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DETERMINACION IN VITRO DE LA ACCION PROBIOTICA DE Lactobacillus plantarum SOBRE Yersinia pseudotuberculosis AISLADA DE Cavia porcellus.

IN VITRO DETERMINATION OF THE PROBIOTIC Lactobacillus plantarum ACTION ON Yersinia pseudotuberculosis ISOLATED FROM Cavia porcellus

INTRODUCCION

Los sistemas de produccion se ven afectados por diversas enfermedades de caracter microbiano que resultan en perdidas significativas para el productor. En los sistemas de produccion del cuy (Cavia porcellus) tipo carne, se observa que las enfermedades bacterianas mas importantes son la yersiniosis (Yersinia pseudotuberculosis), la salmonellosis (S. typhimurium y S. enteriditis) y la colibacilosis (E. coli) (Correa 2000). Dentro de este marco sanitario se encuentran grandes obstaculos que impiden el restablecimiento de la sanidad en el cuy, ya que en la actualidad no se han determinado tratamientos especificos para este tipo de enfermedades; por esta causa se usan medicamentos inadecuados para la especie, con efectos desconocidos y la generacion de efectos residuales (Calpa y Chaspuengal 2013).

Actualmente parte de la investigacion se encuentra encaminada a controlar ciertas bacterias patogenas e infecciones con organismos aislados del huesped. Este tipo de microorganismos vivos tienen un efecto benefico en el tracto intestinal, manteniendo y fortaleciendo los mecanismos de defensa contra patogenos sin alterar las funciones fisiologicas y bioquimicas. Estos microorganismos se denominan probioticos (Guevara 2011). Los principales generos utilizados como probioticos en cultivos puros o mezclas son Aspergillus, Saccharomyces, Bacillus, Bacteroides y Lactobacillus (Sumano y Ocampo 2006).

A menudo Lactobacillus ha sido asociado con varios efectos beneficos en la salud humana y animal (Iniguez et al. 2007). Este tipo de microorganismos son una alternativa al uso de los antibioticos con el fin de equilibrar la microbiota intestinal (Oyetayo y Oyetayo 2005).

MATERIALES Y METODOS

La presente investigacion se realizo en el laboratorio de Microbiologia perteneciente al programa de Zootecnia, Universidad de Narino (Colombia). Se utilizaron cepas comerciales de Lactobacillus plantarum (ATCC 8014[TM][R]) y cepas patogenas de Yersinia pseudotuberculosis aisladas de lesiones de bazo, higado, pulmon, rinon, pancreas y ganglios linfaticos mesentericos, cervicales e inguinales de Cavia porcellus (cuy) del departamento de Narino. La cepa de Yersinia pseudotuberculosis se identifico en forma bioquimica y molecular, la primera mediante kit comercial para enterobacterias no fermentadoras (BBL Cristal[R]) (Jaramillo-Torres et al. 2008) y la segunda por PCR simple realizado en el laboratorio de Biologia Molecular de la Universidad de Narino, mediante los procedimientos indicados por Jaramillo-Torres et al. (2008).

Para mantener activa la cepa de Yersinia, se realizo repique en medios solido y liquido: como medio solido se utilizo agar McConkey y como medio liquido caldo BHI. Estos preservados se incubaron por 24 h a 37[grados]C y se almacenaron a una temperatura de 4[grados]C. En cada repique o siembra se confirmo su pureza mediante tincion de Gram.

La cepa de L. plantarum se reactivo por rehidratacion en caldo MRS y se incubo a 37[grados]C por 24 h de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Despues de la hidratacion se mantuvo en caldo y agar MRS para incubarse a 32[grados]C por 24 h; finalmente fue refrigerada y almacenada a 4[grados]C.

Se inoculo una alicuota de L. plantarum en un Erlenmeyer con 40 ml de caldo MRS esteril comercial que se incubo durante 24 h a 37[grados]C. Luego se realizo un repique de 4 ml y se transfirio a otros 40 ml de caldo MRS para incubar en las condiciones antes mencionadas. Se ajusto el inoculo de acuerdo con Crueger y Crueger (1993). Para ello, se prepararon 90 ml de caldo MRS esteril y se anadieron 10 ml de inoculo probiotico con la aplicacion de la regla. Despues de este tiempo, se estimo el numero de bacterias por ml de caldo MRS, se tomo 1 ml y se realizo lectura directa en el espectrofotometro a 625 nm. Cuando se presento una mayor poblacion de caldo esteril establecida se anadio teniendo en cuenta el calculo matematico de proporcionalidad de acuerdo con Guerrero citado por Montes et al. (2003):

Es el valor de [X.sub.1]:

[expresion matematica irreproducible]

Entonces [V.sub.2] sera:

[V.sub.2] = [V.sub.1] - [X.sub.1]

Finalmente se obtiene el valor de [X.sub.2]:

[expresion matematica irreproducible]

El valor de [X.sub.2] es la cantidad que debe ser anadida a 100 ml para ajustar la poblacion de 1.50 x [10.sup.8] UFC/ml.

[M.sub.1] = Poblacion o densidad de las celulas que se deben ajustar.

