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Desarrollo de un sistema en flujo multijeringa para la extraccion en fase solida en linea para determinar cocaina y benzoilecgonina en orina.

Development of a multisyringe flow system for the on-line solid phase extraction in the determination of cocaine and benzoylecgonine in urine.

Introduccion

En los ultimos anos el consumo de drogas se ha incrementado y la COC sigue siendo la segunda droga mas utilizada a nivel mundial. En Venezuela de acuerdo con el informe estadistico elaborado por el Observatorio Venezolano de Drogas (OVD), la COC ocupa el primer lugar de consumo para la poblacion con edades comprendidas entre 20 y 34 anos [1]. Es por ello que entre las directrices del Plan Nacional Antidrogas 2009-2013 que lleva adelante la Oficina Nacional Antidrogas (ONA) de Venezuela se destaca la necesidad de desarrollar lineas de investigacion que permitan implementar soluciones [2]. La prevencion integral es el area hacia donde se dirigen los mayores esfuerzos desarrollando programas de control, evaluacion y seguimiento. Por esta razon es necesario contar con metodologias analiticas confiables para evaluar los niveles de COC en fluidos biologicos en combinacion con procedimientos de preparacion de las muestras que no involucren mucho tiempo.

La COC es rapidamente metabolizada por el organismo humano en metabolitos hidrosolubles como la BZE que aunque no es un metabolito farmacologicamente activo es de gran interes analitico y forense debido a que puede ser detectado en orina de 2-4 dias despues de la ingestion de la COC [3]. Esto indica que la presencia de la BZE es una prueba fehaciente del consumo de la droga, de alli la importancia de su determinacion. Por esta razon, la orina es el fluido biologico que con mayor frecuencia es enviado a los laboratorios clinicos y toxicologicos para realizar el rastreo de COC y sus metabolitos ademas de que es una muestra que se obtiene de forma no invasiva [4].

Generalmente se utilizan inmunoensayos de manera directa en la orina para realizar los primeros analisis de COC en hospitales, centros de rehabilitacion y/o laboratorios de " respuesta rapida" [5-7] para realizar los primeros analisis de COC en hospitales, centros de rehabilitacion y/o laboratorios de " respuesta rapida". Sin embargo, dadas las implicaciones legales que presenta este tipo de analisis, cuando una prueba de inmunoensayo es positiva, debe realizarse un segundo analisis por un metodo que permita confirmar el resultado [8,9].

En los ultimos anos, muchos investigadores se han dedicado al desarrollo de metodologias analiticas que permiten la determinacion simultanea de COC y sus metabolitos mediante la aplicacion de un procedimiento de extraccion de los analitos de la matriz seguido de la ejecucion de una tecnica cromatografica como cromatografia de gases (CG) con deteccion por espectrometria de masas (EM) [10-14] o la cromatografia liquida de alta resolucion (CLAR) con deteccion UV [15,16], fluorescencia (FL) [3,1719] o acoplada a la EM [8,20-22]. Sin embargo, en el caso de la CG se requiere una etapa de derivatizacion para el analisis de las moleculas polares como la BZE [8,13]. Ademas, si bien la deteccion por EM se ha empleado en mayor proporcion en ambos casos, su alto costo limita su uso en los laboratorios de rutina.

Por otra parte, siendo la orina una matriz compleja, la etapa de tratamiento de la muestra que elimine el material endogeno no se puede omitir. En la literatura se han reportado diferentes procedimientos de extraccion y limpieza con el fin de minimizar los efectos de la matriz durante el analisis CG o CLAR [23]. La mayoria de los metodos revisados involucran procedimientos manuales tediosos de extraccion liquido--liquido (ELL) [24,25] o extraccion en fase solida (EFS) utilizando cartuchos [10,26-28].

