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Desarrollo de embriones caprinos in vitro: efecto del co-cultivo con celulas epiteliales de oviducto.

In Vitro Development of Goat Embryos: Effect of Co-culture with Oviductal Epithelial Cells

RESUMEN

El desarrollo de sistemas de cultivo in vitro que permitan obtener altos porcentajes de embriones viables es de gran importancia para la implementacion de biotecnologias como el clonado y la transferencia de genes. Estudios tendientes a mejorar la eficiencia de los sistemas de cultivo embrionario son especialmente importantes en ganado caprino por el escaso desarrollo de estos metodos en dicha especie. El objetivo del presente estudio fue comparar el desarrollo de embriones caprinos fecundados in vivo cultivados: a) con celulas epiteliales de oviducto caprino (CEO), b) en fluido sintetico de oviducto (SOF; del Ingles: synthetic oviduct fluid) o c) en medio condicionado por celulas epiteliales de oviducto caprino (MC). Embriones de 1-8 celulas colectados del oviducto de cabras superovuladas se cultivaron in vitro durante 4-5 dias en los diferentes tratamientos. Al termino del cultivo se establecio el estadio de desarrollo embrionario alcanzado y el numero de celulas por embrion a partir de embriones tenidos con lacmoid. Un mayor porcentaje de embriones se desarrollaron hasta el estado de morula/blastocisto en cocultivo comparado con los cultivados en SOF (75% vs. 41% respectivamente; P < 0,05) o MC (5,5%); mientras que el SOF resulto superior al MC para sustentar el desarrollo de los embriones caprinos hasta morula/blastocisto. Los embriones producidos en cocultivo con CEO tenian mas celulas que los cultivados en SOF (15,3 vs. 8,1 celulas/embrion; P < 0,05) y estos ultimos mas que los cultivados en MC. La viabilidad de los embriones generados en SOF se confirmo mediante transferencia a una cabra receptora, seguido por el nacimiento de 2 cabritos. En conclusion el cocultivo con CEO brinda mejores condiciones para sustentar el desarrollo in vitro de embriones caprinos en relacion con los otros dos sistemas estudiados.

Palabras clave: Embrion, cultivo in vitro, ganado caprino, cabras, oviducto, sincronizacion del estro.

ABSTRACT

Development of reliable in vitro culture systems to produce high percentages of viable embryos is instrumental in the application of biotechnologies such as cloning and transgenesis. This is especially true for caprine species in which in vitro technology for embryo culture has been poorly developed. The objective of this study was to compare in vitro development of in vivo fertilized caprine embryos in: a) coculture with caprine oviductal epithelial cells (OEC), b) synthetic oviduct fluid (SOF), or c) medium conditioned by oviductal epithelial cells (CM). In vivo fertilized 1-8 cell caprine embryos collected by oviductal flushing were allocated to treatments and cultured for 4-5 days in vitro. At the end of the culture period, embryonic development was recorded and the number of cells per embryo was determined in lacmoid-stained embryos. A significantly higher percentage of embryos reached the morula/blastocyst stage in coculture compared with those cultured in SOF (75% vs. 41% respectively; P < 0.05) or CM (5.5%); SOF was superior to CM to supporting goat embryo development. Likewise, embryos grown in coculture with OEC had more cells than those cultured in SOF (15.3 vs. 8.1 cells/embryo; P < 0.05). Cell counts were higher in embryos cultured in SOF than those originated from CM. In conclusion, coculture of goat embryos with OEC provided superior conditions to support in vitro development of early-stage goat embryos compared with the other treatments studied.

Key words: Embryo, in vitro culture, caprine, goat, oviduct, estrous synchronization.

INTRODUCCION

La produccion de embriones in vitro es esencial para el desarrollo e implementacion de tecnologias que implican la micromanipulacion embrionaria, tales como el clonado por transferencia nuclear, el sexado de embriones y la produccion de animales transgenicos. El desarrollo de sistemas adecuados para el cultivo in vitro de embriones micromanipulados hasta estadios de desarrollo que permitan su transferencia a hembras receptoras es fundamental para el exito de dichas biotecnologias. Asimismo, la disponibilidad de gran numero de embriones generados por tecnicas in vitro es de considerable valor para estudiar la biologia del desarrollo de embriones mamiferos previo a la implantacion.

