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Dano vascular inducido en el pie equino por veneno de la serpiente Bothrops diporus.

Vascular damage in horse hoof caused by Bothorps diporus snake venom.

INTRODUCCION

La region del pie equino, en su punto mas distal, reune a la dermis y una modificacion de la epidermis, el casco, formando la union dermo-epidermica. El estuche corneo que recubre a la tercera falange se caracteriza por ser avascular y, para la adecuada nutricion e intercambio gaseoso de sus celulas basales, depende de la irrigacion proporcionada por el tejido dermico (18, 19).

La union dermo-epidermica o engranaje queratopodofiloso, se establece asi entre las laminas epidermicas (primarias y secundarias) y laminas dermicas (primarias y secundarias). En la microcirculacion del tejido laminar dermico se encuentran numerosas anastomosis arteriovenosas (500/ [cm.sup.2]), que surgen de ramas de las arterias axiales (16, 20). Las anastomosis unen arterias y venas sin pasar por los capilares, constituyendo una via alternativa para la circulacion de la sangre (13).

De esta manera, cuando el pie alcanza una temperatura critica, la lenta circulacion de mantenimiento de la dermis pasa inmediatamente a una circulacion rapida de calentamiento mediante la apertura refleja de las multiples anastomosis arteriovenosas (20). Ello demuestra la importancia de los vasos sanguineos del pie equino, particularmente compleja en la zona de talones, de quien depende la eficiencia de trabajo del animal, constituyendo una region anatomica muy vascular y -por su accesibilidad- favorable para obtener biopsias destinadas al estudio de posibles efectos adversos inducidos por sustancias toxicas.

Diferentes etiologias con accion sistemica pueden alterar dicha red vascular u otras estructuras de la union dermo-epidermica del pie (1,12), como las intoxicaciones causadas por veneno de serpientes, especificamente las del genero Bothrops (5,27). Estos efectos son inducidos por una variedad de componentes como fosfolipasa [A.sub.2] y metaloproteinasas (hemorraginas), entre otros (8,9).

Las hemorraginas afectan al endotelio capilar, predisponiendo a hemorragias in situ y al pasar al torrente vascular este efecto puede presentarse en distintos organos (2, 7, 9). Recientemente se ha demostrado la accion sinergica entre las proteinas contenidas en los venenos, razon por la cual los efectos causados se deben a la accion conjunta de sus componentes. No obstante el efecto de potenciacion, es sabido que cada proteina cumple un rol definido en la intoxicacion (11).

El pie equino cuenta con un denso paquete de arterias laminares interconectadas, ramas abaxiales cortas y capilares interconectados en direccion abaxial (21) , que lo convierten en un buen modelo experimental para la realizacion de ensayos tendientes a determinar mecanismos de accion de toxinas in vitro sobre la red vascular. Aunque los venenos botropicos han sido ampliamente estudiados, es de interes complementar su caracterizacion extendiendo los estudios a su impacto en el sistema hemostatico, especialmente porque en Argentina las serpientes son responsables de un gran numero de accidentes (22).

El objetivo de este trabajo fue analizar los efectos que causa el veneno entero de Bothrops diporus sobre la densa red vascular que irriga al pie equino, a traves de biopsias obtenidas en la zona de talones, sin comprometer la vida del animal, avalados por los antecedentes ya mencionados que demuestran su sensibilidad a la accion de toxinas ofidicas. El modelo propuesto es valido para el estudio de la accion de proteinas aisladas de los venenos, para luego interpretar la fisiopatologia de la intoxicacion.

MATERIAL Y METODOS

Obtencion y conservacion del veneno. Se obtuvo un pool de veneno de especimenes adultos de Bothrops diporus capturados en el nordeste argentino y mantenidos en un serpentario de la ciudad de Corrientes, Argentina. El veneno fue desecado a temperatura ambiente y mantenido a -20[grados]C. Al momento de su uso, fue disuelto con solucion salina de buffer fosfato pH 7,2.

