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Desempeno de dos tecnicas de rompimiento celular en la caracterizacion de ficobiliproteinas en la microalga scenedesmus sp.

Performance of two techniques the cell breaking in the phycobilins characterization in microalgae scenedesmus sp.

1. Introduccion

El grupo de las microalgas son un grupo heterogeneo de organismos fotosinteticos procariontes (Ciano-bacterias y verdes-azules) y eucarionte (Algas Verdes) presentan gran diversidad de especies, formas y tamanos unicelulares. Unas de las ventajas de estas especies son la rapida capacidad fisiologica de adaptacion a diferentes fluctuaciones medio ambientales en sus nichos ecologicos (por ejemplo, los cambios de salinidad, temperatura, nutrientes, irradiacion UV-VIS), para sobrevivir en ambiente competitivos, las microalgas han desarrollado estrategias de defensa por medio de una gran diversidad de compuestos con estructura quimica complejas a partir de diferentes rutas metabolicas (Puglisi et al. 2004), del metabolismo primario y secundario (Fig. 1) que no se encuentran en otro tipo de organismos (Plaza et al. 2008).

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La rutas del metabolismo secundario son de distribucion restringida, mientras que para metabolismo primario proporciona productos intermedios para la sintesis de macromoleculas esenciales (proteinas, lipidos carbohidratos y fibras). Aunque, las investigaciones sobre los productos de las microalgas estan actualmente en bastante auge, los estudios en biosintesis y rutas son escasos, principalmente cuando se trata con el metabolismo secundario. La gran diversidad de productos derivados presenta numerosas modificaciones y combinaciones, debidas a las reacciones incluidas en las rutas metabolicas primarias y secundarias (Fig. 1). Sin embargo, con la aparicion de herramientas como biologia molecular, metabolomica, bioprospeccion y bioinformatica han resuelto algunas incognitas sobre la sintesis de compuestos de interes. Algunos estudios aplicados a micro-organismos, han revelado el descubrimiento de nuevos compuestos biologicamente activos y esenciales para la nutricion humana (Burja et al. 2001). Recientemente las investigaciones con microalgas han ganado un creciente interes como fuente potencial de compuestos bio-activos (pigmentos, acidos grasos, carbohidratos, flavonoides, entre otros) en el sector farmaceutico, biomedica y nutraceuticos.

Un grupo de estos compuesto de tipo pigmento se encuentran las ficobiliproteinas que son macromoleculas encargadas de la captacion de la luz en organismos vegetales como las microalgas especialmente de las cianobacterias (Viskari & Colyer 2003). Estos poseen colores intensos y atractivos, permitiendo un elevado potencial de utilizacion como colorantes naturales en la industria de los alimentos como aditivos naturales en el proceso de fabricacion de bebidas y productos de confiteria (gomas y jugos), con acciones antioxidantes, estabilizantes de color (Jespersen et al. 2004), ademas, mejora las propiedades reologicas (Batista et al. 2006) y prolonga la vida util del producto. Por lo anterior, la demanda de colorantes naturales viene en aumento, debido que los de origen artificial estan asociados cada vez mas a problemas de salud, tales como: trastornos de hiperactividad, alergias y deficits de atencion (Kobylewski & Jacobson 2010).

Para la obtencion de productos a partir de microalgas es necesario desarrollar y complementar diferentes tecnicas adecuadas para extraer, cuantificar y conservar metabolitos de origen algal. Los resultados evidenciados en la literatura demuestran claramente que las tecnicas utilizadas precisan ser estandarizadas, por presentar para un mismo organismo valores discrepantes. Por ejemplo, en la extraccion es clara la necesidad de complementar las tecnicas preparativas (extraccion con solventes inorganicos) con las analiticas, especialmente de tipo espectrofotometricas (Moraes et al. 2010; Oliveira et al. 2010), fluorometricas (Patil et al. 2006) y cromatograficas (Zhang & Chen 1999). Otro factor relevante a tener en cuenta es la resistencia de la pared celular al rompimiento y liberacion de los componentes de las microalga, por lo tanto es importante tener en cuenta las metodologias para optimos rendimientos, entre las mas empleadas estan la deshidratacion por liofilizacion, congelamiento, reduccion de tamano de particula (Moraes et al. 2010; Wiltshire et al. 2000), ondas de ultra-sonido (Furuki et al. 2003; Wiltshire et al. 2000) y homogenizacion en alta presion (Patil et al. 2008) que son de tipo mecanico, Igualmente, utilizan tecnicas de rompimiento quimico adicionando al material enzimas hidroliticas (Raposo et al. 2001) o reactivos que genere condiciones extremas de salinidad, presion osmotica o pH (acidos o basicos) (Viskari & Colyer 2003).

