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Decoloration of DB2 (Direc T BR Own 2) by intracellular and extracelular enzyme from Trametes versicolor/Decoloracion de CD2 (Cafe Directo 2) por enzimas intracelulares y extracelulares de Trametes versicolor/ Descoloracao do CD2 (Cafe Direto 2) por enzimas intracelulares e extracelulares do Trametes versicolor.

SUMMARY

Textile dyes contamination representa global environmental problem. In this paper it is shown that discoloration of Direct Brown 2 (DB2) can be obtained using crude extracts of intracellular and extracellular enzymes and fungal biomass from Trametes versicolor cultured in liquid media with metallics inductors in its viable form. The experimental series were run at room temperature, 800 rpm and initial pH 4.5. Laccase activity was determined in each of the extracts. The discoloration percentage was determined by UV-Visible spectrophotometry. Assays were performed by triplicate. The use of extracellular enzymes such as laccase, lignin and manganese peroxidase led to the total discoloration of 50mg x [l.sup.-1] of DB2, after 88h; while the use of active mycelial biomass, allowed reaching a total discoloration after 3h for an initial DB2concentration of 100mg x [l.sup.-1]. It was found that DB2 removal efficiency with mycelia is comparable or higher than the one reported with immobilized Phanerochaete chrysosporium.

RESUMEN

La contaminacion por colorantes textiles representa un problema ecologico a nivel mundial. En el presente trabajo se mostro que es posible la decoloracion del Cafe Directo 2 (CD2) por medio de extractos crudos de enzimas intracelulares y extracelulares, asi como de la biomasa fungica de Trametes versicolor cultivado en medio liquido con inductores metalicos en su forma viable. La experimentacion se efectuo a temperatura ambiente, a 800rpm y con un pH inicial de 4,5; la actividad de lacasa se determino en cada uno de los extractos. El porcentaje de decoloracion se determino por espectrofotometria UV-Visible. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Los resultados evidenciaron una decoloracion total del CD2 con 50mg x [l.sup.-1] despues de 88h, utilizando enzimas extracelulares como lacasa, lignino fungica y manganeso peroxidasa; mientras que con la biomasa micelial activa, la decoloracion total se alcanzo despues de 3h para una concentracion inicial de 100mg x [l.sup.-1]de CD2. Se encontro que la remocion de CD2 con micelio es comparable o superior a la eficiencia de remocion reportada por los metodos de inmovilizacion con Phanerochaete chrysosporium.

RESUMO

A poluicao por corantes texteis representa um problema ecologico a nivel mundial Nesse trabalho foi mostrado-se que e possivel a deseoloracao do Cafe Direto 2 (CD2) por meio de extratos de enzimas intracelulares e extracelulares, bem como da biomassa fungicida de Trametes versicolor cultivados em meio liquido com indutores de metal en su forma. Os testes foram realizados a temperatura ambiente, a 800 rpm e com um pH inicial de 4,5. A atividade da lacasa determinou-se para cada um dos extratos e a porcentagem de descoloracao determinou-se por espectrofotome tria UV-Visivel. Todos os testes foram realizados por triplicado. Os resultados evidenciaram uma descoloracao total do CD2 com 50mg [l.sup.-1] apos 88h usando enzimas extracelulares como a lacasa, a lignina peroxidase e manganes peroxidase, enquanto que com a biomassa micelal atira a descoloracao total alcancou-se apos 3h para uma concentracao inicial de 100mg [l.sup.-1] do CD2. Encontrou-se que a remocao de CD2 com micelio e comparavel ou superior a eficiencia de remocao reportada por metodos de imobilizacao por Phanerochaete chrysosporium.

PALABRAS CLAVE / Colorantes Textiles / Hongos Ligninoliticos / Enzimas Intracelulares /

Recibido: 31/04/2011. Modificado: 09/03/2012. Aceptado: 12/03/2012.