[M.sub.2] = 0.125 densidad optica equivalente al estandar de Mac Farland 1.50 x [10.sup.8] UFC/ml. Densidad utilizada para la primera fermentacion.

[V.sub.1] = 1 ml del volumen total de inoculo (10/90).

[X.sub.1] = la cantidad que contiene [M.sub.2].

[V.sub.2] = lo que se anadio a 1 ml para ajustar a 1.50 x [10.sup.8] UFC/ml.

[V.sub.3] = 100 cantidad total ml de inoculo.

[X.sub.2] = cantidad de caldo MRS esteril comercial que se anade a [V.sub.3] para la poblacion con el fin de ajustar el valor de [M.sub.2].

Se estudio la viabilidad de L. plantarum a diferentes niveles de pH (3.25 control, 4.5, 7.6 y 8.2), tres porcentajes de sales biliares bovinas (3, 4 y 5%) y dos concentraciones de bilis bovina Sigma (0.5, 1 y 2%), fue determinada actividad de catalasa y produccion de gas. Se realizo pruebas de crecimiento de la bacteria lactica a diferentes temperaturas (38 y 45[grados]C), sembrada en medio Pro formulado a partir de azucar blanco (10 g/l), leche de soya (15 g/l), leche en polvo (150 g/l) y salvado de trigo (15 g/l) (Jurado-Gamez 2010) por 14:24 h (fase logaritmica). Posteriormente, se efectuaron pruebas de viabilidad en agar MRS por 48 h a 32[grados]C. Fueron seleccionadas las cajas de Petri con viabilidades de 30 y 300 UFC/ml y valores de dilucion iguales o superiores a [10.sup.7] UFC/ml Para las metodologias se utilizaron los procedimientos de Dahl et al. (1989), Cai et al. (1998) y Cai et al. (1999).

La prueba de inhibicion in vitro de Y. pseudotuberculosis se llevo a cabo mediante una adaptacion del metodo de Tagg y McGiven (1971). Los discos se impregnaron con L.plantarum en cantidades de 25, 50 y 100 [micron]l y se colocaron en cajas de Petri con agar Mueller Hinton previamente cultivadas con las bacterias patogenas; se incubaron a 32[grados]C durante 18 h, al cabo de las cuales se realizo la lectura de los halos formados, teniendo en cuenta la distancia desde el borde del disco de agar con la bacteria lactica hasta el final del halo de inhibicion de las bacterias patogenas. El tamano critico de halo para determinar si hay inhibicion se considero igual o superior a 2 mm (Estrada et al. 2005).

Para el ensayo de inhibicion en sobrenadantes, se centrifugo 1.5 ml de muestra de las bacterias lacticas a 4[grados]C a 1000 rpm por 15 min; el sobrenadante se filtro en membrana de 0.20 micras. La actividad bactericida se evaluo mediante dos metodos de difusion modificados: discos y cilindros de plastico, en agar Mueller Hinton inoculado con la cepa patogena. Para el metodo de discos, se anadieron 50, 75 y 100 [micron]l de la bacteriocina en discos de papel de filtro de 8 mm de diametro pre-esterilizado (15 min a 121[grados]C y 15 PSI). Mas tarde se colocaron en la superficie del agar los discos con la bacteriocina, y las placas de Petri se incubaron a 35[grados]C por 18 h. Para el metodo con cilindros se utilizaron puntas de pipetas esteriles cortadas a partir de 8 mm de diametro, colocadas en placas de Petri y en las que se anadieron las diferentes cantidades de sobrenadante. Finalmente se llevaron a tiempo de incubacion en las condiciones anteriormente descritas. La inhibicion se determino por el halo producido alrededor del sensidisco y el cilindro, finalmente se midio la distancia de los discos finales y el borde de halo.

Para determinar la susceptibilidad de Y. pseudotuberculosis y L. plantarum a los antibioticos se uso el metodo de Kirby Bauer (Bauer et al. 1966); se compararon ocho antibioticos comerciales (Cefalotina Kf 30 [micron]g, Cefepima Fep 30 [micron]g, Ciprofloxacina Cip 5 [micron]g, Dicloxacilina Dcx 1 [micron]g, Enrofloxacina Enr 5 [micron]g, Gentamicina Cn 10 [micron]g, Penicilina GP 10 IU y Trimetoprim-sulfametoxasol COT 25 [micron]g). El efecto del antibiotico fue determinado por el diametro del halo que se produjo alrededor de los sensidiscos, despues de 18 h de crecimiento en el medio, donde crecian las bacterias patogenas (Tagg y Mcgiven 1971).

Se midio el contenido de peptidos del sobrenadante de L. plantarum a traves del metodo HPLC-DAD (Cromatografo liquido HPLC Waters con bomba binaria 1525; columna C18 300a). Para ello la cepa se cultivo en caldo MRS durante 24 h a 32[grados]C, se ajusto posteriormente mediante espectrofotometria a una densidad optica de 0.125 en escala equivalente 0.5 estandar de McFarland a una concentracion de 1.5 x [10.sup.8] UFC/ml. Las muestras se transfirieron a tubos Eppendorf y se centrifugaron a 18000 rpm durante 30 min a 4[grados]C. El sobrenadante se filtro utilizando membranas de PVDF de 0.20 micrometros y se obtuvo la lectura (Higuera, 2000). Se uso un cromatografo liquido HPLX aguas con bomba binaria 1525, con columna C18 300A (Jupiter, Phenomeme x 150 mm x 4.6 mm), detector PDA 2998-214 y 280 nm Scan e inyector Rheodyne Loop 20 [micron]l.