En general, el cultivo in vitro se asocia a una reducida velocidad de desarrollo y viabilidad embrionaria [40, 43], efectos que son mas marcados a medida que aumenta el tiempo de cultivo [7, 23]. Un hallazgo constante, bajo ciertas condiciones de cultivo in vitro, es el cese del desarrollo embrionario o "bloqueo" del desarrollo [4, 50]. En un estudio preliminar [50], 89 embriones caprinos de 1-8 celulas no sobrepasaron el estado de morula cuando se cultivaron en medio de Whitten o Ham F10 suplementados con albumina serica bovina (BSA) (1,5%) o suero fetal bovino (10%). Otros resultados indican que el bloqueo del desarrollo en embriones caprinos cultivados in vitro se produce en el estado de 8-16 celulas [40].

El cocultivo de embriones con celulas somaticas ha sido utilizado extensamente para estimular el desarrollo in vitro de embriones [10, 25, 28, 37, 41]. Los dos tipos celulares mas utilizados para el cocultivo de embriones son: celulas de la granulosa [22, 53] y celulas epiteliales de oviducto (CEO) [16, 21, 51]. Numerosos trabajos demuestran un efecto positivo del cocultivo con CEO sobre la velocidad de desarrollo, viabilidad luego de la transferencia y calidad morfologica de los embriones [2, 18, 19, 21, 38]. Ellington y col. [17] demostraron que embriones bovinos cocultivados con CEO en medio de Chatot-Ziomek-Bavister (CZB) [11] son comparables con los obtenidos in vivo en terminos de: numero de celulas, porcentaje de blastocistos obtenidos y tasas de prenez logradas luego de la transferencia. Sakkas y col. [40] encontraron que un mayor porcentaje de embriones cocultivados con CEO desarrollaron mas alla del estadio de 16 celulas comparado con los embriones cultivados en medio sin CEO. Estas observaciones sustentan la hipotesis que el ambiente del oviducto tiene cualidades unicas y esenciales para promover el desarrollo embrionario.

Una alternativa al cocultivo es el cultivo de embriones en medio condicionado por CEO caprino (MC). En general la velocidad de desarrollo de los embriones cultivados en MC es inferior a aquellos cocultivados con celulas de oviducto [26, 39]. Ademas, los embriones desarrollados en cocultivo presentan mayor numero de celulas [44] comparado con los cultivados en medio condicionado, indicando la existencia de un efecto estimulatorio directo de las celulas en cocultivo sobre los embriones.

El medio conocido como fluido sintetico de oviducto (SOF) desarrollado por Tervit y col. [43], es un medio simple cuya composicion esta basada en el analisis bioquimico del fluido de oviducto ovino, mas el agregado de BSA. Este medio se ha utilizado para cultivar embriones ovinos [35, 43, 47], bovinos [31, 43] y caprinos [35]. La capacidad del SOF para promover el desarrollo embrionario mejora cuando el cultivo se efectua en una atmosfera con baja tension de oxigeno (5-7%) [5, 20, 43]. Se ha asociado al uso del SOF una menor viabilidad, numero de celulas y calidad embrionaria si se compara con embriones in vivo [15, 46]. En otro trabajo la calidad embrionaria no difirio entre embriones cultivados en SOF o cocultivados con CEO caprino, aunque el desarrollo medido en cantidad de embriones que llegaron hasta blastocisto, numero de celulas por embrion, indice mitotico e indice picnotico tuvo un comportamiento superior en los embriones cultivados en SOF [5].

Se ha comunicado el nacimiento de cabritos a partir de embriones producidos totalmente in vitro [13, 28, 29], pero es limitada la informacion sobre sistemas de cultivo para embriones preimplantacionales caprinos. Aunque es posible adaptar sistemas de cultivo que han resultado efectivos con embriones de otras especies como la ovina o bovina, las particularidades de cada una hacen dificiles las generalizaciones. Por lo tanto el objetivo del presente estudio fue comparar el desarrollo de embriones caprinos fertilizados in vivo cultivados in vitro: a) con CEO, b) en fluido sintetico de oviducto (SOF) o c) en medio condicionado por CEO caprino (MC).

MATERIALES Y METODOS

Diseno experimental

Embriones caprinos en estadio de 1-8 celulas fecundados in vivo se asignaron al azar a los siguientes sistemas de cultivo: 1) cocultivo con CEO caprino en medio de cultivo 199 (Gibco, Life Technologies Inc., USA) suplementado con 10% suero fetal bovino (TCM199); 2) cultivo en SOF; 3) cultivo en medio condicionado por CEO.

