrook et al. (2001).

Hibridacion de acidos nucleicos tipo Dot blot. La hibridacion de acidos nucleicos se llevo a cabo siguiendo una estrategia no radiactiva, utilizando el kit Gene Images AlkPhos Direct Labelling and Detection System (Amersham-Pharmacia Biotech[R]). Para ello, 5 [micron]l de ADN (1 [micron]g/[micron]l) de cada muestra problema se colocaron sobre una membrana de Nylon Hybond (+) (Amersham[R]). Con el fin de unir el ADN a la membrana, esta se coloco a 80[grados]C por 2 h en un horno de prehibridacion (Problot 12S Hybridization Oven LabNet[R]). La sonda de ADN utilizada para la hibridacion corresponde a un fragmento del gen de la proteina de la capside (CP) del virus huasteco de Chile (PHYVV), facilitado por el doctor Rafael Rivera Bustamante (Cinvestav-IPN, Mexico). El marcaje de la sonda fue realizado con el kit Gene Images AlkPhos Direct Labelling (Amersham-Pharmacia Biotech[R]) siguiendo las instrucciones del fabricante. El proceso de hibridacion se realizo a 55[grados]C durante toda la noche en una solucion de hibridacion AlkPhos Direct (Amersham-Pharmacia Biotech[R]) en un horno de hibridacion (Problot 12S Hybridization Oven LabNet[R]). Los lavados poshibridacion se realizaron como sigue: dos lavados a 55[grados]C de 10 min cada uno en una solucion de lavado primario (Urea 2M, 0,1% SDS, 50 mM fosfato de sodio pH 7,0, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2 y 0,2% de reactivo de bloqueo), y dos lavados a temperatura ambiente por 5 min cada uno en una solucion de lavado secundario (Tris base 50 mM, NaCl 100 mM y 2 mM MgCl2). La generacion de la senal quimiofluorescente se realizo con el sustrato ECF siguiendo las instrucciones del fabricante (Amersham-Pharmacia Biotech[R]), y la deteccion de la senal fluorescente se llevo a cabo en el equipo Molecular Imager[R] Gel Doc[TM] XR System (Biorad[R]).

Reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). Para implementar la estrategia de PCR se siguio la metodologia propuesta por Rojas et al. (1993), empleando los primers PAL1v1978/ PARc496 y PBL1v2040/ PCRc1, que amplifican un fragmento de 1100 pb del componente ADN-A, y un fragmento de 600 pb del componente ADN-B, respectivamente. La reaccion de PCR se llevo a cabo en un volumen de 25 [micron]l empleando un termociclador Biorad[R] modelo C100. Los fragmentos amplificados fueron visualizados en un gel de agarosa al 0,8% (p/v).

[FIGURA 1 OMITIR]

Resultados y discusion

Con el fin de contar con un panorama nacional de los Begomovirus (Familia Geminiviridae) que estaban afectando cultivos de tomate en el pais, se realizo una colecta en los principales departamentos productores de esta solanacea. Mediante este muestreo en la region andina de Colombia se evidencio la presencia de sintomas virales tipicos de la infeccion por geminivirus en plantas de tomate cultivadas tanto en invernadero como a cielo abierto de los departamentos de Boyaca, Cundinamarca, Antioquia, Valle del Cauca y Santander (figura 1). Asimismo, fue evidente la presencia de mosca blanca Bemisia tabaci en la mayoria de los cultivos de tomate (figura 2c), asi como el uso indiscriminado de pesticidas para el control de la misma. Estos ultimos utilizados con el fin de eliminar la mosca blanca, una vez que el agricultor observaba sintomas de virus. Es importante mencionar que en los cultivos de Boyaca y Antioquia se observaron sintomas leves de virosis, en especial no se observaron mosaicos y clorosis generalizados. La sintomatologia observada en el Valle fue muy similar a la encontrada en Cundinamarca y en algunas zonas de Santander (figura 2b). Es importante mencionar que en algunas localidades de Santander se observo una sintomatologia acentuada de clorosis y mosaicos, acompanados de una coloracion amarilla fluorescente intensa (figura 2d). En total se colectaron 74 muestras prevenientes de 74 fincas o veredas localizadas en 5 departamentos (Boyaca, Cundinamarca, Antioquia, Valle del Cauca y Santander), ubicados entre los 655 a 2184 msnm (tabla 1).