La cinetica de la fermentacion se llevo a cabo en dos sustratos diferentes, el medio comercial MRS y el medio Pro. La cinetica se realizo en un Erlenmeyer con 600 ml del medio y las bacterias probioticas fueron fijadas a una concentracion inicial de 1.50 x [10.sup.8] UFC/ml (540 ml del medio y 60 ml de inoculo), se continuo en agitador a 100 rpm y se incubo a 32[grados]C. Las variables evaluadas durante la cinetica fueron: produccion de biomasa por recuento de microorganismos viables en placa (UFC/ml), consumo total de azucar por el metodo de antrona (Dubois et al. 1956) a 625 nm, determinacion de pH medido con pHmetro digital (pH Jenco[R] Vision Plus) y la produccion de acido lactico mediante titulacion con 0.1 N de hidroxido de sodio. El muestreo se llevo a cabo por duplicado desde el tiempo cero y posteriormente cada 02:24 h durante 24 h para un total de 11 periodos con el fin de determinar los parametros de fermentacion.

La tecnica de recuento en placa proporciona informacion sobre el numero de celulas viables durante el proceso en terminos de UFC/ml; de este modo se determino la evolucion que presenta la produccion de biomasa. Dado que la cantidad de solidos en suspension fue alta, no se hizo medicion en peso seco ni turbidimetricamente. Para los recuentos se diluyo 1 ml de muestra en 9 ml de agua peptonada 0.1% y se hicieron diluciones decimales; cada dilucion de 100 [micron]l se sembro en placas de Petri con MRS mas azul de anilina. Las cajas se incubaron a 32[grados]C y se observaron entre 24 y 48 h. Se consideraron las placas de Petri con un recuento de UFC/ml entre 30 y 300 colonias. El numero de colonias se multiplica por el inverso de la dilucion y por 10 para la UFC/ml formada (LANARA 1981) y estadisticamente se trabajo bajo transformacion logaritmica natural.

Para determinar los azucares con el metodo de Antrona (Dubois et al. 1956), se preparo previamente una curva estandar con diversas concentraciones de solucion patron de glucosa (Figura 1), los valores obtenidos mediante la lectura de densidad optica (DO) a 625 nm, se presentan frente a la concentracion en mg/l y se obtuvo los valores de la ecuacion de la linea. Para las muestras obtenidas a partir de diferentes cineticas de tiempo se realizaron lecturas de absorbancia en espectrofotometro a 625 nm, y se procedio a aplicar la formula para valores de X para cada tiempo, teniendo en cuenta que se ha trabajado en la base de una dilucion de 1/100 y 1/1000 para MRS y Pro, respectivamente.

Los resultados indicaran si la cepa parece ser la mas adecuada en terminos de tiempo y la tasa de crecimiento durante el proceso de fermentacion para establecer el tiempo de duracion en la produccion de biomasa. Los calculos de la cinetica de fermentacion fueron los definidos por Crueger y Crueger (1993) y Rodriguez-Leon et al. (2003).

Dado que la tasa de crecimiento especifico fue definida por la ecuacion:

v max = dLnX/dt

Para el tiempo de duplicacion celular se tiene:

td = Ln2/v max

El conteo de microorganismos viables en placa UFC/ml obtenida durante la cinetica de fermentacion, adopto un diseno de bloques al azar (DBA), los medios fueron considerados como los tratamientos y las horas de evaluacion correspondio a los bloques (11 h), el comportamiento fue evaluado desde el tiempo 0 (cero h), hasta el tiempo 11 (24 h), se analizaron dos replicas para cada medio y tiempo. El modelo matematico fue el siguiente:

[Y.sub.ij] = [my] + [[alfa].sub.j] + [[beta].sub.j] + [[epsilon].sub.ij]

Donde,

[Y.sub.ij] = Observacion de la i-esima unidad en el j-esimo bloque.

[my] = Media general del experimento.

[[alfa].sub.j] = efecto del tratamiento en el j-esimo nivel.

[[beta].sub.j] = Efecto del bloque.

[[epsilon].sub.ij] = Error asociado a la i-esima unidad y el j-esimo bloque.

Los datos se analizaron mediante el procedimiento PROC GLM del paquete estadistico S.A.S. Version 9.1 (SAS Institute 2004).

RESULTADOS

Los resultados de identificacion de Y. pseudotuberculosis, mediante el kit comercial para enterobacterias no fermentadoras, indico la presencia del microorganismo. Igualmente, la prueba molecular por PCR, confirmo que la cepa aislada correspondia a Y. pseudoturberculosis.