En la actualidad, el desarrollo de soportes especiales de extraccion selectiva [29,30] empacados en columnas ha permitido la automatizacion de la EFS y es una alternativa conveniente para reducir el numero de etapas del tratamiento de la muestra, minimizando el consumo de reactivos toxicos y el riesgo de perdida de los analitos.

Para la automatizacion de la EFS, la tecnica MSFIA ha jugado un rol importante en el desarrollo de las diferentes etapas del tratamiento de muestras en diferentes metodologias de analisis ya que presentan muchas ventajas como simplicidad, bajo coste, versatilidad, velocidad y, generalmente, buenas prestaciones analiticas [31-33]. Adicionalmente, el MSFIA cuenta con un software que permite controlar todos los componentes del sistema [32].

En virtud de todo lo expuesto en este trabajo se desarrollo y valido un metodo analitico para la determinacion de COC y BZE en orina de consumidores empleando un sistema MSFIA para automatizar el tratamiento de muestra con la separacion por CLAR y deteccion por FL.

La principal ventaja del metodo radica en la utilizacion de un sistema MSFIA que simplifica el tratamiento de la muestra reduciendo significativamente el tiempo de esta etapa. Por otra parte, el sistema utilizado constituye una alternativa respetuosa con el medioambiente porque garantiza bajo consumo de solventes organicos y baja generacion de residuos toxicos.

MATERIALES Y METODOS

Reactivos y solventes. Todos los reactivos utilizados fueron de grado analitico y los solventes de grado CLAR. El acetonitrilo (MeCN) y el metanol (MeOH) fueron suministrados por J.T. Baker (Phillisburg, NJ, EE.UU). El agua utilizada se purifico en un sistema Milli-Q TOC (Waters, Millipore, MA, EE.UU.).

Los patrones de clorhidrato de cocaina y benzoilecgonina de 98 % (p/p) de pureza fueron adquiridos por Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE.UU.). Las soluciones de COC y BZE se prepararon de 50 [micron]g/mL en acetato de amonio 0,045 M (pH = 3,8) a partir de los patrones de ambos analitos de 1000 [micron]g/mL (en metanol) y se almacenaron bajo refrigeracion a 4 [grados]C. Las soluciones de trabajo de menor concentracion se prepararon diariamente por dilucion de estos estandares.

La solucion de acetato de amonio 0,045 M (pH = 3,8) se preparo a partir de la cantidad necesaria de acetato de amonio 98 % (p/p) de pureza suministrado por Himedia Laboratories (Mombai, India).

Muestras de orina. Para el desarrollo de este trabajo, se recolecto un concentrado de orina de 50 individuos voluntarios no consumidores que se empleo para llevar a cabo la etapa de optimizacion de los parametros experimentales. Posteriormente, para evaluar el metodo propuesto se analizaron 12 muestras de orina pertenecientes a individuos consumidores en rehabilitacion suministradas por la Fundacion Jose Felix Rivas, Merida, Venezuela. En todos los casos se obtuvo un consentimiento informado de cada uno de los pacientes evaluados.

Las muestras de orina (30-40 mL) se recogieron en envases plasticos y a cada uno se les agrego una solucion saturada de NaF (50 [micron]L) con la finalidad de evitar la hidrolisis enzimatica de la COC a BZE y se almacenaron bajo refrigeracion a -18[grados]C hasta el momento de su analisis [34].

En el momento de su uso las muestras de orina se centrifugaron a 3000 r.p.m. durante 10 minutos para remover cualquier material precipitado. Posteriormente 1 mL de la muestra se diluyo con una solucion de acetato de amonio 0,045 M (pH = 3,8) en una proporcion 1:3 v/v, se agito en un vortex durante 30 segundos, se centrifugo nuevamente por 5 minutos a 6000 r.p.m. y se filtro a traves de membranas de politetrafluoroetileno (PTFE) de 13 mm de diametro y 0,22 [micron]m diametro de poro (support[R]-450 Membrana, Waters, EE.UU.) para evitar la presencia de cualquier tipo de material en suspension que pudiera ocasionar una obstruccion de los poros del material de empaque de la precolumna o en las conexiones del sistema. Finalmente, un volumen de 0,200 mL de filtrado se inyecto en el sistema MSFIA.