Introduccion

La contaminacion ambiental ocasionada por los colorantes azo y bencidinicos no agotados en el proceso de tincion tiene como consecuencia el deterioro de ecosistemas y problemas de salud publica (Hao et al., 2000; Birhanli y Yesilada, 2006). Los metodos fisicoquimicos convencionales para el tratamiento de este tipo de efluentes, dificilmente logran la remocion completa de los colorantes en una sola etapa, lo que conlleva a un tratamiento posterior, incrementandose sus costos; ademas algunos subproductos generados pueden tener mayor toxicidad que la del propio colorante (Kandelbauer et al., 2004). La industria textil es una de las manufactureras que mas contamina al medio ambiente, ya sea a traves de sus efluentes depositarios de colorantes y subproductos potencialmente toxicos y cancerigenos, o al provocar desequilibrios ecologicos (Wuhrmann et al., 1980; Binupriya et al., 2008). Lo anterior ha ocasionado que la descarga de estos efluentes se convierta en uno de los problemas de contaminacion severa a nivel mundial (dos Santos et ai., 2007).

El Cafe Directo 2 (CD2) es una molecula que contiene un nucleo de bencidina (4,4 diaminodifenil) y dos grupos azo (Figura 1). La presencia de dos grupos sulfonicos en su estructura quimica permite que sea completamente soluble en agua. Asimismo, es un colorante prohibido por su elevada toxicidad y por contener bencidina, la cual es carcinogenica de acuerdo con la Agencia de Proteccion Ambiental de los EEUU (EPA, 2010). Sin embargo, hay muchos paises que continuan utilizando colorantes bencidinicos con enlaces azo; tal es el caso de Mexico, India y Tuquia (Joseph y Somashekar, 2000; Pazarlioglu et al., 2005). Algunas tecnologias aplicadas para tratar efluentes textiles conteniendo CD2 son la oxidacion avanzada (Perkowski y Kos, 2003) y la oxidacion termica (Odochian et al., 2007), procesos que tienen como inconveniente el empleo de equipos costosos. Por otro lado, los tratamientos anaerobios con lodos activados (Isik, 2004; Isik y Sponza, 2005, 2007), requieren tiempos de retencion de hasta 90 dias.

Los hongos de pudrieion blanca tales como el Phanerochaete chrysosporium, Trametes vesicolor y Pleurotus ostreatus, entre otros, han sido estudiados como agentes para la degradacion de colorantes sinteticos (Davila y Vazquez-Duhalt, 2006). Estos hongos producen enzimas extracelulares como la lignina peroxidasa, manganeso peroxidasa y lacasa, las cuales son capaces de oxidar compuestos aromaticos fenolicos y no fenolicos (Grgic y Perih, 2003; dos Santos et al., 2007). Esta caracteristica ha sido aprovechada para ser empleada en el tratamiento de aguas contaminadas por la industria textil.

El objetivo del presente trabajo fue evaluar extractos crudos y biomasa fungica para la remocion del CD2, discriminando entre enzimas intracelulares, extracelulares y asociadas.

Materiales y Metodos

Reactivos

En la preparacion de medios se utilizo Ca[Cl.sub.2], MnS[O.sub.4] x [H.sub.2]O CuS[O.sub.4] x 5[H.sub.2]O y ABTS (acido 2',2 azinobis -[3-etilbenzotiazolina-6 sulfonico]), todos de grado reactivo. El extracto de malta, de soya, dextrosa y agar papa dextrosa (PDA) fueron de la compania Bioxon. El CD2 (CAS 2429825), se adquirio a la empresa Dalaquimia, y su pureza corresponde al grado industrial.

[FIGURA 1 OMITTED]

Cepa

Las cepa pura de Trametes versicolor (Tv) fue proporcionada por Rafael Vazquez-Duhalt, Instituto de Biotecnologia, UNAM, Cuernavaca, Mexico.

Medio de cultivo para la preservacion del hongo

El Trametes versicolor fue preservado en un medio complejo solido, preparado con la composicion indicada en la Tabla I, esterilizado a 121[grados]C y 15psi durante 15min, y posteriormente vertido en cajas de Petri. La inoculacion se realizo cortando con bisturi el medio de cultivo solido en secciones de 1[cm.sup.2] y colocando el fragmento en la parte central de cada caia preparada; los cultivos se incubaron a 30[grados]C por 7 dias. Posteriormente se mantuvieron las cajas de Petri a 4[grados]C para uso posterior.