El crecimiento microbiano (UFC/ml) para la cepa probiotica, evaluada bajo diferentes concentraciones de pH, demostro valores satisfactorios con indices altos de 2.9 x [10.sup.12], 3.2 x [10.sup.11] y 3.3 x [10.sup.12] UFC/ml, para los tiempos 0, 1 y 2 respectivamente (Tabla 1); incluso el pH mas bajo (3.25), tomado como punto control, reflejo valores entre 2.7 x [10.sup.8] y 3.1 x [10.sup.12] UFC/ml, senalando valores de viabilidad altos.

Los resultados de la prueba de viabilidad a concentraciones de 3, 4 y 5% de sales biliares muestran un buen promedio de crecimiento de L. plantarum, con valores de 4.5 x [10.sup.11], 9.6 x [10.sup.11] y 2.2 x [10.sup.12] UFC/ml respectivamente. Igual comportamiento se observa con bilis bovina (Sigma[R]) 0.5, 1 y 2% con valores de 5.6 x [10.sup.11], 3.8 x [10.sup.11] y 8.4 x [10.sup.11] UFC/ml, respectivamente (Tabla 2).

Las pruebas de produccion de gas y catalasa para L. plantarum fueron negativas. Por otra parte, los resultados obtenidos en la Tabla 3 muestran termotolerancia de la cepa a temperaturas de 38 y 45[grados]C, sin afectar su crecimiento. Por su parte, los resultados de la accion inhibitoria de L. plantarum sobre Y. pseudotuberculosis, se presentan en la Tabla 4 y la Figura 2.

La prueba del sobrenadante de L. plantarum llevado a los 80[grados]C sobre Y. pseudotuberculosis mostro resistencia de la bacteria patogena con valores entre 0 y 2 mm; sin embargo, se encontro mayor variabilidad en los resultados con halos de inhibicion a pH 6 con valores entre 0 y 8 mm (Tabla 5 y Figura 3).

En la Tabla 6 se muestran los datos obtenidos de la prueba de susceptibilidad antimicrobiana de los antibioticos contra L. plantarum y Y. pseudotuberculosis. Por su parte, la Figura 4 muestra los halos de inhibicion formados por los antibioticos.

El sobrenadante analizado por HPLC encontro dos peptidos. En el pico No.9 (tr = 12.1 min), presento un tiempo de retencion similar al del pico No. 2 del estandar de calibracion (Figura 6 y Tabla 7), por lo que, el peptido de esta muestra presente una cadena de aminoacidos compuesta por VAL-TIR-VAL (PM = 379.5). Los espectros UV presentan longitudes de maxima absorcion similares (Tabla 8 y Figura 5).

El pico No.3 del estandar, que corresponde al peptido metionina enkefalina acetato, de composicion (TIR-GLI-GLI-FA-MET) M6638 (PM = 573.7 para la base libre), presenta un tiempo de retencion similar al del pico No.12 de la muestra. Los maximos de absorbancia de los espectros presentaron longitudes de maxima absorcion muy cercanas.

En la Figura 7 se muestra el comportamiento de L. plantarum en los medios MRS y Pro durante las 24 horas de la cinetica; las cepas tuvieron un comportamiento similar durante las primeras 09:36 h, pero el crecimiento maximo (fase exponencial) se presento primero en el medio MRS a 12 h (tiempo 5) con un valor de 6.75 x [10.sup.12] UFC/ml; por otro lado, en el medio Pro el crecimiento maximo se logro 2:24 horas mas tarde (tiempo 6) con un valor de 1.20 x [10.sup.12] UFC/ml, respectivamente, de esta manera se demostro una pequena ventaja para el medio MRS.

En la Figura 8 los valores del azucar total en los medios MRS y Pro fueron de 10,64 mg/l y 27,83 mg/l respectivamente, a las 12:00 y 14:24 h de efectuada la cinetica. Por tanto, como lo demuestra L. Plantarum esta vez usara mas eficientemente este sustrato para el crecimiento en el medio Pro y MRS (30 y 27 Ln UFC/ml, respectivamente).

En la Figura 9 se presenta el pH reportado durante las 24 horas del proceso de fermentacion, se observa que en la fase logaritmica (21,51 ln UFC/ml, tiempo 5) para el medio MRS el pH fue de 6,96, mientras que para el medio Pro en la misma fase (27,42 ln UFC/ml, tiempo 6), el pH fue de 5,49, despues de estas horas sigue la disminucion del pH con una acidez mas alta como respuesta a la produccion de acido lactico por las bacterias lacticas.

En la Figura 10 se observa la produccion de acido lactico en los medios MRS y Pro para L. plantarum que presenta porcentajes de 0.63 y 0.76%, respectivamente, para llegar a la fase logaritmica, los datos correspondientes para el tiempo 5 y 6, que muestra una mayor produccion de acido a favor del medio Pro.

Los resultados de la produccion de biomasa, en relacion con la tasa de crecimiento especifico ([micron][h.sup.-1]), fase de latencia (fase de retardo), la fase logaritmica tardia, tiempo de duplicacion celular (minutos), crecimiento celular total y la fase de consumo total de azucar logaritmica y la fase logaritmica, y el coeficiente de determinacion ([R.sup.2]) se muestran en la Tabla 9.