[FIGURA 2 OMITIR]

Una primera aproximacion para determinar la presencia de Begomovirus en las muestras recolectadas en campo fue la implementacion de la tecnica de hibridizacion de acidos nucleicos (NAH) tipo Dot Blot. Esta estrategia permite analizar grandes cantidades de muestras sospechosas de estar infectadas por un virus particular empleando una sonda o fragmento de ADN conservado que permite identificar de manera especifica un unico genero o familia viral particular. En este caso, la metodologia de NAH permitio evidenciar la presencia de Begomovirus pertenecientes a la Familia Geminiviridae en todas las muestras analizadas, encontrandose mayor intensidad de la senal en aquellas provenientes de Valle, Cundinamarca y Santander. Vale la pena destacar que la tecnica Dot Blot se rige por el principio del todo o nada, es decir, hay o no hay presencia de una entidad viral particular, dada la alta sensibilidad de esta prueba (figura 3 y tabla 1).

Para confirmar los resultados obtenidos por medio NAH tipo Dot blot se implemento la estrategia de PCR utilizando primers o cebadores degenerados que amplifican regiones conservadas presentes en todos los Begomovirus bipartitas del hemisferio occidental (Rojas et al., 1993). Los iniciadores utilizados amplificaron productos de PCR de los tamanos esperados de 1200 y 500 pb, correspondientes a los genomas begomovirales A y B respectivamente (figura 4). Mediante este enfoque se confirmo la presencia de Begomovirus bipartitas en muestras vegetales de tomate recolectadas en campo en los departamentos de Valle (municipios de Palmira, Pradera, Tulua, Caicedonia y Barragan), Cundinamarca (municipios de Silvania y Pasca) y Santander (municipios de Pie de Cuesta, Giron, Cepita, San Gil, Berlin y Socorro) (tabla 1). Antioquia y Boyaca no presentaron muestras positivas para Begomovirus por esta tecnica (PCR), sin embargo, estas si fueron positivas por estrategia de NAH tipo Dot blot. Esto puede estar relacionado con la concentracion del virus en la planta en el momento en que se realizo la recoleccion, hecho que a su vez esta intimamente relacionado con el estado del ciclo infectivo del geminivirus. Es decir, la sensibilidad del NAH tipo Dot Blot es mayor e independiente del estado del ciclo infectivo del virus, pues detecta el geminivirus este replicandose o no. Mientras que la PCR requiere que haya abundantes copias del genoma viral que permitan amplificar un fragmento de ADN de un tamano esperado (Potter et al., 2003).

[FIGURA 3 OMITIR]

Asimismo, se pudo evidenciar que hubo una relacion directa entre aquellas muestras de tomate recolectadas en campo que presentaban sintomatologia tipica, con aquellas que fueron positivas para la presencia de Begomovirus, diagnosticadas empleando estrategias moleculares (Dot Blot y PCR). Es decir, que en aquellas zonas del pais en que hubo pocas evidencias de sintomatologia viral, como lo fueron las muestras de Antioquia y Boyaca, se detectaron algunas muestras positivas, mientras que en Santander, en donde se evidencio una alta presencia de sintomas virales, fue donde mayor numero de muestras positivas se diagnosticaron.

[FIGURA 4 OMITIR]

Teniendo en cuenta que los Geminivirus no son transmitidos por semilla, su deteccion en pisos altitudinales superiores a los 1300 msnm (limite superior reportado en Colombia para Bemisia tabaci) puede explicarse por dos hechos: primero, porque este insecto esta colonizando en altura nuevos nichos agroecologicos, situacion posiblemente asociada al fenomeno del calentamiento global que en este momento esta sufriendo el planeta. Por otra parte, puede explicarse por actividades derivadas de la plantulacion del material vegetal de tomate, practica que puede contribuir sin saberlo a diseminar material contaminado con estos virus a zonas en altura en donde estas entidades virales no se encontraban antes. Si a eso le agregamos la colonizacion en altura que las poblaciones de mosca blanca parecen estar logrando en este momento en Colombia, la situacion se agrava, pues se podrian estar dando las condiciones para que los Begomovirus, con el concurso de su ampliamente polifago vector biologico (la mosca blanca) se disemine y afecte no solo al tomate sino a otros cultivos cercanos que estan presentes en ese piso altitudinal particular. No sobra recordar que los Geminivirus son considerados hoy en dia como la principal amenaza viral de los cultivos de interes economico ubicados en zonas tropicales y subtropicales del planeta (Seal et al., 2006).