La finalidad de este articulo es evaluar el desempeno de dos tecnicas mecanicas de rompimiento celular (sonicacion y homogeneizacion en alta presion) en la extraccion y caracterizacion de las ficobiliproteinas en sus formas quimicas (ficocianina, ficoeritrina y aloficocianina) de la microalga scenedesmus sp.

2. Materiales y metodos

Los experimentos fueron realizados en los Laboratorios de Operaciones y Procesos (LOP), adscrito al Departamento de Tecnologia de Alimentos (DTA) y la Unidad de Crecimiento de Plantas (UCP) del Departamento de Biologia Vegetal de la Universidad Federal de Vinosa UFV, Vinosa--MG, Brasil.

2.1 Obtencion de material biologico

La cepa de Scenedesmus sp. fue obtenida de la coleccion de Cianobacterias y microalgas, de la UCP del Departamento de Biologia Vegetal de la Universidad Federal de Vinosa (UFV) en la ciudad de Vinosa, Minas Gerais, Brasil. La biomasa en forma de cultivo liquido de la microalga fue incubada en medios de cultivo BG11 a 25 [grados]C; con fotoperiodo 16. (luz): 8 (oscuridad) h; con irradiacion (60 [micron]mols * [m.sup.2][s.sup.1]) por 25 dias.

Posteriormente, el cultivo de las microalgas fue sometido a diferentes tratamientos segun el diagrama esquematico presentado en Figura 2.

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2.2 Metodo de homogenizacion sobre alta presion (HSAP)

Un volumen de 10 L de biomasa fue calentado a 65[grados]C en bano termostatico industrial por medio de vapor por circulacion en serpentin durante 20 minutos. En seguida, la biomasa fue sometida al tratamiento con alta presion (300 [+ o -] 2,8) bar en un homogenizador industrial de Lacteos de la escuela de la FUNARBE/UFV (Vinosa, Brasil) recirculando la muestra durante un periodo de 5 min (Figura 2).

2.3 Metodo de Sonicacion

Para el volumen de 5 L de cultivo liquido, se ajusto el valor de pH para valores entre 7,5 a 8,0 con HCl o NaOH 0,1 mol*[L.sup.-1]. Posteriormente, 250 mL de la muestra liquida fue colocada en el sistema de sonicacion por aproximadamente 30 minutos. Los ciclos de trabajo fueron de 5s para sonicacion y de 2s de pulsado, con amplitud del 40 % y frecuencia de 40 kHz, a 50[grados]C (Figura 2).

2.4 Obtencion de las Muestras Liofilizadas

El cultivo liquido tratado por los metodos de rompimiento, fue concentrado por centrifugacion (Eppendorf 5430, Alemania), re-suspendido en agua desionizada y centrifugado por tres veces mas. Luego la muestra concentrada, fue liofilizada (Liofilizador, terroni LS 3000, Brasil), como lo describe la figura No 1.

2.4.1 Analisis Opticos

Las microalgas liofilizadas no tratadas mecanicamente (testigo) y tratadas, fueron aclimatadas hasta temperatura ambiente, fueron disueltas en agua desionizada (Direct-Q 3 UV, Millipore, EUA) en una relacion de 0,1 gr / 5 mL y colocadas en bano de ultrasonido (40 kHz, 15 seg, 25[grados]C Ultracleaner, Brasil) hasta disolucion completa del material liofilizado. Posteriormente fueron observadas al microscopio (Carl Zeiss Primo Star HAL/LED, Alemania) acoplado con un sistema de captura de imagen (ZEN11, Alemania) utilizando el objetivo de 40x.

2.5 Extraccion de ficobiliproteinas

Para obtener las ficobiliproteinas (FBPs) (1,0 [+ or -] 0,05) g de la microalga liofilizada (tratada o no) fue suspendida en 100 mL de solucion buffer fosfato/sodio 0,1 mol*[L.sup.-1] pH 7,0 con 1 mmol[L.sup.-1] de azida sodica en tubos falcon de 150 mL. La mezcla fue llevada a bano de ultrasonido (40 kHz, 15 min, 50[grados]C. Ultracleaner, Brasil) y luego a temperatura ambiente. Despues se aplico un proceso de congelacion (Ultrafreezer Terroni MFV91, -40[grados]C, Brasil) y descongelacion en ausencia de luz. Este procedimiento fue realizado minimo por tres veces. Al final, la mezcla totalmente descongelada a temperatura ambiente fue centrifugada (7000 x g por 30 min. 5804, Eppendorf, Alemania). El sobrenadante con las FBPs fue colectado para la posterior cuantificacion en sus formas quimicas (ficocianinas Fc, ficoeritrinas Fe y aloficocianinas Afc) por espectrofotometria.