Toma de muestras (biopsias) de pies equinos. La toma de muestra se realizo, a partir de los talones del pie de cinco equinos de raza indefinida, de 3 a 15 anos de edad, en el quirofano de la Facultad de Ciencias Veterinarias-UNNE, previo lavado intenso de los miembros, mediante biopsias 15 . Los animales fueron tranquilizados con maleato de acepromacina 1% a dosis de 0,05 mg/kg. Luego se realizo el adelgazamiento del casco a nivel de la region de talones utilizando una escofina. Posteriormente se procedio al bloqueo abaxial mediante anestesia perineural con lidocaina al 2% a razon de 3 ml. Previa antisepsia de la zona, se efectuo una incision de 0,5 x 1 cm con bisturi hoja No. 24. A continuacion se realizo vendaje compresivo previa colocacion de torunda de gasa esteril embebida con Povidona-iodo 3%. El tratamiento posquirurgico consistio en el cambio de vendajes cada 12 h y antibioticoterapia con penicilina-estreptomicina (22.000 UI/ kg) combinada con analgesicos (fenilbutazona a dosis de 2,2 mg/kg. cada 24 h).

Procesamiento de las muestras. Las muestras obtenidas fueron colectadas en recipiente esteril e inmediatamente reducidas a fragmentos mas pequenos de aproximadamente 0,5x0,1 cm (12 muestras por animal), incluyendo en el corte al menos 4 laminas primarias. Posteriormente se lavaron con solucion fisiologica mediante pasajes sucesivos en cajas de Petri esteriles, bajo flujo laminar, totalizando 5 pasajes o lavados (17). Las muestras fueron colocadas en placa de cultivo celular Cellstar[R] de 12 Wells, conteniendo medio de cultivo DMEM. Para las incubaciones se establecio un grupo control, el cual fue incubado en Wells conteniendo solamente el medio de cultivo y un grupo tratado incubado con el agregado de 50 pg de veneno entero de B. diporus en estufa de 37[grados]C, 5% de dioxido de carbono y 95% de humedad, durante 24 y 48 hs.

Microscopia optica y electronica de transmision. Concluida la incubacion, las muestras se fijaron en formaldehido bufferado al 10% por el termino de 24 h para luego ser procesadas con las tecnicas clasicas para histopatologia y tenidas con Hematoxilina Eosina (HyE) y Acido Peryodico de Schiff (PAS). Las muestras destinadas a microscopia de transmision fueron fijadas en glutaraldehido al 2,5% en buffer fosfato 0,1 M, pH 7,4 post-fijado en tetroxido de osmio al 1% en buffer fosfato 0,1 M, pH 7,4; lavado en solucion de sucrosa. Luego los tejidos fueron deshidratados en etanol en concentracion creciente y finalmente embebidos en epon (resina). Se efectuaron cortes ultrafinos que fueron observados con microscopio electronico de transmision JEOL 1210 TEM con GATAN double-tilt stage.

RESULTADOS

Resultados histopatologicos. Las muestras control, coloreados con hematoxilina-eosina, al ser observadas a traves de microscopia optica mostraron vasos sanguineos con caracteristicas normales, con paredes constituidas por una tunica intima, de epitelio plano simple, tunica intermedia y adventicia. La tecnica de PAS permitio ademas poner de manifiesto la integridad y continuidad de la membrana basal, por lo cual resulto mas significativa para el analisis histopatologico de las muestras (Figuras A y B).

En los cortes histologicos correspondientes a la incubacion de los explants (muestras de tejido vivo) con 50 pg de veneno de B. diporus, incubados durante 24 h y coloreados con hematoxilina-eosina, se observaron arteriolas que presentaban desprendimiento de algunas de sus celulas endoteliales, mientras otras aparecian parcialmente desprendidas de su membrana basal. Los nucleos se encontraban fuertemente basofilos, aumentados de tamano y de forma redondeada, muchos de ellos aparentaban no estar rodeados por citoplasma, lo cual permite hace inferir la posibilidad de que no solo haya existido desprendimiento, sino tambien ruptura de la membrana celular como producto de un proceso apoptotico.

La alteracion de la morfologia nuclear fue repetitiva en la tunica media de los vasos, en la cual pudo apreciarse, ademas, la separacion de las fibras colagenas que la componen, evidenciable por la aparicion de espacios blancos entre las mismas. Las metaarteriolas presentaban disrupcion de la pared vascular, evidenciandose separacion de las capas que forman su tunica media, con macrocariosis endotelial.