Es interesante resaltar que algunos materiales de tomate recolectados en campo y que aparentemente eran asintomaticos para enfermedad viral arrojaron resultados positivos a Begomovirus al ser analizados por medio de las estrategias moleculares. Este hecho pone de relieve la importancia creciente que el diagnostico molecular de virus vegetales tiene hoy en dia a nivel mundial. El caso concreto del diagnostico de entidades begomovirales empleando un enfoque molecular es un excelente ejemplo de esta tendencia. Durante muchos anos se uso la proteina de la capside de los geminivirus para desarrollar anticuerpos monoclonales, los cuales eran utilizados para diagnosticar la presencia de este tipo de virus en plantas, empleando enfoques serologicos tales como la tecnica Elisa. Sin embargo, la gran cantidad de motivos de aminoacidos comunes que comparten las proteinas de las capsides de los geminivirus condujo en muchas ocasiones a reacciones cruzadas que impedian al investigador determinar con certeza que geminivirus era el agente causal de una patologia vegetal particular; asimismo, se dieron casos en que, dada la baja concentracion del virus en un tejido vegetal particular, era imposible detectarlo con este tipo de estrategia (Harrison et al., 2002). Por esta razon, en los ultimos anos se hizo necesario que el diagnostico de geminivirus fundamentado en estrategias serologicas diera paso a un sistema basado en las caracteristicas intimas del propio genoma del virus, es decir, al diagnostico molecular, el cual es mas sensible, confiable y ademas permite establecer no solo la identidad viral exacta sino tambien posibilita el establecimiento de las relaciones filogeneticas del virus con otros ya reportados previamente.

Conclusiones

Los resultados obtenidos demuestran que hay Begomovirus pertenecientes a la Familia Geminiviridae que afectan los cultivos de tomate en diferentes zonas geograficas de Colombia ubicadas entre los 655 a 2184 msnm. Con la excepcion de un reporte previo de Begomovirus en el Valle del Cauca (Martinez et al., 2008), esta es la primera vez que se diagnostica la presencia de Begomovirus afectando el cultivo de tomate en Antioquia, Santander, Boyaca y Cundinamarca. Asimismo, en todas las zonas en donde se recolecto material vegetal de tomate se evidencio la presencia de la mosca blanca (Bemisia tabaci), el vector biologico de los Begomovirus. Para los cultivadores de tomate en Colombia este hecho es preocupante, si se tiene en cuenta que las muestras vegetales fueron recolectadas en sitios ubicados por encima de los 1300 msnm, limite superior reportado para este insecto (por ejemplo, a 2184 msnm en el municipio de Silvania, Cundinamarca). Es posible que el cambio climatico mundial este facilitando de alguna manera la conquista de nuevos nichos por Bemisia tabaci lo conllevaria que los Begomovirus que estos transmiten logren afectar a su vez nuevos cultivos ubicados en esos pisos altitudinales. Esta circunstancia es preocupante por la carencia total de material de tomate resistente al ataque de los Begomovirus en el pais. El diagnostico molecular de Geminivirus es una estrategia que ademas de sensible y confiable permite establecer no solo la identidad viral exacta sino tambien posibilita el establecimiento de las relaciones filogeneticas del virus con otros ya reportados previamente. En este sentido, nuestro equipo de trabajo esta llevando a cabo estudios adicionales a nivel molecular tendientes a determinar especificamente la identidad molecular de los Begomovirus endemicos que estan afectando el cultivo de tomate en Colombia, asi como sus relaciones evolutivas con otros que estan afectando al tomate en otras latitudes del mundo.

Agradecimientos

El presente proyecto de investigacion fue financiado con recursos del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia, contrato 134-2008N6396-3460, Defrescura S.A. y la Universidad Nacional de Colombia.

Los autores agradecen el apoyo recibido para realizar las colectas de los materiales vegetales a nivel nacional a las empresas DeFrescura S.A. y Agroindustrial de Semillas S. A. Al doctor Rafael Rivera Bustamante de Cinvestav-IPN, Mexico, por haber facilitado gentilmente la sonda de ADN utilizada para realizar la hibridacion de acidos nucleicos. Betancurt J. agradece a Colciencias la beca recibida para realizar estudios de doctorado en Ciencias Agropecuarias. A Kerly Motta, por el apoyo en la elaboracion de los mapas de las zonas de muestreo con datos satelitales.