2.5.1 Determinacion de pureza de las Ficobiliproteinas (FBPs)

La medida de las absorbancias en el sobrenadante que contiene las FBPs se realizo en el espectrofotometro (Cary 50, Varian, Australia). Las lecturas obtenidas a 615, 652, y 562 nm fueron utilizadas para calcular las concentraciones de las FBPs utilizando la ecuacion 1 (ficocianinas; Fc), ecuacion 2 (aloficocianinas; Afc) y la ecuacion 3 (ficoeritrinas; Fe), respectivamente (Bennett & Bogorad 1973).

[Fc](mg/L) = [A615-0,474([A.sub.652])/5,34 Ec.(1)

[Afc](mg/L) = [[A.sub.652] - 0,2008([A.sub.615)]/5,09 Ec. (2)

[Fe](mg/L) = [[A.sub.562] - 2,41(PCs)-0.849(APCs)]/9,62 Ec. (3)

La relacion entre las densidades opticas de las ficobiliproteinas (Fc, Afc y Fe) en la longitud de onda maxima a 280 nm, fue calculada segun las ecuaciones 4, 5 y 6 (Abalde. 1998), determinando las concentraciones puras del pigmento presente en las solucion.

Fc = [OD.sub.615]/[OD.sub.280] Ec. (4)

Fe = [OD.sub.562]/[OD.sub.280] (5)

Afc = [OD.sub.652]/[OD.sub.280] (6)

El rendimiento (REN) en la extraccion para cada una de las ficobiliproteinas fue calculada usando a Ecuacion 7 (Silveira et al. 2007):

REN (%) = [FBP] x vol/BS (7)

En que, FBP es la concentracion de cada una de las ficobiliproteinas (mg * [mL.sup.-1]), Vol= volumen del solvente (mL) y BS = biomasa seca (g).

2.6 Analisis estadistico

Para evaluar el efecto de los tratamientos en la extraccion de las FBPs (Fc, Fe y Afc) el experimento fue desarrollado con tres repeticiones. Los datos obtenidos en los experimentos fueron interpretados por analisis de varianza de una sola via (ANOVA) por medio de una prueba de comparacion de medias por Tukey al nivel de 5% de probabilidad (95 % de confianza). Los resultados fueron tabulados en el programa SAS(r) (2002) licenciado por Universidad Federal de Vicosa.

3. Resultados y discusion

Las tecnicas mecanicas de homogenizacion sobre alta presion (HSAP) y sonicacion (SNC) en las condiciones de trabajo evaluadas en el presente estudio, fueron usadas en el rompimiento celular en muestras liofilizadas de la microalga Scenedesmus sp. para la extraccion de FBPs.

Como lo indica la Figura No 3 (homogenizado), se observaron danos sobre la pared celular y deformaciones en las celulas con presencia de fragmentos celulares en el medio despues de ser sometidas al tratamiento mecanico por HSAP. Este comportamiento indica la eficacia de rompimiento de la pared celular de las microalgas cuando sus celulas son sometidas a HSAP. En cuanto el resultado para las muestras sonicadas no se evidencio visualmente rompimiento celular, por no presentar diferencias entre las formas celulares frente al testigo. Segun Godinho et al. (2010) esta especie presenta formas celulares de caracteristica concava y fusiforme, como lo representa la micrografia del testigo (no tratada mecanicamente) en la Figura 3.

En resumen, se puede afirmar que la HSAP es un metodo mecanico de rompimiento celular que impulsa la suspension celular a una presion elevada. El cultivo celular es forzado a pasar a traves de un orificio estrecho de una valvula que es lanzada desde una camara de baja presion. La ruptura acontece por el choque y la alta presion de ida y vuelta del chorro celular que recorre desde la valvula hasta la camara (Lee, Lewis, & Ashman 2012).

[FIGURA 3 OMITIR]

La aplicacion de la HSAP como tecnica mecanica de rompimiento celular en microorganismos celulares son de gran interes industrial, por posibilitar la obtencion y el uso de metabolitos de alto valor agregado, como ficocianinas, especialmente en cianobacterias (Batista et al. 2006). Como ejemplo, se observa el caso de la cianobacteria Spirulina Platensis. cuyo rompimiento sobre altas presiones (690 828 bar) llevo a eficiencias mayores del 42% en la recuperacion de Fc (Song et al. 2013). Safi et., al (2014) determino que la HSAP, en comparacion con otras tecnicas mecanicas y quimicas (ultrasonido, molienda manual, quimicas), fue la metodologia que evidencio la mayor eficacia en el rompimiento celular y recuperacion de sustancias proteicas en diferentes especies de microalgas.