Seleccion de medio de cultivo liquido para produccion de micelio

Con la finalidad de incrementar la actividad enzimatica se probaron dos medios de cultivo liquidos (A y B) cuya composicion es:

Medio con inductores de tipo metalico (medio A). Este medio se preparo con 0,05g x [l.sup.-1] de cada uno de los inductores CuS[O.sub.4] x 5[H.sub.2]O y MnS[O.sub.4] x [H.sub.2]O, suplementado con extracto de paja, malta y Ca[Cl.sub.2] x 2[H.sub.2]O en concentraciones de 100, 20 y 0,05g x [l.sup.-1], respectivamente. El metodo seguido para la preparacion del medio liquido es el reportado por Sainos et al. (2006).

Medio sin inductores de tipo metalico (Medio B). Esta variante de medio se preparo unicamente con extracto de paja, el cual tambien induce la produccion de enzimas (Hossain, 2008), y malta en las concentraciones anteriormente descritas y siguiendo la misma metodologia.

Los medios A y B fueron repartidos en ocho matraces Erlenmeyer de 500ml, esterilizados a 121[grados]C y 15psi, durante 15min. Posteriormente se inoculo cada matraz con una seccion de 1[cm.sup.2] del hongo (Tv), el control fue el medio de cultivo esteril sin inoculo. Los matraces inoculados se mantuvieron en incubacion estatica a 30[grados]C por un periodo de 15 dias. La carpeta de biomasa fungica fue separada con pinzas esteriles del medio liquido y la actividad lacasa se determino por triplicado en el extracto crudo.

Actividad lacasa

La actividad lacasa se determino espectrofotometricamente. Se preparo un volumen total de reaccion de 1ml, conteniendo 100[micron]l de amortiguador de acetatos 1M a pH 5, 700[micron]l de agua destilada, 100[micron]l de extracto enzimatico y 100[micron]l de sustrato ABTS 5mM. Las muestras se mezclaron suficientemente y fueron incubadas a 25[grados]C. Se leyo cada 15s el cambio de absorbancia a 414nm, por 3min, usando un espectrofotometro UV-Visible Genesys 5, y los resultados se graficaron contra el tiempo. Para calcular la actividad lacasa se considero el coeficiente de extincion molar del ABTS de 36000[M.sup.-1][cm.sup.-1] (Bourbonnais y Paice 1997; Jung et al., 2002). Una unidad de actividad (U) se definio como la cantidad de enzima que oxida 1[micron]mol de sustrato por minuto bajo las condiciones de reaccion.

Obtencion de extractos enzimaticos

a) Enzimas intracelulares. Para la extraccion de enzimas intracelulares se utilizo la biomasa fungica cultivada en matraces Erlenmeyer de 250ml conteniendo 150ml de medio liquido A. A fin de eliminar las enzimas asociadas al micelio, cada carpeta de biomasa fungica se lavo con agua esteril y se seco con papel filtro; posteriormente el micelio se macero en un mortero de porcelana y se coloco en un matraz Erlenmeyer de 500ml, agregando 200ml de agua esteril, y dejando en agitacion orbital durante 24h a 30[grados]C. El procedimiento de extraccion se hizo por triplicado en condiciones esteriles.

b) Enzimas asociadas a la carpeta de biomasa fungica. La extraccion de enzimas asociadas se realizo separando cada micelio del medio liquido y colocandolo en matraz de 500ml. A cada matraz se le adiciono 200ml de agua esteril y se dejo en agitacion orbital durante 24h a 30[grados]C. Posteriormente la biomasa fungica fue separada y el liquido residual se utilizo como extracto crudo.

c) Mezcla de enzimas intracelulares y asociadas. Se preparo una mezcla con volumenes iguales de los extractos de enzimas intracelulares y de las asociadas (Tabla II).