Instrumentacion y condiciones cromatograficas. Se utilizo un cromatografo de fase liquida PerkinElmer serie 200, equipado con una bomba cuaternaria de alta presion, un horno con modulo para el control de la temperatura, un detector de fluorescencia y un computador digital provisto con un software TotalChrom (version 6.3), que permitio el control de todos los componentes del sistema, el registro, almacenamiento y procesamiento de los datos.

El acoplamiento del sistema MSFIA con el sistema cromatografico se realizo mediante una valvula selectora de columnas automatica de seis puertos Rheodyne modelo 7000, provista de un bucle de 0,200 mL para la inyeccion del extracto de la muestra en el cromatografo. La separacion cromatografica se realizo en una columna monolitica Chromolith RP-18e Merck de 50 mm de longitud y 4,6 mm de diametro interno. La fase movil constituida por la solucion A: acetato de amonio 0,045 M (pH = 3,8)-metanol-acetonitrilo (90:5:5, v/v) y la solucion B: acetato de amonio 0,045 M (pH = 3,8)-metanol-acetonitrilo (20:40:40, v/v) [24], se utilizaron en modo de gradiente de elucion: 0 % (1 min) B [flecha diestra] 40 % de B a una velocidad de 40[grados]%B/min a un flujo de 3 mL/min. Ambas soluciones se filtraron a traves de membranas de 0,22 [micron]m de diametro de poro (HV, Millex de Millipore) y desgasificaron en un bano ultrasonico (Branson 2210, Illinois, EE.UU.) antes del analisis. La deteccion por fluorescencia se realizo a las longitudes de onda de excitacion y emision de 230 nm y 315 nm respectivamente [3,18,19].

Sistema MSFIA. En la Figura 1 se muestra un diseno esquematico del sistema MSFIA utilizado, que consistio de una bureta con velocidad programable (MicroBU2030; CRISON, Allela, Barcelona) equipada con cuatro jeringas bidireccionales de alta precision (J1-J4) (Hamilton, Suiza), aunque para el sistema solo tres de ellas fueron utilizadas J1(10,0 mL), J2 (10,0 mL) y J3 (5,0 mL). Ademas, cada una de ellas en la parte superior tiene una valvula solenoide de 3 puertos (V1-V3) (N-Research, Caldway, NJ). Dependiendo de la posicion de la valvula solenoide el liquido que contiene la jeringa se aspiro o dispenso hacia el sistema (posicion on) o al reservorio (posicion off). Adicionalmente dos valvulas de conmutacion (V4-V5) se conectaron y controlaron a traves de la bureta (Takasago Electric, Nagoya, Japon). Para todo el control de sistema se empleo el software Autoanalysis 5.0 (Sciware, Palma de Mallorca, Espana).

[FIGURA 1 OMITIR]

En la construccion del sistema se utilizo tuberia PTFE de 0,8 mm de diametro interno (d.i.). Todas las conexiones fueron de 40 mm de longitud para evitar sobrepresion en el sistema, excepto el bucle, en el cual se emplearon 400 mm x 0,8 mm d.i. con el fin de obtener un volumen de 0,200 mL para la toma de la muestra. Todos los conectores T fueron hechos de PTFE, el cual resiste mejor el uso de solventes organicos.

La extraccion en fase solida de COC y BZE desde la muestra de orina se realizo en una precolumna Oasis[R] HLB (20 mm x 3,9 mm d.i., 25 [micron]m de diametro de particula) (Waters, EE.UU.) la cual se acoplo directamente al sistema en flujo sin generar sobrepresion en el sistema.