Referencias bibliograficas

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Martinez, A. K., Morales, F. J., Vallejo, C. F. A. 2008. Caracterizacion molecular de un begomovirus del tomate en el Valle del Cauca, Colombia, y busqueda de fuentes de resistencia para el mejoramiento de la variedad Unapal Maravilla. Acta Agron., 57 (3).

Morales, F. J., Martinez, A. K. Velasco, A. C. 2002. Nuevos brotes de geminivirus en Colombia. Fitopatologia Colombiana, 26: 76-78.

Nava, A., Patte, P., Hiebert, E., Polston, J. 2006. Detection and Variability of begomoviruses in tomato from the Andean states of Venezuela. Plant Dis., 90: 61-66.

Polston, J. E., Anderson, P. K. 1997. The emergence of whitefly-transmited geminivirus in tomato in the western hemisphere. Plant Dis., 81: 1358-1369.

Potter, J. L., Nakhla, M. K., Mejia, L., Maxwell, D. P. 2003. PCR and DNA hybridization methods for specific detection of bean-infected begomovirus in Americas and Caribean. Plant. Dis. 87: 1205-1212.

Riveiro, S., Ambrozevicious, L. P., Avila, A., Becerra, I. C., Calegario, R., Fernandez, J. J. et al. 2003. Distribution and genetic diversity of tomato-infecting Begomovirus in Brazil. Arch. Virol., 148:281-295.

Rojas, M. R., Gilbertson, R. L., Ruseel, D. R., Maxwell, D. P. 1993. Use of generate oligonucleotidos in the polymerase chain reaction to detect whitefly-transmitted geminivirus. Plant disease, 77: 340-347.

Sambrook, J., Russell, D. 2001. Molecular Cloning. A laboratory Manual. 3 ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory.

Seal, S. E., van den Bosch, F., Jeger, M. J. 2006. Factors Influencing Begomovirus Evolution and Their Increasing Global Significance: Implications for Sustainable Control. Crit. Rev. Plant. Sci. 25: 1-23.

Juan Carlos Vaca-Vaca, M.Sc. Profesor, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia, Sede Palmira. jcvacava@unal.edu.co

Jhon Fredy Betancurt-Perez, Estudiante de doctorado, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia, Sede Palmira. Fredy.betancur@gmail.com

Karina Lopez-Lopez, Ph.D., Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia, Sede Palmira. klopezl@unal.edu.co
Tabla 1. Sitios de recoleccion de material vegetal de tomate
distribuidos en las principales zonas productoras de tomate
en Colombia y resultados positivos para Begomovirus
obtenidos por Dot blot y PCR. Los analisis moleculares de
Dot blot y PCR se realizaron como se describe en la
metodologia.

Departamento    Localidad         Altitud        No.       Resultado
                                   (msnm)      fincas
                                                          Dot    PCR
                                                          Blot

Santander       Lebrija          1031-1119        6        6      0
                Pie de Cuesta    1151-1632        9        9      5
                Giron               1151          2        2      1
                Cepita              655           1        1      1
                San Gil             1163          1        1      1
                Berlin              1037          1        1      1
                Socorro          1029 1 164       6        6      6
Antioquia       Penol            2172- 2178       6        6      0
                Carmen de           2182          1        1      0
                  Viboral
                Jerico           1822 -1988      10        10     0

Boyaca          Sutamarchan         2110          2        2      0
                Santa Sofia      2160-2386        3        3      0

Cundinamarca    Fomeque          2000 -2096      10        10     0
                Silvania         1845--2184       5        5      5
                Pasca               1945                          1

Valle           Guacari             1002                          0
                Darien-Calima       1510                          0
                Darien              1610                          0
                Cerrito             1038                          0
                Pradera             1146                          1
                Tulua               978                           1
                Caicedonia          1200                          1
                Barragan            1157                          1
                Palmira             978           2        2      2

5               24 localidades    655-2184    74 fincas    74    27
departamentos                       msnm
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Title Annotation:ARTICULO DE INVESTIGACION
Author:Vaca-Vaca, Juan Carlos; Betancurt-Perez, Jhon Fredy; Lopez-Lopez, Karina
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Jul 1, 2011
Words:3374
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