Para el caso de la sonicacion que es una tecnica basada en la conversion de energia electrica a mecanica por medio de ondas sonoras pulsadas con frecuencias entre (20 a 40) kHz, genera en la celula una compresion y descomprension rapida con oscilaciones inestables. Los danos en la estructura de la pared celular son ocasionados por medio de perforaciones internas y/o externas (Zheng et al. 2011). Asi mismo, la sonicacion es considerada por algunos investigadores una tecnica complementaria para liberacion y disposicion de metabolitos a partir de micro-organismos (Viswanathan et al. 2012; Halim et al. 2012; Balasundaram & Pandit 2001). Sin embargo, para este estudio la tecnica de SNC, no presento resultados optimos en comparacion con la HSAP.

La Figura No 4, ilustra los contenidos de las tres formas quimicas de las FBPs; ficocianina (Fc), aloficocianina (Afc) y ficoeritrina (Fe), detectadas por espectrofotometria UV/ Vis en las muestras liofilizadas tratadas o no mecanicamente. Inicialmente se observo la influencia de los metodos mecanicos de rompimiento celular con diferencia significativa para los contenidos de Afc en las tres muestras. Presentando igualmente, para las muestras homogeneizadas los mayores valores para las FBPs. En cuanto a los contenidos de Fc y Fe no presentaron diferencia significativa entre los tratamientos mecanicos. Ademas la HSAP y la SNC puede ser una de las opciones alternativas como tecnicas mecanicas de rompimiento celular (Abalde. 1998; Furuki et al. 2003; Patil et al. 2006; Patil & Raghavarao 2007; Lawrenz et al. 2010) para aumentar los rendimientos de recuperacion de FCBs en celulas de diversas especies de microalgas, utilizadas especialmente para la extraccion de Afc.

[FIGURA 4 OMITIR]

Las muestras tratadas por HSAP presentaron diferencia significativa en el contenido de aloficocianina (1,27)% en comparacion con las tratadas por SNC (0,78)% y las no tratadas mecanicamente el testigo (0,24)%. El contenido de Fc y de Fe de las muestras homogeneizadas (0,58 de Fc; 0,47 de Fe)% y sonicadas (0,52 de Fc; 0,37 de Fe)% no presentaron diferencia significativa (p < 0,05), pero estas evidenciaron diferencia cuando fueron comparadas frente al testigo (0,14 de Fc; 0,18 de Fe)%.

Los contenidos de FBPs en los extractos crudos tratadas o no mecanicamente, encontrados en este estudio fueron inferiores a los valores promedios, en base seca de (20 a 28)% mencionados por Mishra et. al (2008) para Cianobacterias (algas verdeazules) y algas rojas (Rhodophytas). Generalmente, la presencia de estos pigmentos en estas especies de microalgas tienen como funcion exclusivamente la recoleccion de luz por medio de ensambles en conjuntos regulares en la superficie exterior de la membrana tilacoidal (Sekar & Chandramohan 2007). Igualmente se expresan como complejos de proteinas-pigmentos en algas rojas y verdes-azules, segun Mostafa (2012) para algas verdes estos tipos de complejos no estan presentes en algas verdes. Por lo anterior, Tomitani et al.(1999)concluyeron que la no presencia de las FBPs en algas verdes (Chlorophyceae) se debe principalmente por una amplia distancia evolutiva y filogenetica que existe con las cianobacterias, especialmente por la presencia de los genes de la clorofila b y ficobiliproteinas.

El numero de investigaciones disponibles en la literatura sobre las FBPs en microalgas de la familia Chlorophyceae son escasas. Simis & Kauko (2012) determinaron los contenidos de ficobilipigmentos (Fc, Afc y Fe) por tecnicas espectrofotometricas cuantitativamente en diferentes especies de Cianobacterias, algas rojas (Rhodophytas) y verdes (Scenedesmus obliquus y Chlorella vulgaris) encontrando resultados positivos para las dos primeras y negativos para las segundas respectivamente.