La estadistica mostro que los tiempos de evaluacion presentaron diferencias estadisticas entre las horas de evaluacion (P< 0.05). Se encontro un [R.sup.2] alto (90%) por lo cual no se considero el error estandar. El analisis de ANOVA indico que los dos tipos de medios no muestran diferencias estadisticas significativas, por tanto, ambos pueden ser utilizados como medio de cultivo en el laboratorio.

DISCUSION

El crecimiento bacteriano no se vio afectado por los niveles de pH, dado que las bacterias acido lacticas (BAL) del genero Lactobacillus siguen desarrollandose a pH relativamente bajo; esto favorece el proceso de fermentacion debido a su capacidad de resistir la acidez que se produce en el estomago, que es uno de los principales obstaculos para el paso del probiotico a traves del tracto gastrointestinal.

Los resultados obtenidos para sales biliares y bilis bovina, indican una caracteristica importante de L. plantarum, por cuanto presenta altos recuentos bacterianos incluso en diluciones de [10.sup.-10]. Las cepas destinadas a servir como probioticas deben ser capaces de pasar a traves del tracto gastrointestinal sin sufrir alteraciones en su comportamiento fisiologico. Asi, una cepa no solo debe sobrevivir a las condiciones acidas del estomago sino ademas, a sales biliares, con el fin de ejercer efectos beneficos en el intestino; por lo tanto, la tolerancia a la bilis se considera como una de las propiedades mas importantes de los microorganismos (Iniguez et al. 2007).

Jay 1982 citado por Mora y Garcia (2007), menciona que los lactobacilos pueden desarrollarse con limites de temperatura que oscilan entre 2 y 52[grados]C, siendo su rango optimo de crecimiento entre 30 a 40[grados]C. Por tanto, esta es una caracteristica importante de la bacteria puesto que le permite crecer en diferentes temperaturas, observandose en este caso que a una temperatura de 45[grados]C en algunas diluciones presenta un mayor numero de UFC (3.0 x [10.sup.12] UFC/ml) y no afecta su crecimiento. A un rango de temperatura de 38[grados]C, la cepa probiotica se podria usar para otras aplicaciones como incorporar esta bacteria a concentrados para la alimentacion animal mediante metodos de secado. Ademas, con el uso de esta bacteria como probiotico en animales, como por ejemplo el cuy, debe resistir su temperatura corporal (38[grados]C), lo que permitiria colonizar el tracto gastrointestinal del animal.

Al respecto de la importancia de la temperatura en el crecimiento y produccion de sustancias antimicrobianas, Dalie et al. (2010) mencionan que la temperatura y el periodo de incubacion, son factores esenciales que modulan el crecimiento de las BAL y pueden llegar a afectar considerablemente las cantidades producidas de metabolitos antimicrobianos.

El ensayo de inhibicion in vitro mostro que L. plantarum es capaz de ejercer un efecto inhibidor contra Y. pseudotuberculosis con halos entre 2 y 3 mm de distancia, que son independientes de la cantidad de discos manejados en agar. Este proceso probablemente se deba a la produccion de sustancias como resultado de la fermentacion, principalmente la generacion de compuestos antimicrobianos, tales como los acidos lactico, acetico y propionico, el peroxido de hidrogeno ([H.sub.2][O.sub.2]), la reuterina, el dioxido de carbono (C[O.sub.2]), el diacetilo (2,3-butanodiona), el acetaldehido y compuestos de alto peso molecular como las bacteriocinas (Ramirez 2005).

El sobrenadante llevado a altas temperaturas (80[grados]C) no presenta inhibicion de la bacteria patogena, por lo cual se observa efecto adverso de esta sobre la capacidad inhibitoria del sobrenadante. Al respecto, Zapata et al. (2009) indican que la estabilidad termica de las bacteriocinas derivadas de bacterias lacticas de bajo peso molecular es muy importante por cuanto estos compuestos son utilizados en muchos procesos de las industrias alimentarias en donde tienen que pasar por diferentes procesos con altas y bajas temperaturas. Los metodos empleados (disco, cilindros y pozos), no presentaron una variacion notable, por lo que se consideran adecuados para la evaluacion de la inhibicion de las bacterias patogenas.

La prueba antimicrobiana sobre Y. pseudotuberculosis indico resistencia a la dicloxacilina, siendo sensible a los demas antibioticos. La sensibilidad presentada en este estudio es de gran importancia, ya que el mecanismo de accion de los antibioticos sobre las bacterias patogenas utilizadas se confirma, ya que varias especies de la familia Enterobacteriaceae tienen patrones de resistencia para ciertos aminoglucosidos, fluoroquinolonas y cephalosporina (Navarro et al. 2010). Por su parte, L. plantarum mostro resistencia a la penicilina y sensibilidad a los otros antibioticos, lo que sugiere que las bacterias acido lacticas no pueden administrarse en dietas o alimentos que contengan antibioticos a los que son sensibles, dado que inhiben su efecto.

Los espectros UV de peptidos estandar mostraron gran similitud para preparados en longitudes de absorcion maxima de la muestra, con lo que se establecio la presencia de los dos peptidos. Por lo tanto, la presencia de estas sustancias, sugiere que la concentracion y la diversidad de peptidos depende del microorganismo que fermenta el sustrato donde se desarrollo (Gonzales-Olivares et al. 2010).