Las venulas observadas a traves de esta tecnica mostraron los danos ya mencionados para las arteriolas y metaarteriolas en su tunica intima, manifestandose ademas la ruptura de la pared vascular. En los vasos venosos fue facilmente apreciable el conjunto de lesiones antes mencionadas, particularmente en lo que respecta a la tunica intima vascular, dado que presentaban un diametro de luz considerable, que permitia su analisis detallado. La tecnica de PAS permitio puntualizar la localizacion de dano a nivel de la membrana basal de las celulas endoteliales de todos los vasos sanguineos estudiados (Figuras C y D).

Miscroscopia electronica. La tecnica de transmision permitio observar con detalle el nucleo celular, que presentaba forma y tamano normal, con eje longitudinal mayor al transversal, cromatina de aspecto normal y membrana nuclear intacta. El citoplasma revelo caracteristicas normales, distinguiendose mitocondrias con electrodensidad normal. En el citosol se observo ademas la presencia de numerosas vesiculas pinociticas, caracteristicas de las celulas endoteliales; las mismas presentaban tamano regular y distribucion homogenea. Las celulas que formaban parte del endotelio presentaban uniones normales entre ellas y la membrana basal, manteniendose la integridad y continuidad de esta ultima (Figura E).

En las muestras tratadas se detecto desprendimiento de celulas endoteliales que se hallaban dentro de la luz de los vasos sanguineos; sumado a esto se logro identificar falta de continuidad en la pared vascular. Las celulas endoteliales se presentaron aumentadas de tamano, con lamina basal discontinua, mostrando sectores con desprendimiento de su union a las celulas endoteliales.

Los nucleos endoteliales presentaron anisocariosis y macrocariosis. Las mitocondrias destacaban en el citoplasma ubicadas en puntos determinados del mismo, con aumento de la electrodensidad. Las vesiculas pinociticas citoplasmaticas mostraban tamano variable, con distribucion irregular, agrupandose en forma mas densa en algunos sectores y ausentes en otros. Las uniones intercelulares estaban alteradas, revelandose separacion entre celulas adyacentes (Figura F).

DISCUSION

Este trabajo revela la utilidad de la biopsia del pie equino--como cultivo primario--para el estudio de las alteraciones de la red vascular inducida por toxinas de veneno de serpiente. El modelo experimental constituye una herramienta valiosa considerando que la toma de muestra (biopsia), no afecta la salud del equino, quien sufre una pequena herida que no causa ningun trastorno dado que el material obtenido es reducido. Las lesiones observadas fueron repetitivas en todas las muestras estudiadas.

Estudios anteriores demostraron que la hemorragia desencadenada por el veneno de viperidos es inducida por las metaloproteinasas del veneno de serpientes, siendo las venulas y capilares los vasos mas afectados (6), como se observo en este trabajo sumando las lesiones observadas en arteriolas y metarteriolas.

Estudios realizados con jararhagina, una metaloproteinasa aislada del veneno de B. jararaca, determinaron que la hemorragia inducida era el resultado de diferentes actividades tales como la degradacion de proteinas de la matriz subendotelial, que causa disrupcion del endotelio vascular, interfirienro tambien con la agregacion y la adhesion plaquetaria mediadas por colageno (10). Otros autores demostraron que tambien inducen a apoptosis de celulas endoteliales (26).

Se ha comprobado que las metaloproteinasas aisladas de venenos de serpientes, inhiben indirectamente la proliferacion celular por liberacion de componentes similares a angiostatina (25), una enzima derivada de la degradacion del plasminogeno, que tiene accion antiangiogenica, lo cual limitaria lo senalado ut supra, asi como tambien la consecuentemente regeneracion tisular. Los efectos hasta aqui mencionados son secuelas que ocurren in vivo.

Sin embargo, las metaloproteinasas de venenos de serpiente, son capaces de inducir la apoptosis de celulas endoteliales en ensayos in vitro. De igual manera, varios autores revelaron la habilidad de estas enzimas para hidrolizar varios componentes de la membrana basal in vitro (3), resultados coincidentes con los obtenidos en este trabajo.