Superovulacion

Como donantes de embriones se utilizaron cabritonas y cabras Anglo Nubian las cuales recibieron esponjas intravaginales impregnadas con 60 mg de acetato de medroxiprogesterona (MAP) durante 11 dias. Fueron superovuladas con dosis decrecientes de FSH de origen porcino (FSH-p[R], Schering, USA; en la tercera replica del experimento se utilizo Folltropin[R]-V, Vetrepharm Inc., Canada) por via intramuscular aplicadas cada 12 horas (4; 4; 2; 2; 2 y 2 mg Armour), comenzando el tratamiento 48 horas antes del retiro de las esponjas intravaginales. En ese momento tambien recibieron una dosis luteolitica de cloprostenol (125 [micron]g; im; Estrumate[R], Coopers, Argentina) [8]. Con el fin de mejorar la sincronia de las ovulaciones multiples, 40 horas despues del retiro de las esponjas las cabras recibieron 100 [micron]g de LHRH (Sigma[R], Chemical Co., USA) por via intramuscular [14]. A partir del retiro de las esponjas, las cabras se colocaron individualmente en el corral del macho a intervalos de 12 horas y si se encontraban en celo se permitio el servicio por un macho de probada fertilidad. Los animales que manifestaron celo recibieron un servicio cada 12 horas hasta la finalizacion del celo.

Colecta de embriones

Los embriones fueron recuperados quirurgicamente 48-76 horas despues del inicio del celo. Se utilizo xilazina (0,11 mg/Kg peso corporal, im; Rompun[R], Bayer, Argentina) y Clorohidrato de Ketamina (5,5 mg/Kg peso corporal, im; Ketamina 50[R] Holliday-Scott S.A., Argentina). Se practico una laparotomia mediana retroumbilical, a traves de la cual se exteriorizo el tracto reproductivo. Luego de contar el numero de cuerpos hemorragicos en cada ovario se procedio a canular el oviducto en el extremo anterior con un cateter de polietileno (diametro externo: 2 mm), el cual se fijo mediante una ligadura o pinza. Seguidamente, se introdujo una aguja con punta roma acoplada a una jeringa cargada con medio de lavado en el extremo craneal del cuerno uterino. Se ocluyo la luz del organo con los dedos pulgar e indice por detras de la aguja dejando fluir 10 mL de medio de lavado por el oviducto. El medio se recolecto en probetas de vidrio de volumen adecuado. Como medio de lavado o "flushing" se utilizo PBS de Dulbecco modificado (Gibco, Life Technologies Inc., EUA) pH 7,2 con el agregado de 1 mg/L de D-glucosa, 36 mg/L de piruvato de sodio, 25 [micron]g/mL de gentamicina y 10% de suero de cabra inactivado por calor (56[grados]C por 30 minutos). El procedimiento descrito anteriormente se repitio en el oviducto contralateral. El medio recuperado se transfirio a placas de Petri esteriles para el examen bajo lupa estereoscopica. Los embriones recuperados se transfirieron a PBS fresco y se mantuvieron a 38,5[grados]C hasta ser asignados a los diferentes tratamientos.

Obtencion de CEO

El oviducto que se utilizo en cada replica se obtuvo mediante salpingectomia unilateral de una cabra sin tener en cuenta la etapa del ciclo estral. En el animal anestesiado se exteriorizo el tracto reproductivo a traves de una incision mediana retroumbilical para proceder a la extirpacion del oviducto. Las CEO se prepararon siguiendo los lineamientos metodologicos descritos por otros autores [41, 51]. Antes de proceder a la extraccion de las CEO, el oviducto fue despojado de restos de mesosalpinx, se enjuago en TCM199 con el agregado de HEPES (25 mM), 25 [micron]g/mL de gentamicina y se seco con una gasa esteril. A continuacion el oviducto se coloco en una placa esteril de 100 x 20 mm con 3 mL de medio, se tomo con una pinza el extremo uterino del oviducto y con un portaobjetos se ejercio presion sobre el oviducto y al mismo tiempo se desplazo hacia el extremo ovarico forzando de este modo la salida de las celulas de la mucosa por el orificio anterior del oviducto. Para dispersar parcialmente las CEO recuperadas se hicieron pasar por una aguja 26 G acoplada a una jeringa. Por ultimo la suspension celular se transfirio a un tubo de centrifuga conteniendo 8 mL de TCM199 y se lavaron 4 veces reemplazando el sobrenadante cada 5 minutos. La masa celular sedimentada se suspendio en el mismo medio en una relacion de 1:50 (v/v), se distribuyo en frascos para cultivo de 25 [cm.sup.2] y se cultivaron 20-24 horas en atmosfera de 5% de C[O.sub.2] en aire a 38,5[grados]C y maxima humedad. Luego del cultivo las celulas se lavaron 2 veces en medio TCM199 como se describio anteriormente para eliminar las celulas muertas. De la masa de CEO sedimentadas se aspiro 1 [micron]L que fue adicionado a microgotas de 50 [micron]L de TCM199 preparadas bajo aceite mineral en placas para cultivo de 35 mm de diametro y se cultivaron por 3-5 horas bajo las condiciones anteriormente descritas, antes de recibir los embriones.