De acuerdo con los resultados de la cinetica, el medio MRS seria el medio mas adecuado para la preparacion de los inoculos debido a que presenta el mayor aumento de celulas en la fase final (en terminos de UFC/ml) con mejores resultados que el medio Pro; sin embargo, debe tenerse en cuenta la tasa de crecimiento especifico ([micron][h.sup.-1]), ya que se observan diferencias, con la obtencion de valores de 2.971 a 2.597 para los medios Pro y MRS, respectivamente, y tiempos de 14 y 16 min.

Los valores de biomasa (UFC/ml) durante la cinetica del proceso indican ser los adecuados para su uso en la preparacion de inoculos probioticos, puesto que--incluso en el caso de productos alimenticios--el nivel de bacterias viables es generalmente insignificante en productos de suplementos dieteticos, donde se requieren niveles de 0.1-10000000000, y en productos lacteos que requieren entre 200 y 300 millones por taza (California Dairy Research Foundation 2011).

Los valores del consumo total de azucar (33.04 y 51.06% para los medios MRS y Pro, respectivamente), indican que ambos presentan velocidades especificas de crecimiento bastante similares (2.971 y 2.597 [micron][h.sup.-1]), que permiten lograr incrementos celulares al final de la fase logaritmica de 6.75 x [10.sup.12] y 1.20 x [10.sup.12] UFC/ml para MRS y Pro, respectivamente. Por consiguiente estos medios son optimos para su uso en la preparacion de inoculos, principalmente el medio Pro, en comparacion con el medio MRS. Para mantener la fase logaritmica durante la cinetica se debe garantizar una cierta cantidad de nutrientes, incluyendo azucar, con el fin de promover el crecimiento y una cantidad dada de biomasa.

El acido lactico producido por L. plantarum refleja su pertenencia al grupo de bacterias acido lacticas (BAL); para el caso, se ha clasificado en el grupo de los microorganismos hetero fermentativos dado que solo puede producir acido lactico al 50%, la otra mitad corresponden a cantidades considerables de etanol, acido acetico y dioxido de carbono (Ramirez 2005). De acuerdo con Samaniego y Sosa (2012), la produccion de acido lactico se produce a partir de la fermentacion de hexosas a acido lactico por la via Embden-Meyerhoff.

Aunque los calculos estadisticos no muestran ventajas para el medio de cultivo Pro, si se tiene en cuenta el punto de vista economico, su importancia destacaria como medio de cultivo para la produccion de UFC/ml, dado que resulta mas barato; ademas, proporciona los nutrientes necesarios para el crecimiento de bacterias lacticas y permite la produccion de inoculo probiotico para futuros estudios en animales in vivo.

CONCLUSIONES

Se concluye que el probiotico L. plantarum demostro su potencial para actuar en contra de Y. pseudotuberculosis en condiciones in vitro, con una adecuada formacion de biomasa para la produccion de inoculo. Se debe investigar su utilizacion in vivo, mediante la administracion a cuyes en diferentes etapas de produccion.

HTTP://DX.DOI.ORG/10.15446/RFMVZ.V61N3.46872

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H. Jurado-Gamez (1,2) *, F. Calpa-Yama (2), A. Chaspuengal-Tulcan (2)

Articulo recibido: 10 de julio de 2014 * Aprobado: 15 de septiembre de 2014

(1) Programa de Zootecnia, Departamento de Produccion y Procesamiento Animal, Facultad de Ciencias Pecuarias, Universidad de Narino. Ciudad Universitaria Torobajo, Cll. 18 Cr. 50, Pasto (Colombia).

(2) Grupo de Investigacion en Procesos Biotecnologicos Aplicados a la Produccion Animal--Fisiologia y Etologia Animal (FISE-PROBIOTEC), Universidad de Narino. Ciudad Universitaria Torobajo, Cll. 18 Cr. 50, Pasto (Colombia).

* Autor para correspondencia: henryjugam@gmail.com

Leyenda: FIGURA 1. Curva de la calibracion para la determinacion de azucares totales (metodo de Antrona).

Leyenda: Figura 2. Accion inhibitoria cualitativa de L. plantarum sobre Y. pseudotuberculosis.

Leyenda: FIGURA 3. Halo de inhibicion producido por el sobrenadante usando los metodos de disco (a) y cilindro (b).

Leyenda: FIGURA 4. Inhibicion formada por los discos de antibiotico especifico contra Yersinia pseudotuberculosis.

Leyenda: FIGURA 5. Cromatografia de la muestra a 214 nm (azul) y de calibracion estandar de peptidos (negro).

Leyenda: FIGURA 6. Cromatograma mezcla de peptidos estandar de referencia.

Leyenda: FIGURA 7. Crecimiento de la cepa probiotica (en UFC/ml) en los medios MRS y Pro durante 24 horas.

Leyenda: FIGURA 8. Consumo de azucar total (mg/l) y crecimiento (Ln UFC/ml) en los medios MRS y Pro.

Leyenda: FIGURA 9. pH de los medios MRS y Pro en UFC/ml de la cepa probiotica cultivada durante 24 horas.