Ensayos de decoloracion con extractos enzimaticos

En tubos de ensayo de 50ml se colocaron 21,42ml de cada uno de los diferentes extractos enzimaticos con 8,57ml de CD2 conteniendo 175mg x [l.sup.-1], volumen que corresponde a una concentracion final de 50mg x [l.sup.-1] del colorante. Los ensayos se efectuaron a 800rpm, temperatura ambiente, y con un pH inicial de 4,5. El ajuste de pH se realizo con acido acetico 0,2M y acetato de sodio 0,2M. Para cada bioensayo, se preparo un blanco conteniendo agua y extracto (Tabla II) en la misma proporcion en volumen de colorante y extracto, como la empleada en los ensayos del CD2. La decoloracion del CD2 se analizo por medio de un espectrofotometro Hewlett-Packard HP-8453. El porcentaje de decoloracion se determino de acuerdo a la formula %= 100 (Abs CD2 - Abs Extracto)/Abs CD2 inicial

donde Abs CD2: absorbancia registrada del colorante a la longitud de onda de maxima absoreion del CD2 (480nm), y Abs Extracto: absorbancia a 480nm de la mezcla (extracto crudo y CD2), despues de un tiempo dado de reaccion.

En todas las determinaciones espectrofotometricas se utilizo como cero, el blanco correspondiente a cada mezcla de reaccion, el cual se preparo con extracto crudo y agua esteril en la misma proporcion en volumen que en los ensayos enzimaticos con CD2. Las mediciones se realizaron a las 17, 39, 60 y 88h. Las muestras utilizadas para el analisis fueron centrifugadas a 4000rpm por 15min y el sobrenadante fue empleado para el analisis espectrofotometrico. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Ensayos con biomasa micelial

Enotra serie de experimentos, la biomasa fungica fue retirada del medio de cultivo liquido y molida en mortero bajo condiciones esteriles. Se utilizaron dos variantes: tratada termicamente por el proceso de esterilizacion (a 121[degrees]C y 15psi por 15min) para desactivacion de enzimas y en su forma activa, sin tratamiento termico. Se emplearon 2, 4 y 6g x [l.sup.-1] de micelio molido, a los que se adiciono CD2 en una concentracion de 100mg x [l.sup.-1]. Para cada ensayo se preparo un blanco enzimatico (la misma cantidad en g x [l.sup.-1] de micelio mezclado con agua destilada); este blanco fue utilizado como cero en las mediciones espectrofotometricas. Los ensayos se efectuaron bajo las mismas condiciones de reaccion que los extractos enzimaticos, con un tiempo de reaccion de 3h.

Resultados y Discusion

Efecto de inductores metalicos en la actividad lacasa

Se realizo un analisis de varianza de un factor por medio del programa estadistico de Excel[R], teniendo como variable de respuesta la actividad enzimatica, entre los medios liquidos preparados con y sin inductores. Los resultados de esta prueba mostraron una diferencia significativa (p>0,05) entre ambos medios, por lo que se infiere que la adicion de inductores incremento la actividad de las enzimas lacasa del medio liquido, cuya actividad fue 0,246 [+ o -]0,027U/ml, y sin inductores de solo 0,138 [+ o -]0,025U/ml. No obstante el medio B, cuya composicion fue a base de extracto de paja y malta unicamente, funciono tambien como inductor, ya que este ha sido empleado como sustrato en la produccion de enzimas ligninoliticas (Garcia y Torres, 2003; Sainos et al., 2006).

Decoloracion por extractos enzimaticos y por enzimas extracelulares

En la Figura 2 se compara la remocion de color obtenida a lo largo de 88h. Como puede observarse, con las enzimas extracelulares se logro una reduccion total de color; mientras que con las intracelulares fue de solo 57,62%, y con la mezcla de intracelulares-asociadas se tuvo 51,87%. La menor reduccion de color (35,61%) se obtuvo al usar solamente las asociadas a la carpeta de biomasa fungica. En la Figura 3 puede observarse que el porcentaje de decoloracion fue acorde con la actividad enzimatica lacasa dado que a mayor actividad se observo una mayor decoloracion, con excepcion de las enzimas extracelulares, en las cuales la decoloracion puede estar influenciada por la probable presencia de otro tipo de enzimas extracelulares como la MnP (Grgic y Perih, 2003).