Preparacion del medio condicionado por CEO

Siguiendo la metodologia anteriormente detallada se obtuvieron CEO para preparar el medio condicionado. El sedimento celular se suspendio en 50 volumenes de TCM199; 10 mL de la suspension se cultivo en frascos para cultivo de 25 [cm.sup.2] en atmosfera de 5% de C[O.sub.2] en aire a 38,5[grados]C y maxima humedad. Luego de 48 horas de cultivo el sobrenadante se colecto, se centrifugo (1000 g x 10 minutos) y se almaceno alicuotado a -20[grados]C hasta su utilizacion.

Preparacion del FSO

Se uso el medio descrito originalmente por Tervit y col. [43].

Cultivo de embriones in vitro

Los embriones de 1-8 celulas provenientes de cada donante se distribuyeron al azar en los 3 tratamientos: a) cocultivo con CEO en TCM199; b) cultivo en SOF; c) cultivo en medio condicionado por CEO. El cultivo se llevo a cabo en microgotas de 50 [micron]L bajo aceite mineral en atmosfera de 5% de CO2 en aire (TCM199 y cocultivo) a 38,5[grados]C y maxima humedad durante 5 dias. El cultivo de embriones en SOF se llevo a cabo en atmosfera de 5% C[O.sub.2], 5% [O.sub.2], 90% [N.sub.2] a 38,5[grados]C y maxima humedad. Cada 2 dias se reemplazaron 30 [micron]L por igual volumen de medio nuevo (grupo 1: TCM199; grupo 2: SOF; grupo 3: medio condicionado).

Determinacion del desarrollo y viabilidad embrionaria

Concluido el periodo de cultivo se evaluo el estado de desarrollo embrionario determinando el numero de embriones que alcanzaron el estado de morula compacta y blastocisto.

El numero total de celulas por embrion se determino contando el numero de nucleos tenidos con lacmoid (colorante especifico para ADN) en una fraccion del numero total de embriones cultivados en cada tratamiento (TABLA II). Los embriones se fijaron en acido acetico (90%)-etanol (1:3, v/v), se tineron con dicho colorante y el numero de nucleos se determino por inspeccion en un microscopio de campo brillante.

Los embriones de la tercera replica del experimento que desarrollaron hasta morula compacta o blastocisto se transfirieron a dos cabras receptoras sincronizadas (dia 7 [+ o -] 1 del ciclo estral, dia 0 = inicio del celo). Las cabras receptoras recibieron esponjas intravaginales impregnadas con 60 mg de acetato de medroxiprogesterona (MAP) simultaneamente con el grupo de donantes de embriones, pero para lograr una mejor sincronizacion, las esponjas se retiraron 12 horas antes. En el momento del retiro recibieron 350 UI de PMSG (gonadotrofina serica de yegua prenada) por via intramuscular. Los embriones se transfirieron mediante una laparotomia mediana retroumbilical previa anestesia [3]. Los embriones se implantaron en el cuerno uterino ipsilateral al ovario con el(los) cuerpo(s) luteo(s). Con una aguja con punta roma se practico un pequeno orificio en la pared uterina a traves del cual se introdujo la pipeta con los embriones, depositandolos a 2-3 cm de distancia del orificio practicado. La supervivencia embrionaria se determino por la presencia del embrion con latido cardiaco al examen ultrasonografico en el dia 35 post-transferencia. Se utilizo un ecografo de diagnostico de tiempo real, modo B con un transductor lineal para uso transrectal de 5,0 MHz (Aloka SSD 500. Overseas Monitor Corporation Ltd. Vancouver, BC, Canada).