Leyenda: FIGURA 10. Acidificacion (%) de los medios MRS y Pro en UFC/ml de la cepa probiotica durante 24 horas.
TABLA 1. Prueba de viabilidad (UFC/ml) en diferentes tiempos y pH en
el medio Pro.

Tiempo                              pH

                        3.25                   4.5

Tiempo 0 (H1)   1--1.7 x [10.sup.7]    1--3.2 x [10.sup.6]
                2--2.7 x [10.sup.8]    2--8.2 x [10.sup.7]
                3--3.1 x [10.sup.10]   3--1.6 x [10.sup.9]
                4--3.3 x [10.sup.11]   4--1.6 x [10.sup.10]
                5--2.9 x [10.sup.12]   5--1.2 x [10.sup.11]

Tiempo 1 (H2)   1--1.2 x [10.sup.7]    1--3.1 x [10.sup.8]
                2--3.5 x [10.sup.7]    2--3.3 x [10.sup.9]
                3--3.6 x [10.sup.9]    3--3.1 x [10.sup.10]
                4--2.3 x [10.sup.9]    4-- 2.3 x [10.sup.9]
                5--6.0 x [10.sup.10]           5--0

Tiempo 2 (H3)   1--3.4 x [10.sup.8]    1--2.1 x [10.sup.6]
                2--3.4 x [10.sup.9]    2--2.3 x [10.sup.7]
                3--3.2 x [10.sup.10]    3--1.5 x [10.sup.8]
                4--3.2 x [10.sup.11]   4--1.2 x [10.sup.9]
                5--3.1 x [10.sup.12]   5--3.4 x [10.sup.10]

Tiempo                              pH

                        7.6                    8.2

Tiempo 0 (H1)   1--1.6 x [10.sup.7]    1--3.3 x [10.sup.8]
                2--1.7 x [10.sup.8]    2--3.2 x [10.sup.9]
                3--3.2 x [10.sup.10]   3--3.1 x [10.sup.10]
                4--3.1 x [10.sup.11]   4--7.5 x [10.sup.10]
                5--3.5 x [10.sup.12]   5--3.2 x [10.sup.10]

Tiempo 1 (H2)   1--1.6v [10.sup.7]    1--3.4 x [10.sup.8]
                2--4.1 x [10.sup.7]    2--3.5 x [10.sup.9]
                3--3.2 x [10.sup.8]    3--3.2 x [10.sup.10]
                4--2.4 x [10.sup.9]    4--1.6 x [10.sup.10]
                5--3.2 x [10.sup.11]   5--5.2 x [10.sup.10]

Tiempo 2 (H3)   1--8.1 v [10.sup.6]    1--1.4 x [10.sup.7]
                2--3.5 x [10.sup.8]    2--2.6 x [10.sup.7]
                3--7.3 x [10.sup.8]    3--2.7 x [10.sup.10]
                4--6.4 x [10.sup.9]    4--3.3 x [10.sup.11]
                5--6.2 x [10.sup.10]   5--3.3 x [10.sup.12]

H1 = Inicio de la prueba en la primera hora; H2 = la segunda hora-; H3
= la tercera hora.

1--= Prueba a los cero (0) minutos; 2--= a los 15 minutos; 3--= a los
30 minutos; 4--= a los 45 minutos; 5--= a los 60 minutos.

TABLA 2. Viabilidad del medio Pro a diferentes concentraciones de
sales biliares y bilis bovina.

Concentracion   No. de colonias por dilucion (UFC/ml)

                   [10.sup.-6]         [10.sup.-7]

Sales biliares

3%              5.3 x [10.sup.7]    7.5 x [10.sup.8]
4%              9.3 x [10.sup.7]    6.2 x [10.sup.8]
5%              2.9 x [10.sup.8]    1.8 x [10.sup.9]

Bilis bovina

0.50%           7.2 x [10.sup.7]    5.3 x [10.sup.8]
1%              4.5 x [10.sup.7]    1.5 x [10.sup.9]
2%              1.6 x [10.sup.8]    1.6 x [10.sup.9]

Concentracion   No. de colonias por dilucion (UFC/ml)

                   [10.sup.-8]         [10.sup.-9]

Sales biliares

3%              4.2 x [10.sup.9]    7.3 x [10.sup.10]
4%              9.6 x [10.sup.9]    1.5 x [10.sup.11]
5%              2.6 x [10.sup.10]   6.7 x [10.sup.10]

Bilis bovina

0.50%           4.7 x [10.sup.9]    7.5 x [10.sup.10]
1%              3.8 x [10.sup.9]    6.6 x [10.sup.10]
2%              4.6 x [10.sup.9]    8.4 x [10.sup.10]

Concentracion    No. de colonias
                  por dilucion
                    (UFC/ml)

                  [10.sup.-10]

Sales biliares

3%              4.5 x [10.sup.11]
4%              9.6 x [10.sup.11]
5%              2.2 x [10.sup.12]

Bilis bovina

0.50%           5.6 x [10.sup.11]
1%              3.8 x [10.sup.11]
2%              8.4 x [10.sup.11]

TABLA 3. Viabilidad de L. plantarum en el medio Pro a diferentes
temperaturas.