Procedimiento de extraccion en fase solida. Los detalles sobre el funcionamiento del sistema MSFIA para la EFS de COC y BZE de la orina se enumeran en la Tabla 1. Todo el procedimiento involucro 8 pasos.

Inicializacion del sistema: con todas las valvulas en posicion " off", las jeringas se llenaron con las soluciones contenidas en los depositos respectivos a un flujo 30 mL/min; Ji fase movil de extraccion o lavado ([H.sub.2]O:MeOH, 98:2, v/v), J2 fase de elucion (MeCN); J3 fase de acondicionamiento de la precolumna OASIS ([H.sub.2]O:MeOH; 10:90, v/v).

Acondicionamiento: la precolumna OASIS HLB se acondiciono con 5 mL de la mezcla [H.sub.2]O:MeOH (10:90, v/v) suministrada por la jeringa 3 (J3) con la finalidad de limpiar, solvatar y equilibrar el lecho cromatografico (Paso 1).

Ajuste de las jeringas: se procede al llenado de las jeringas con las valvulas V1-V3 en posicion "off" a un flujo de 30,0 mL/min (Paso 2) que da comienzo al ciclo de tratamiento de la muestra.

Lavado de la precolumna: A continuacion, la jeringa 1 (J1) suministro un volumen de 1,0 mL de fase de lavado a traves del sistema para eliminar el residuo de MeOH que estaba presente en el volumen muerto de la precolumna previo a la introduccion de la muestra (Paso 3).

Carga de la muestra en la precolumna: la J1 conectada a la V4 en posicion (off) aspiro la muestra y lleno el bucle (a) de 0,200 mL (Paso 4). Seguidamente, esta misma jeringa (J1) pero con la valvula V4 en posicion " on" se encargo de introducir la muestra en la precolumna OASIS HLB (Paso 5).

Limpieza: bajo las mismas condiciones anteriores, se lavo la precolumna con 1,0 mL de la fase de lavado con el fin de eliminar la mayor cantidad de compuestos endogenos de la orina, mientras que COC y BZE quedaron retenidos (Paso 6).

Elucion: la jeringa 2 (J2) (MeCN) con la valvula V5 en posicion " off' suministro la fase de elucion a la precolumna para eliminar toda el agua presente en el volumen muerto de la precolumna y asegurar que los analitos se encontraban completamente en el solvente organico para su inyeccion (Paso 7). Seguidamente, la jeringa 2 (J2) pero con la valvula V5 en posicion " on" se encargo de introducir al sistema el solvente organico (MeCN) para eluir los analitos desde la precolumna hacia el bucle (b) de 0,200 mL conectado a la valvula selectora Rheodyne modelo 7000 en posicion de carga (Paso 8). Finalmente la valvula selectora cambio a la posicion de inyeccion y la muestra se introdujo en el sistema cromatografico.

RESULTADOS Y DISCUSION

Optimizacion de la EFS en el MSFIA. Para la EFS de los analitos, limpieza y preconcentracion en el MSFIA se selecciono una precolumna OASIS HLB que tiene un empaque con un equilibrio hidrofilico--lipofilico adecuado para la extraccion en fase solida de compuestos de diferente polaridad como lo son la COC y BZE. Su composicion consiste de una proporcion balanceada de dos monomeros: N-vinilpirrolidona (hidrofilico) y divinilbenceno (lipofilico). El mecanismo de retencion se realiza a traves de interacciones dipolo--dipolo para los compuestos polares y por fuerzas de Van der Waals en el caso de los no polares. Por otra parte, tiene una capacidad de retencion superior de analitos polares, debido a las interacciones con pares de electrones no compartidos, lo cual junto con el favorable termino de cavidad/dispersion, hacen que su selectividad sea unica [35]. Estas caracteristicas permitieron la retencion de ambos analitos, la COC que es una molecula con caracteristicas hidrofobicas y la BZE que por poseer en su estructura molecular un grupo amino y un grupo carboxilico tiene un caracter relativamente hidrofilico [24]. Adicionalmente, el tamano de particula es de 25 [micron]m, que permitio su conexion directamente al sistema en flujo sin generar alta presion [36].