Analisis estadistico

Para comparar el porcentaje de embriones que alcanzaron el estado de morula/blastocisto en los diferentes tratamientos se aplico el Test Ji cuadrado [ji al cuadrado] de independencia [33]. Para la variable numero de celulas totales por embrion en los diferentes tratamientos se aplico el Test no parametrico Kruskal Wallis [32] (procedimiento alternativo a la prueba F del analisis de la varianza) con los datos transformados por rangos. Se realizo un test a posteriori para efectuar comparaciones de a pares. El analisis estadistico se realizo con el programa estadistico de distribucion gratuita R [36]. En todos los casos se consideraron significativas las diferencias con P < 0,05.

RESULTADOS

El 88,8% (16/18) de las cabras superovuladas presentaron celo dentro de las 24-36 horas de retiradas las esponjas intravaginales mientras que 2 cabras no manifestaron comportamiento estral, razon por la cual se las excluyo del experimento.

Se obtuvieron 193 embriones de 1-8 celulas (FIG. 1) y 23 no fecundados (11,9%) en 3 repeticiones del experimento (TABLA I). De los 193 embriones fertilizados colectados, 166 fueron utilizados para el cultivo in vitro en el presente estudio.

[FIGURA 1 OMITIR]

La respuesta superovulatoria obtenida en el presente experimento medida en numero medio de cuerpos luteos no se aparta de la reportada en un estudio previo [3], teniendo en cuenta el tratamiento superovulatorio, epoca del ano, raza y categoria de los animales utilizados.

Un mayor porcentaje de embriones se desarrollaron hasta el estado de morula/blastocisto en cocultivo comparado con los cultivados en SOF (75% vs. 41% respectivamente; P < 0,05) o MC (5,5%); mientras que el SOF resulto superior al MC para sustentar el desarrollo de los embriones caprinos hasta morula/blastocisto (TABLA II). La morfologia de los embriones generados en los diferentes sistemas de cultivo in vitro se muestran en la FIG. 2. En cuanto al numero medio de celulas, los embriones en cocultivo con CEO tenian mas celulas (FIG. 3) que los cultivados en SOF (15,3 vs. 8,1 celulas/embrion respectivamente; P < 0,05) y estos ultimos mas que los cultivados en MC (TABLA II).

[FIGURAS 2-3 OMITIR]

Morulas y blastocistos generados en cocultivo con CEO y SOF en la tercera repeticion del experimento fueron transferidos a 2 cabras receptoras sincronizadas para determinar la viabilidad de los embriones producidos. Dado que ninguno de los embriones cultivados en MC alcanzo el estado de morula o blastocisto no se efectuaron transferencias de embriones cultivados en dicho medio. Las 2 cabras receptoras presentaron celo dentro de las 24-48 horas luego del retiro de las esponjas intravaginales. Solo se transfirieron 4 blastocistos y 3 morulas cultivados en SOF al cuerno uterino izquierdo de una cabra receptora. Dicho animal presentaba 3 cuerpos luteos (CL) en el ovario izquierdo y 2 en el derecho.

Por otro lado, 8 morulas obtenidas a partir del cocultivo con CEO se transfirieron al utero de otra cabra receptora que presento un unico CL.

Al examen ultrasonografico 35 dias post-transferencia, en la cabra receptora de los embriones SOF se evidencio la presencia de fluido dentro del utero y 2 estructuras ecogenicas con latido cardiaco. En consecuencia la supervivencia embrionaria en este grupo alcanzo un 28,57% (2/7). La cabra receptora pario 2 cabritos en buen estado de salud 147 dias despues de la transferencia. La cabra receptora de los embriones cocultivados con CEO repitio celo a los 14 dias de haber recibido los embriones y a la exploracion ecografica no mostro signos de gestacion.

Luego de 24 horas de cultivo in vitro las CEO presentaban movimiento activo de los agregados celulares, denominados "gusanos" por su aspecto y movilidad (FIG. 4 A). A las 48 horas de cultivo las celulas comenzaron a adherirse al fondo de la placa de cultivo y alcanzaron 70-80% de confluencia a las 72 horas (FIG. 4 B), pudiendose observar en este momento celulas con cilios en movimiento adheridas al fondo del frasco de cultivo.