Temperatura             No- de colonias po+r dilucion (UFC/ml)

                [10.sup.-6]        [10.sup.-7]         [10.sup.-8]

38[grados]C   2.6 x [10.sup.8]   8.6 x [10.sup.8]   2.2 x [10.sup.10]
45[grados]C   3.6 x [10.sup.8]   2.3 x [10.sup.9]   2.2 x [10.sup.10]

Temperatura   No- de colonias po+r dilucion (UFC/ml)

                 [10.sup.-9]        [10.sup.-10]

38[grados]C   1.6 x [10.sup.11]   2.8 x [10.sup.12]
45[grados]C   1.7 x [10.sup.11]   3.0 x [10.sup.12]

TABLA 4. Accion inhibitoria cuantitativa de L. plantarum sobre Y.
pseudotuberculosis.

Halo de inhibicion (mm)

Medios                             Cantidades

                 25 [micron]l   50 [micron]l   100 [micron]l

TSA                   2              2               2
Mueller Hinton        3              2               3

TSA: Triptona Soya Agar.

TABLA 5. Halos de inhibicion (mm) producidos por el sobrenadante
(bacteriocinas).

Metodo                         Condicion              Halo (mm)

                                            50 [micron]l   75 [micron]l

Difusion en agar con discos   80[grados]C        0              1
metodo modificado                pH 6            1              4

Difusion en agar con          80[grados]C        1              1
cilindro plastico                pH 6            2              3

Difusion en agar en pozos     80[grados]C        0              --
con doble capa modificado        pH 6            7              --

Metodo                         Condicion      Halo (mm)

                                            100 [micron]l

Difusion en agar con discos   80[grados]C         2
metodo modificado                pH 6             6

Difusion en agar con          80[grados]C         1
cilindro plastico                pH 6             2

Difusion en agar en pozos     80[grados]C         0
con doble capa modificado        pH 6             8

TABLA 6. Prueba de susceptibilidad a los antibioticos de Y.
pseudotuberculosis y L. plantarum.

                      Diametro de la zona de
                          inhibicion (mm)

Antibioticos       YP    NS     LP    NS

Kf 30 [micron]g    28    +a     49    + a
Fep 30 [micron]g   40   +a.b    33    + a
Cip 5 [micron]g    33   + a.b   31   + a.b
Dcx 1 [micron]g    10    -a     27    - a
Enr 5 [micron]g    33    + a    34    + a
Cn 10 [micron]g    22   + a.b   29   + a.b
Gp 10 IU           27    + a    22    - a
Cot 25 [micron]g   26   + a.b   31   + a.b

YP: Yersinia pseudotuberculosis; LP: Lactobacillus plantarum ATCC
8014; NS: nivel de sensibilidad (+: sensible; -: resistente); a:
Clinical and Laboratory Standars Institute (2012); b: European
Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (2012). Kf:
Cefalotina; Fep: Cefepima; Cip: Ciprofloxacina; Dcx: Dicloxacilina;
Enr: Enrofloxacina; Cn: Gentamicina; Gp: Penicilina; y Cot:
Trimetoprim-Sulfametoxasol.

TABLA 7. Composicion estandar de peptidos.

No. pico             Nombre              Tiempo de retencion

1                    GLY-TYR                    8.160
2                  VAL-TYR-VAL                 11.954
3          Metionine Enkefalin Acetate         14.933
4               Leucine Enkefalin              16.328
5            Angiotensin II Acetate            16.525

No. pico     Area     Peso relativo (%)

1          13536607         17.32
2          15409159         19.71
3          16289583         20.84
4          15163721         19.40
5          17776696         22.74

TABLA 8. Resultados del analisis de los peptidos de la muestra
(HPLC-PDA a 214 nm).

No. pico   Tiempo de retencion   Cantidad relativa promedio (%)

1                 2.511                       9.52
2                 2.695                       5.30
3                 2.984                       2.63
4                 3.145                       9.50
5                 3.506                       2.57
6                 7.403                       0.67
7                 7.572                       13.66
8                 9.595                       16.99
9                12.100                       27.91
10               13.856                       0.59
11               14.618                       0.81
12               14.932                       1.83

TABLA 9. Datos cineticos del crecimiento bacteriano de L. plantarum en
dos medios de cultivo.

Lactobacillus plantarum                      Medio MRS     Medio Pro

Fase lat (h)                                     0             0
Velocidad especifica de crecimiento            2.971         2.597
([micron][h.sup.-1])
Fin fase log (h)                               12:00         14:24
Tiempo de duplicacion (min)                     14            16
Incremento cel. Total (UFC/ml)              1.35 x 1011   5.74 x 107
Incremento cel. Fin fase log (UFC/ml)       6.75 x 1012   1.20 x 1012
% azucares consumidos totales (mg/l)           33.04         51.06
% azucares consumidos fin fase log (mg/l)      24.65         38.74
[R.sup.2]                                      0.914         0.963
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Title Annotation:INVESTIGACION
Author:Jurado-Gamez, H.; Calpa-Yama, F.; Chaspuengal-Tulcan, A.
Publication:Revista Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia
Date:Sep 1, 2014
Words:7808
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