Inicialmente se estudio el perfil de elucion de la orina y de los analitos conectando la precolumna OASIS HLB, insertada en el sistema MSFIA, directamente al detector de fluorescencia y se fijaron las longitudes de onda de excitacion 230 nm y emision 315 nm tomadas de la literatura [3,18,19]. Para este estudio se emplearon soluciones patrones de COC y BZE de concentracion 0,50 [micron]g/mL, muestras de orina enriquecidas con los analitos a la misma concentracion y un blanco de orina. Para obtener la maxima eficiencia en la extraccion se optimizaron: a) volumen de muestra (0,1-0,3 mL); b) velocidad del flujo de introduccion de la muestra en la precolumna (0,6-0,8 mL/min); c) volumen, la velocidad del flujo (0,5-0,8 mL/min) y naturaleza de la fase movil de extraccion o lavado (agua con diferentes porcentajes de solventes organicos: MeOH y MeCN); d) volumen (0,5-2,0 mL) y la velocidad del flujo del solvente de elucion (0,6-0,8 mL/min). Los mejores resultados se obtuvieron utilizando una fase de extraccion o lavado de composicion [H.sub.2]O:MeOH (98:2, v/v) circulando a un flujo de 0,6 mL/min y durante un tiempo de lavado de 1,0 min suficiente para eluir los compuestos endogenos de la matriz sin perdida de los analitos. Por otra parte, la adicion de 2 % de MeOH como modificador organico aseguro la ruptura de la posible interaccion de los analitos con los componentes endogenos presentes en la orina [37].

La etapa de elucion de COC y BZE fue una de las mas criticas del proceso, debido a que los analitos deben transferirse en linea desde la precolumna hacia el bucle (b) para su posterior inyeccion en la columna analitica. Para ello, se optimizaron la velocidad del flujo, volumen de elucion y el solvente o mezclas de solventes a emplear. Teniendo en cuenta las caracteristicas fisicoquimicas de los analitos se evaluaron el MeOH y el MeCN como solventes de elucion y combinaciones de ellos con acetato de amonio 0,045 M (pH = 3,8). Se descarto el MeOH ya que causo sobrepresion en el sistema debido a su viscosidad (0,59 cP a 25[grados]C) en comparacion con el MeCN (0,38 cP a 25[grados]C) [38]. Se selecciono el MeCN ya que tiene un poder de elucion suficiente para comprimir los picos de los analitos durante la elucion y aseguro la transferencia cuantitativa de los analitos hacia el bucle (b). Otro parametro estudiado que influyo en esta etapa fue el volumen de llenado del bucle (b) que se vario entre 1,4 y 1,8 mL. Como senal de respuesta se midieron las areas de pico de los analitos para cada uno de los volumenes estudiados. En la Figura 2 se muestran los graficos de los resultados obtenidos. Se puede observar un incremento del area de los picos para ambos analitos a medida que se incremento el volumen de elucion de MeCN hasta 1,7 mL; a valores superiores las senales analiticas disminuyeron. Se fijo un volumen de 1,7 mL de MeCN para el resto de los analisis.

[FIGURA 2 OMITIR]

Es importante mencionar que una de las ventajas que ofrece el modulo multijeringa es que permite estudiar un amplio intervalo de flujos para establecer el flujo de trabajo optimo para las jeringas. Por esta razon, se fijo el volumen de llenado del bucle (b) en 1,7 mL y se optimizo el flujo de llenado entre 0,6 y 0,9 mL/min con la finalidad de establecer si habia diferencias significativas en cuanto a sensibilidad. Los resultados obtenidos (Figura 3) muestran un incremento del area de pico para ambos analitos hasta un flujo de 0,7 mL/min, posteriormente las senales analiticas disminuyeron lo que indico perdida de los analitos desde el bucle (b) a desecho. Se establecio un flujo de 0,7 mL/min. Bajo estas condiciones de volumen y flujo de llenado del bucle (b) se logro una concentracion de COC y BZE en el bucle (b) de inyeccion que proporciono areas de pico que permitieron evaluar los analitos a los niveles de concentracion en los que se encuentran en la orina.