Moraes et al. (2010) encontraron que las Fc estan presentes en mayor porcentaje en comparacion con las Fe y Afc en Cianobacterias (Spirulinaplatensis); Bermejo et al. (2007) determinaron que las Fe fueron unas de las FCBs extraidas en mayor cuantidad en algas rojas (Porphyridium cruentum) utilizando cromatografia de absorcion en lecho expandido; y Su et al. (2009) encontraron bajos contenidos de Afc en especies de microalgas verde-azules y rojas comparadas frente a los contenidos de Fc y Fe. Al determinar los porcentajes de FBPs por la metodologia de Bennet & Bogorad (1973) en las muestras de Scenedesmus sp. tratadas mecanicamente (homogeneizacion y sonicacion) y no tratadas (testigo), estas evidenciaron diferencia estadisticamente significativa por la prueba de Tukey (p < 0,05), representando el mayor contenido de FCBs en los extractos crudos en las muestras de Scenedesmus sp.

El rompimiento celular en las muestras liofilizadas de Scenedesmus sp. por homogeneizacion reporta la mayor cantidad de FBPs (Afc + Fc + Fe) (2,32%) en comparacion con los tratamiento de sonicacion (1,67)% y el testigo (0,56)%. Estos resultados confirman la superioridad de los metodos mecanicos en el rompimiento y disponibilidad de los metabolitos intracelulares, especialmente cuando es empleada la HSAP con posible favorecimiento en mayor grado de extraccion para las Afc y en menor para las Fc y Fe.

En la Figura No 5, se observa que la muestra no tratada mecanicamente (Testigo) presenta coloracion transparente evidenciando una baja eficacia de extraccion de FBPs. En cuanto para las muestras sometidas a los tratamientos mecanicos fue posible verificar por inspeccion visual una mayor extraccion de las FBPs.

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Probablemente, el empleo de la tecnica usual para la extraccion de FBPs en Cianobacterias citada por Bennet & Bogorad 1973 (Silveira et al. 2007; Simis & Kauko 2012; Moraes, De Medeiros Burkert, & Kalil 2010; Bermejo, Ruiz, & Acien 2007; Su et al. 2009) no presenta eficacia para el rompimiento celular. Esta tecnica consiste en colocar minimo en tres ciclos de congelamiento (-40[grados]C) y descongelamiento las celulas en el sistema de extraccion. Moraes et al. (2010) perfeccionaron el metodo para la extraccion de Fc incluyendo una tecnica mecanica (molino de bolas) de rompimiento al procedimiento habitual en Cianobacterias. Estos autores consiguieron recuperaciones por encima al 25% de Fc. Lo que demuestra que para aumentar los rendimientos de extraccion de las FBPs es necesario aplicar tecnica de rompimiento celular preliminares a la extraccion (buffer fosfato) para asi, liberar los metabolitos de interes.

4. Conclusiones

En los tratamientos mecanicos de rompimiento celular aplicados para la microalga, la metodologia de HSAP fue mas efectiva que el metodo de sonicacion, este comportamiento fue evidenciado por el mayor numero de celulas deformadas y presencia de fragmentos celulares despues de ser aplicada la HSAP. De las tres formas quimicas de las ficobiliproteinas (ficocianina, aloficocianina e ficoeritrina), la aloficocianina evidencio los mayores contenidos de extraccion en los extractos. Por ultimo, se evidencio que la utilizacion de tecnicas de rompimiento preliminares a la extraccion con solventes, aumenta sinergicamente la recuperacion de metabolitos intracelulares de interes.

Agradecimientos

Al Grupo de Coimbra Universidades Brasileras GCUB y la Organizacion de Estados Americanos OEA. Igualmente, al Laboratorio de operaciones y procesos del Departamento de Tecnologia de Alimentos (DTA) y al Laboratorio de Mecanica dos Fluidos Funcionales (CFD/Bio) del Departamento de Ingenieria Agricola (DEA) de la Universidad Federal de Vinosa UFV Vinosa, MG, Brasil.

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Fecha de recepcion Dia/mes/ano 19/04/2013

Fecha de aprobacion Dia/mes/ano 01/08/2013

Jose Jovanny Bermudez-Sierra (1)*, Mauricio Oliveira-Leite (1), Jane Seliado Reis-Coimbra (1) y Marcio Aredes-Martins (2)

(1) Departamento de Tecnologia de los Alimentos DTA-UFV, Universidad Federal de Vicosa, 36570-000. MG. Brasil.

(2) Departamento de Ingenieria Agricola DEA-UFV, Universidad Federal de Vicosa, 36570-000. MG. Brasil.

* jose.sierra@ufv.br
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Title Annotation:Ciencias-Quimicas
Author:Bermudez-Sierra, Jose Jovanny; Oliveira-Leite, Mauricio; Reis-Coimbra, Jane Seliado; Aredes-Martins,
Publication:Revista Tumbaga
Date:Dec 1, 2013
Words:4682
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