[FIGURA 4 OMITIR]

DISCUSION

Bajo las condiciones experimentales del presente estudio, el cocultivo mostro ser claramente superior en relacion a los otros dos tratamientos en su capacidad para promover el desarrollo embrionario in vitro. Tanto el porcentaje de embriones que alcanzaron el estado de morula como el numero de celulas por embrion fue significativamente superior bajo condiciones de cocultivo (TABLA II). Numerosos trabajos senalan un efecto positivo de las celulas en cocultivo sobre el desarrollo embrionario [2, 18, 19, 21, 26, 38, 40, 52]. Existen evidencias de que las CEO en cultivo no solamente aportarian sustancias clave para el desarrollo embrionario, sino que retirarian sustancias embriotoxicas [4, 27]. Sin embargo, los sistemas de cocultivo presentan ciertas desventajas tales como: la introduccion de agentes infecciosos al medio de cultivo de los embriones [30] y una mayor complejidad tecnica para su implementacion en comparacion con el uso de medios de composicion definida [4, 24].

Una menor proporcion de los embriones cultivados en SOF alcanzo el estado de morula/blastocisto (41,0%) con un numero medio de celulas por embrion inferior comparado con los embriones generados en cocultivo. Tervit y col. [43] utilizaron por primera vez el SOF para cultivar un numero pequeno de embriones ovinos y bovinos de 1 a 8 celulas durante 3 a 6 dias Estos autores comunican que 90% de los embriones ovinos y un 46,6% de embriones bovinos llegaron al estado de morula/blastocisto. Mas recientemente el SOF se ha utilizado con modificaciones de la formula original para cultivar embriones preimplantacionales de diferentes especies de animales domesticos con resultados variables [5, 20, 42]. Algunos requerimientos especificos de los embriones caprinos bajo condiciones de cultivo in vitro pueden explicar el fracaso de la formula original del SOF para estimular el desarrollo embrionario en esta especie.

Aunque existen numerosos metodos para estimar con mayor o menor precision la viabilidad embrionaria [9], la prueba concluyente es la capacidad para continuar el desarrollo una vez transferidos al utero de la hembra receptora y establecer la prenez. En el presente estudio los embriones obtenidos a partir del SOF fueron capaces de continuar el desarrollo en el utero de la cabra receptora. Sin embargo no podemos afirmar que los embriones obtenidos del cocultivo con CEO eran inviables, ya que el establecimiento de la prenez no depende solamente de factores embrionarios sino tambien de factores maternos. Entre estos ultimos es esencial la presencia de por lo menos un CL funcional [12] y niveles sericos de progesterona adecuados para promover los cambios secretorios uterinos que permitan el desarrollo embrionario. La cabra que recibio los embriones provenientes del cocultivo con CEO presento un solo CL de tamano mediano, con aspecto morfologico que podria haber sido compatible con un CL en regresion, aunque sin conocer los perfiles de progesterona serica no es posible afirmar la ocurrencia de este fenomeno. En ganado caprino se ha reportado un porcentaje elevado de animales con regresion luteal temprana luego de tratamientos superovulatorios con PMSG [6]. En el presente estudio, la ocurrencia de un CL de vida corta puede explicar la incapacidad de los embriones cocultivados con CEO para continuar el desarrollo luego de transferidos al utero receptor.

El porcentaje de embriones cultivados en SOF que continuo su desarrollo hasta el final de la gestacion luego de la transferencia alcanzo el 28,57%. Este valor es comparativamente inferior al reportado para embriones caprinos transferidos en fresco (50 a 60%) [1, 3], no contandose con informacion referente al porcentaje de supervivencia de embriones en la misma especie producidos in vitro. En el presente estudio, el hecho de haber transferido 7 embriones al mismo cuerno uterino puede haber afectado la tasa de supervivencia obtenida. Es conocido que existen interacciones entre los embriones en especies multiparas. Estudios de transferencia embrionaria han revelado factores competitivos entre embriones de diferente estado de desarrollo in utero. Cuando se transfirieron embriones ovinos de dia 4 y 8 a receptoras en el dia 6, el 70% de los embriones de dia 8 sobrevivieron hasta el dia 34, mientras que solamente sobrevivieron el 25% de los embriones atrasados [49]. Esto sugiere que variaciones en el estado de desarrollo entre embriones de una misma camada conduce a una inevitable perdida embrionaria.