[FIGURA 3 OMITIR]

Separacion cromatografica. La separacion cromatografica de COC y BZE se realizo en una columna monolitica de silice Chromolith RP-18 que consiste de una pieza de material poroso continuo con una distribucion de tamano de poros bimodal integrada por macro- y mesoporos. Las caracteristicas estructurales le confieren simultaneamente alta eficiencia de separacion y una alta permeabilidad que permite el uso de flujos altos para la circulacion de la fase movil, reduciendo considerablemente el tiempo de corrida [39].

La optimizacion de la fase movil para la separacion se realizo variando su naturaleza y composicion, definiendo el tipo de regimen de elucion y el flujo de circulacion de la misma. Para ello se ensayaron diferentes mezclas de bufferMeCN, buffer-MeOH, buffer-MeCN-MeOH en modo de elucion isocratico y de gradiente y el flujo de circulacion se vario entre 1,0 y 4,0 mL/min.

Los mejores resultados que significaron un buen compromiso entre buena resolucion, eficiencia de la columna y un tiempo de analisis satisfactorio se muestran en la Tabla 2 y en la Figura 4 el cromatograma obtenido para una muestra de orina enriquecida con los analitos a una concentracion de 0,5 [micron]g/mL.

En el cromatograma (Figura 4) se puede observar que existe una buena resolucion entre los picos de los analitos estudiados, sin interferencias de matriz y en un tiempo de analisis satisfactorio. Los tiempos de retencion fueron de 1,75 y 2,88 min para BZE y COC respectivamente

[FIGURA 4 OMITIR]

VALIDACION DEL METODO

Linealidad y efecto de matriz. Para establecer el intervalo lineal de trabajo se elaboraron curvas de calibrado de soluciones patrones de COC y BZE y de muestras de orina enriquecida a los mismos niveles de concentracion. Los intervalos de concentracion estudiados fueron: 0,03-2,00 [micron]g/mL y 0,02-4,00 [micron]g/mL para COC y BZE respectivamente. Cada curva de calibrado incluyo al menos una serie de seis puntos y un blanco y se midieron un minimo de tres veces cada uno. Todas las muestras se procesaron por el metodo propuesto y se evaluaron en el sistema bajo las condiciones optimizadas. En la Tabla 3 se muestran las ecuaciones de regresion lineal del area de pico en funcion de la concentracion de cada analito.

Se puede observar que para todos los casos las pendientes de las curvas de los patrones y la de las muestras de orina enriquecidas con los analitos no difieren significativamente (prueba t de Student: en todos los casos ttabulada > tcalculada, para un 99 % de probabilidad). Los [r.sup.2] > 0,9930 para todos los casos demostraron que existia una buena linealidad en el intervalo de concentraciones estudiado. Este comportamiento nos permitio concluir que no existia interferencia de la matriz en el analisis y que se podian evaluar los niveles de concentracion de COC y BZE en las muestras de orina utilizando el metodo de calibracion externa a partir de los patrones acuosos de los analitos.

Precision y exactitud. Para evaluar la precision se realizaron analisis consecutivos de soluciones patrones de COC y BZE y de muestras de orina enriquecidas con los analitos a diferentes niveles de concentracion (0,40-1,00 [micron]g COC/mL; 0,50-2,50 [micron]g BZE/mL) durante un dia y en dias diferentes. Los resultados indicaron una buena repetitividad y estabilidad del sistema descrito; la precision para ambos analitos expresada como desviacion estandar relativa DER (n = 5) < 3,5% para todos los casos.