Se han aislado y caracterizado parcialmente varias metaloproteinasas hemorragicas del veneno de Bothrops asper, la principal serpiente venenosa en la region centroamericana. Tales estudios permitieron proponer la hipotesis que estas enzimas, que son metaloproteinasas dependientes de zinc, hidrolizan algunas proteinas que componen la lamina basal que rodea las celulas endoteliales de los vasos capilares y de las venulas (2), lo cual ha sido documentado para otras especies de serpientes en ensayos in vitro (14,23). La necrosis y muerte de celulas endoteliales fue ampliamente acreditada en ensayos in vitro (2).

El hallazgo del desprendimiento de celulas endoteliales de la membrana basal reportado en este trabajo, tiene antecedentes en las producciones de otros autores que estudiaron el efecto de metaloproteinasas de viperidos, determinando que estos componentes de los venenos interfiere con las moleculas de adhesion entre celulas endoteliales y la matriz extracelular, afectando la organizacion de filamentos de actina y fibras de estres, las cuales culminan en muerte celular por apoptosis (4,26).

Concluyendo, los hallazgos ultraestructurales revelados por la microscopia electronica de transmision fueron variados, incluyendo ruptura de la union intercelular, modificacion de la electrodensidad y aparicion de indentaciones que deformaron el nucleo, aumentaron el tamano y electrodensidad mitocondrial y disminuyeron el numero de vesiculas citoplasmaticas pinociticas, en coincidencia con los resultados encontrados en ensayos in vivo con veneno entero de Bothrops jararacussu (24).

Recibido: 12 octubre 2016 / Aceptado: 24 febrero 2017

Agradecimientos. A la Prof. Dra. Ofelia Acosta de Perez por su valiosa colaboracion en la revision del trabajo. A la Directora del CEPSAN Lic. Laura Rey, por donar el veneno de Bothrops diporus para la realizacion del estudio.

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Catedras de Farmacologia [1], Cinica de Grandes Animales [2] y Bioquimica [3], Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Nordeste (UNNE), Cabral 2139, Corrientes, Argentina. [4] Catedra de Quimica Biologica I, Fac.Ciencias Exactas, UNNE. E-mail: pteibler@gmail.com

Leyenda: Figura A. Union dermo-epidermica de pie equino control. Se observan laminas epidermicas primarias (P) y secundarias (E, S). Notese la membrana basal continua unida a las celulas epidermicas basales (flecha negra grande), venulas de paredes delgadas con endotelio normal (punta de flecha), de nucleo basofilo apoyada sobre la membrana basal (flecha negra pequena). PAS 200x.

Leyenda: Figura B. Porcion de lamina dermica primaria (P) de pie equino control. Se observa con mayor aumento la venula, de paredes delgadas, endotelio normal (punta de flecha) y membrana basal conservada (flecha negra). PAS 400x.

Leyenda: Figura C. Corte de union dermo-epidermica de pie equino tratado. Se observa separacion entre laminas dermicas secundarias (S) y laminas epidermicas secundarias (E), con desprendimiento y ruptura de la membrana basal (flecha negra). Notese la disrupcion del tejido colageno en lamina dermica primaria (P) y la presencia de una venula con perdida de la continuidad de la membrana basal (flecha blanca). PAS 400x.

Leyenda: Figura E. Corte longitudinal de un vaso sanguineo de la dermis de pie equino control. Se observan celulas endoteliales de forma y tamano normal (CE). La lamina basal presenta integridad y continuidad (flechas negras). Las uniones intercelulares revelan integridad (flechas blancas). MET 15000x.

Leyenda: Figura F. Corte longitudinal de un vaso sanguineo en equino tratado. Se observan celulas endoteliales aumentadas de tamano (CE), cuyas laminas basales evidencian discontinuidad y sectores con desprendimientos (flecha negra delgada). Los nucleos endoteliales (aumentados) muestran numerosas indentaciones (flecha blanca delgada). Notese la presencia de vesiculas pinociticas (puntas de flechas) y la separacion de las uniones intercelulares (flechas blancas anchas). MET 15000x.
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Author:Teibler, G.P.; Bustillo, S.; Dubiel, C.J.; Bogado, E.F.; Marunak, S.L.
Publication:Revista Veterinaria
Date:Jul 1, 2017
Words:3499
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