Cabe resaltar que tanto las enzimas intracelulares como las asociadas fueron tambien son capaces de biodegradar al CD2, de manera semejante a lo observado con otro tipo de contaminantes organicos y complejos enzimaticos intracelulares, como reportan Levin et al. (2003). Esto evidencia que las enzimas intracelulares y las asociadas al micelio pueden degradar al CD2 sin intervencion de las enzima extracelulares, contrario a lo que comunmente se ha reportado sobre la degradacion de compuestos azo (Koroleva et al., 2002; Wesenberg et al., 2003; dos Santos et al., 2007). Por otro lado, la combinacion de enzimas intracelulares y asociadas no produjo sinergia en la decoloracion, dado que sus porcentajes de decoloracion se mantuvieron en el promedio de las enzimas intracelulares y asociadas. Esto puede atribuirse a la baja actividad lacasa que presentaron las enzimas asociadas, que al combinarse con las intracelulares, de mayor actividad, redujeron la actividad total del extracto y, por lo tanto, el porcentaje de decoloracion. Por otra parte, el posible mecanismo de accion de la lacasa sobre el colorante pudo haberse iniciado en los enlaces O-H y N-H de la molecula del CD2 (Figura 5), para formar radicales fenoxilos y radicales amino, dado que las reacciones catalizadas por lacasas sustraen un electron de sustratos polifenolicos para formar radicales cationicos aromaticos (Abdulla et al., 2000; Zille et al., 2005).

Decoloracion por biomasa fungica

En las Figuras 4 y 6 se aprecia que la decoloracion del CD2 se incremento a medida que aumento la concentracion de micelio molido; sin embargo, la capacidad de adsorcion maxima para cada concentracion fue muy similar 9,97; 10,37 y 10,08mg CD2/g de micelio, en 3h de contacto del micelio con el colorante. La similitud en los resultados de capacidad de adsorcion significa que despues de la saturacion del micelio con el CD2, la decoloracion adicional, se debe a la accion enzimatica; no obstante, la secuencia en el fenomeno de adsorcion y accion enzimatica, o el paralelismo entre ambos procesos, dependera de la velocidad de adsorcion y de la velocidad de reaccion enzimatica, las que son funcion de los coeficientes de transporte de masa y coeficientes cineticos (Atkinson, 2002). Lo anterior explica que manteniendo constante la concentracion de CD2, los porcentajes globales de remocion (adsorcion y reaccion) fueran mayores a mayor concentracion de micelio, siendo la remocion global de color de 18,9; 63,2 y 94,2% para 2, 4 y 6g x [l.sup.-1], respectivamente. La bioadsorcion de colorantes se presenta en celulas vivas e inactivas (Isik y Sponza, 2005), fenomeno que involucra interacciones fisicoquimicas (Pazarlioglu et al., 2005) que pueden favorecer el proceso de decoloracion (Selvam et al., 2003). Por otro lado, Wang y Yu (1998) reportaron que la adsorcion va seguida de una biodegradacion del colorante adsorbido en micelio de T. versicolor, lo que es importante porque sugiere la accion de enzimas asociadas a la pa red celular del micelio.

[FIGURA 2 OMITTED]

[FIGURA 3 OMITTED]

[FIGURA 4 OMITTED]

[FIGURA 5 OMITTED]

La combinacion de enzimas intracelulares y asociadas al micelio molido activo tambien evidencio su capacidad de biodegradacion del CD2 por accion enzimatica (Figura 6), tal como se observo en la de- coloracion por extractos crudos. Es importante mencionar que la adicion de los efectos de adsorcion y de accion enzimatica logro que en 3h se obtuviera una mayor eficiencia en la remocion de color (94ppm con 6g x [l.sup.-1] de micelio) respecto a los metodos tradicionales ya que, por citar un ejemplo, para una solucion de CD2 con 50ppm, un tratamiento con lodos activados produjo una reduccion del 100% con un tiempo de retencion hidraulica de 20h (Isik, 2004). Algunas modificaciones en este modelo experimental permitieron que el tiempo de retencion se redujera a 6h (Isik y Sponza, 2005). En el caso de los procesos de oxidacion avanzada, Perkowski y Kos (2003) utilizaron una concentracion de 30mg x [l.sup.-1] requiriendo 2h para una oxidacion total. Por su parte, la inmovilizacion de Phanerochaete chrysosporium en piedra pomez activada con ZrO[Cl.sub.2] permitio una decoloracion de 95-100% en un tiempo de 6 dias para una concentracion inicial de 120mg x [l.sup.-1] (Pazarlioglu et al., 2005).