La exactitud del metodo se estimo realizando estudios de recuperacion para ambos analitos a 3 niveles de concentracion (0,0625, 0,125, y 0,50 [micron]g/mL). Se obtuvieron porcentajes de recuperacion entre 96,1-101,3 % y 97,8-101,2 % (DER < 3,0 %, n = 5) para COC y BZE respectivamente. Estos resultados demostraron el buen rendimiento del procedimiento de extraccion de la precolumna OASIS HLB.

El limite de cuantificacion y de deteccion para COC y BZE, definidos como las concentraciones que cumplen con una relacion senal:ruido de 10:1 y 3:1, fueron 0,03 y 0,01 [micron]g COC/mL y 0,02 y 0,006 [micron]g BZE/mL respectivamente, valores que permitieron evaluar satisfactoriamente a ambos analitos en las muestras de orina analizadas y comparables a los limites reportados en la literatura con deteccion por EM [21,28]. Sin embargo, si se necesitara mejorar la sensibilidad del metodo se podria aumentar el volumen de muestra hasta valores de 0,300 mL.

Muestras de orina. Las doce muestras de orina de los consumidores en rehabilitacion se prepararon segun el metodo propuesto y se analizaron un minimo de tres veces cada una. Los resultados indicaron 8 muestras positivas por cocaina y/o su metabolito. Las concentraciones medias encontradas estuvieron en el intervalo de concentracion: 0,15 0,82 [micron]g de COC/mL y 0,58-2,31 [micron]g de BZE/mL. Estos valores confirmaron que la sensibilidad del metodo es adecuada para evaluar COC y BZE en muestras de orina de individuos bajo tratamientos de rehabilitacion.

CONCLUSIONES

Se desarrollo un metodo para la determinacion de COC y BZE en muestras de orina, que representa una buena alternativa para realizar estudios farmacocineticos o seguimiento de tratamientos clinicos durante las etapas de desintoxicacion y rehabilitacion.

La factibilidad de operacion y el remarcable ahorro de tiempo del sistema MSFIA-CLAR empleado se debe a la viabilidad de realizar analisis directos de muestras de orina sin un tratamiento previo, gracias a la insercion en el sistema de una precolumna OASIS HLB que posee la selectividad necesaria para la retencion de los analitos (COC y BZE) de diferente polaridad. Por otro lado, el uso de una columna de separacion con tecnologia monolitica [40] permitio trabajar a un flujo alto lograndose un tiempo de corrida inferior a 3 minutos mucho menor si se compara con lo reportado en la literatura utilizando columnas convencionales [16].

Los resultados obtenidos demostraron la superioridad del sistema MSFIA empleado para la EFS de los analitos debido a que: a) minimizo el consumo de muestras, solventes y generacion de residuos toxicos facilitado por el empleo de valvulas solenoides de tres vias que impulsan los liquidos hacia el sistema solamente en las cantidades y en el momento en que la metodologia lo requiere. Esta capacidad se tradujo en un menor coste por analisis y constituyo una alternativa respetuosa con el medioambiente; b) todo el procedimiento de EFS de los analitos se realizo en 7,8 minutos y la separacion y deteccion en un tiempo menor a 3 minutos. Sin embargo, la posibilidad de superponer el tratamiento de una muestra con la separacion y deteccion de la anterior permitio una frecuencia de analisis de 7 inyecciones por hora.

La sensibilidad del detector de fluorescencia favorecio en gran medida las caracteristicas analiticas del metodo permitiendo disminuir significativamente los limites de deteccion en comparacion con los reportado para UV [15,16] y comparables a los limites reportados con deteccion por EM [21,28].

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue financiado por el Fondo Nacional de Ciencia, Tecnologia e Innovacion (FONACIT, Proyecto PEII No 2012001246).