Durante las primeras 24 horas de cultivo las CEO permanecieron en suspension mostrando el caracteristico movimiento de los agregados celulares. A partir de las 24 horas comenzo la adherencia al fondo de la placa alcanzando un 70-80% de confluencia a las 72 horas de cultivo. Un comportamiento similar se ha reportado para CEO bovinas cultivadas in vitro [51]. Utilizando un metodo enzimatico para la obtencion de las CEO bovinas, se observo el primer signo de adhesion a las 72 horas de cultivo, y a los 7 dias de cultivo confluencia total de las monocapas celulares [48]. A pesar de haber sido utilizado el cocultivo con CEO de origen caprino para estimular el desarrollo in vitro de embriones en esta especie [34, 40], al presente no se ha caracterizado la capacidad de adherencia y velocidad de crecimiento in vitro de CEO de origen caprino.

CONCLUSION

Los resultados obtenidos permiten asignarle al cocultivo con CEO una capacidad superior para sustentar el desarrollo de embriones preimplantacionales caprinos en relacion con los otros dos sistemas estudiados. El SOF presenta una menor capacidad para estimular el desarrollo embrionario in vitro comparado con el cocultivo, pero los embriones obtenidos son capaces de continuar desarrollando una vez transferidos al utero de una cabra receptora. Estudios adicionales seran necesarios para establecer la viabilidad de los embriones originados en cocultivo con CEO.

AGRADECIMIENTO

El presente estudio fue subsidiado por PRIRA-CONICET y Universidad Nacional de Rio Cuarto, Cordoba, Argentina.

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Pablo Bosch (1), Maria S. Blanch (1), Susana Ferrero (2), Hernan Diaz (1), Fernando Piccatto (1) y Ricardo A. Bosch (1)

(1) Departamento de Reproduccion Animal, Facultad de Agronomia y Veterinaria.

(2) Departamento de Matematica, Facultad de Ciencias Exactas Fisico-Quimicas y Naturales, Universidad Nacional de Rio Cuarto. Cordoba, Argentina. boschp@gmail.com.

Recibido: 14/01/2005. Aceptado: 16/03/2006.
TABLA I
RESPUESTA SUPEROVULATORIA Y NUMERO DE EMBRIONES COLECTADOS
EN TRES REPLICAS DEL EXPERIMENTO / SUPEROVULATORY RESPONSE AND
NUMBER OF EMBRYOS COLLECTED IN THREE REPLICATES OF THE EXPERIMENT

   No de cabras                No            No de embriones
 que respondieron      de cuerpos luteos      colectados por
  al tratamiento                              cabra ([double
  superovulatorio                                dagger])
 en las 3 replicas

        16             14,8 [+ o -] 9,3 *    11,3 [+ o -] 8,7 *

   No de cabras            Eficiencia
 que respondieron        de la colecta
  al tratamiento           ([dagger])
  superovulatorio
 en las 3 replicas

        16                    76,3%

* Media [+ o -] desviacion estandar. ([dagger]) No de embriones
colectados /No de cuerpos luteos x 100. ([dagger double])
Incluye infertilizados.

TABLA II
DESARROLLO Y NUMERO DE CELULAS EN EMBRIONES CAPRINOS CULTIVADOS
IN VITRO EN DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO / IN VITRO DEVELOPMENT
AND NUMBER OF CELLS OF EMBRYOS CULTURED IN DIFFERENT CULTURE MEDIA

Parametro                                  Sistema de cultivo

                                          CEO                 SOF
No de morulas y blastocisto
s/No de embriones cultivados           42/56 (a)           23/56 (b)
(%)                                     (75,0%)             (41,0%)
No medio de celulas por embrion     15,3 (n =27) (a)    8,1 (n =20) (b)
(rango)                                  (2-30)             (3-13)

Parametro                                  MC

No de morulas y blastocisto
s/No de embriones cultivados            3/54 (c)
(%)                                      (5,5%)
N* medio de celulas por embrion     3,3 (n =13) (c)
(rango)                                  (1-7)

(a),(b),(c) Valores con diferentes superindices dentro de la misma fila
son estadisticamente diferentes (P <0,05).
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Author:Bosch, Pablo; Blanch, Maria S.; Ferrero, Susana; Diaz, Hernan; Piccatto, Fernando; Bosch, Ricardo A.
Publication:Revista Cientifica de la Facultad de Ciencias Veterinarias
Date:May 1, 2006
Words:6506
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