[FIGURA 6 OMITTED]

Conclusiones

Las enzimas intracelulares, asociadas y extracelulares del Trametes versicolor tienen la capacidad de decolorar al CD2, al igual que la biomasa fungica, ya sea tratada termicamente o en forma activa. La remocion del CD2 en 3h para una concentracion de 100mg x [l.sup.-1], tuvo una mayor eficiencia que en otros estudios reportados. Los extractos crudos, asi como la biomasa micelial podrian implementarse a nivel industrial sin depender de las condiciones de cultivo o de los requerimientos de los procesos de inmovilizacion, ademas de que pueden ser eficientes y economicos por la cantidad de colorante que se puede remover en tiempos menores a los reportados por otros metodos.

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Maribel Cano. Ingeniera Quimica, Maestra en Ingenieria Quimica y candidata a Doctor en Biotecnologia Avanzada, Centro de Investigacion en Biotecnologia Aplicada, Instituto Politecnico Nacional (CIBA-IPN), Mexico. Profesora, Instituto Tecnologico del Altiplano de Tlaxcala, Mexico. e-mail: maribel_cano @hotmail.com

Myrna Solis. Ingeniera Quimica y Maestra en Administracion y Doctora en Biotecnologia, Universidad Autonoma Metropolitana (UAM), Mexico. Profesora, CIBA-IPN, Mexico.

Aida Solis O. Doctora en Ciencias Biologicas, UAM, Mexico. Profesora Investigadora, UAM, Mexico. Direccion: Departamento de Sistemas Biologicos, UAM, Xochimilco. Calz. del Hueso 1100, Col. Villa Quietud, Coyoacan. 04960 Mexico, D.F,. Mexico. e-mail: asolis@correo.xoc. uam.mx

Octavio Loera. Doctor en Bioquimica y Biologia Molecular de Hongos, Manchester University, RU. Profesor Investigador, UAM, Mexico.

Herminia I. Perez. Doctora en Ciencias Biologicas, UAM, Mexico. Profesora Investigadora, UAM, Xochimilco, Mexico.

Ma. Maura Margarita Teutli. Doctora en Ciencias, UAM, Mexico. Profesora Investigadora, Benemerita Universidad Autonoma de Puebla, Mexico.
TABLA I
COMPOSICION
DEL MEDIO COMPLEJO

Sustancia              g x [l.sup.-1]

Extracto de levadura         3,0
Extracto de malta            3,0
Peptona de soya              5,0
Eextrosa                    10,0
PDA                         40,0

TABLA II
COMPOSICION DE LA MEZCLA DE REACCION DE EXTRACTOS Y CD2

Tipo           Composicion                    Blanco
de extracto

Extracelular   21,42ml ML + 8,5m1             5ml ML + 2ml [H.sub.2]O
(ML)           175mg x [l.sup.-1] CD2

Intracelular   21,42ml Int + 8,57ml           5ml Int + 2ml [H.sub.2]O
(Int)          175mg x [l.sup.-1] CD2

Asociadas      21,42m] Aso + 8,57ml           5ml Aso + 2ml [H.sub.2]O
(Aso)          175mg x [l.sup.-1] CD2

Combinacion    10,52mL Int + 10,52m] Aso +    2,5ml Int + 2,.5ml Aso +
(IntAso)       8,57ml 175 [mg.sup.-1] CD2     2ml [H.sub.2]O
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Author:Cano, Maribel; Solis, Myrna; Solis, Aida; Loera, Octavio; Perez, Herminia I.; Teutli, Ma. Maura Marg
Publication:Interciencia
Date:Apr 1, 2012
Words:4250
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