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Brunetto Maria del Rosario *, Delgado Yelitza, Quiroz Cristhian, Orozco Wendy, Ayala Carlos, Gallignani Maximo.

Grupo de Espectroscopia Molecular, Departamento de Quimica, Facultad de Ciencias, Universidad de los Andes, Merida--Republica Bolivariana de Venezuela.

Recibido agosto 2013--Aceptado noviembre 2013
TABLA 1
Protocolo para la EFS de COC y BZE en el MSFIA.

                                             Posicion Valvulas
       Tiempo   Operacion   Flujo
Paso   (min)    mL          (mL/min)   V1    V2    V3    V4    V5

1      8,3      Dispensar   0,6        off   off   on    off   off
                5,0
                            Inicio del ciclo

2-3    1,8      Aspirar     30         off   off   off   off   off
                5,0

                Dispensar   0,6        on    off   off   on    off
                1,0

4      2,0      Aspirar     1,0        on    off   off   off   off
                0,2

5      2,7      Dispensar   0,6        on    off   off   on    off
                0,4

6      4,4      Dispensar   0,6        on    off   off   on    off
                1,0

7-8    7,8      Dispensar   0,6        off   on    off   off   off
                0,6

                Dispensar   0,7        off   on    off   off   on
                1,7

                Final del ciclo (Proxima inyeccion)

Paso      Descripcion

1      Acondicionamiento
         OASIS HLB (a)

    Inicio del ciclo

2-3      Ajuste de las
            jeringas

          Lavado de la
           precolumna

4          Toma de la
       muestra (Bucle a)

5      Transferencia a la
           precolumna

6          Limpieza y
        preconcentracion
          de COC y BZE

7-8    Elucion a desecho
        (volumen muerto)

            Elucion
           (Bucle b)

Final del ciclo (Proxima inyeccion)

(a) Esta operacion se realizo una vez al dia (Paso1).

TABLA 2
Condiciones cromatograficas optimizadas.

Instrumental                               Condiciones

Bomba Serle 200            Fase movil A: acetato de amonio 0,045 M :
(Perkin-Elmer)                metanol : acetonltrllo (90:5:5, v/v)

                           Fase movil B: acetato de amonio 0,045 M :
                             metanol : acetonltrllo (20:40:40, v/v)

                            Gradiente de elucion: 0 % B (1 min) 40 %
                                 de B a una velocldad= 40 %B/min

Columna Analitica Merck          Columna monolitica Chromolith
                                     RP-18e (50 mm x 4,6 mm)

Flujo                                      3,0 mL/min

Detector Fluorescencia     Fluorescencia ([lambda]excitacion = 230 nm;
Serle 200 (Perkin-Elmer)            [lambda]mision = 315 nm)

TABLA 3
Caracteristicas analiticas de las rectas de calibrado
para COC y BZE.
                                                        Intervalo
                        Ecuacion de                      dinamico
Compuesto  Matriz     regresion lineal     [r.sup.2]  ([micron]g/mL)

COC        Patron   A=2,06 x [10.sup.5]C    0,9992      0,03-2,00
           Acuoso

           Orina   A=3,2 X [l0.sup.3]+2,    0,9930      0,03-2,00
                      11 x [l0.sup.5]C

BZE        Patron  A= 2,84 x [10.sup.5]C    0,9981      0,02-4,00
           Acuoso

           Orina   A= 2,1 x [10.sup.3]+     0,9945      0,02-4,00
                      2,78 x [10.sup.5]C

A: area de pico, C: concentracion, [r.sup.2]: coeficiente de
determinacion.
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Title Annotation:Articulo Original
Author:del Rosario Brunetto, Maria; Delgado, Yelitza; Quiroz, Cristhian; Orozco, Wendy; Ayala, Carlos; Gall
Publication:Revista de la Facultad de Farmacia
Date:Jul 1, 2013
Words:6501
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