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DETECCION DEL GENOMA DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E (VHE) EN MUESTRAS DE HECES DE CERDOS EN PLANTAS DE BENEFICIO DE ANTIOQUIA, COLOMBIA.

DETECTION OF HEPATITIS E VIRUS (HEV) GENOME FROM PIGS FECES SAMPLES IN SLAUGHTERHOUSES IN ANTIOQUIA, COLOMBIA

INTRODUCCION

Las caracteristicas clinicas y epidemiologicas del virus, tanto en zonas endemicas como no endemicas, y el creciente rango de hospederos donde se ha podido demostrar la presencia de diferentes variantes del VHE (Sato et al. 2011, Johne et al. 2014), han mostrado la importancia que este virus tiene para la salud publica mundial (Mirazo et al. 2014). Particularmente en America Latina, se ha reportado la circulacion del virus en diferentes paises; por ejemplo, en Argentina se ha detectado el genoma del virus en cerdos de diferentes provincias, con un alto grado de homologia de secuencia de nucleotidos a las cepas de VHE de humanos de ese pais (Munne et al. 2006). Por otra parte, en una comunidad rural boliviana se detecto la presencia del genotipo 3 de VHE en cerdos y en humanos con una homologia del 76% en nucleotidos y del 92% en aminoacidos (Dell'Amico et al. 2011). Asi mismo, en Brasil (dos Santos et al. 2009), Venezuela (Garcia CG et al. 2012), Uruguay (Cruells MR et al. 1997; Mirazo et al. 2013), Chile (Ibarra et al. 2007) y Peru (Vildosola et al. 2000) se ha reportado la presencia del virus en diferentes tipos de poblaciones humanas y animales (Echevarria et al. 2013).

La elevada presencia de VHE en cerdos en diferentes paises (Baechlein et al. 2010; Clayson et al. 1995; de Deus et al. 2008), las altas tasas de propagacion del virus entre los cerdos (Bouwknegt et al. 2008), la trasmision del virus hacia los humanos (Tei et al. 2003) y la alta homologia entre genotipos que infectan humanos y cerdos (Lu et al. 2006; Tei et al. 2003) demuestran que los cerdos son uno de los reservorios mas importantes del VHE para la infeccion de los humanos.

A pesar de que hay estudios en Colombia que muestran que existe evidencia serologica de la infeccion en humanos (Betancurt et al. 2013; Pelaez et al. 2014) y en cerdos (Ospina 2014), y que ademas el genoma viral se puede detectar en higados de esta especie en plantas de beneficio y expendios de carne (Gutierrez et al. 2014), se desconoce si los cerdos que llegan a beneficio estan en capacidad de excretar virus al ambiente, poniendo en riesgo a la carne para consumo humano, a los trabajadores de la cadena porcicola y a la poblacion general de esta zona del pais. Por tanto, el objetivo de este trabajo fue detectar el genoma viral en heces de cerdos al momento del beneficio en el departamento de Antioquia, el principal productor de carne de cerdo del pais.

MATERIALES Y METODOS

Toma de muestras

Las muestras de materia fecal de 152 cerdos (8% de error, 95% de confianza y una prevalencia estimada del 50%), aparentemente sanos y con edad aproximada de 22 semanas, fueron tomadas al azar en cinco plantas de faenado porcino de Antioquia (nombradas de la A a la E a fin de preservar la confidencialidad), durante el periodo comprendido entre septiembre de 2011 y mayo de 2012, teniendo en cuenta el volumen de sacrificio diario de cada planta y proporcionalmente al lugar de procedencia de los animales. Estas muestras se colectaron directamente del esfinter anal de cada animal, se rotularon debidamente y se almacenaron a -80[grados]C hasta su utilizacion.

Extraccion de ARN y preparacion de cADN

Las muestras se resuspendieron en un tampon de sales de fosfato (PBS) esteril tratado con dietilpirocarbonato (DEPC) a una concentracion de 10% p/v, la cual se centrifugo por 10 minutos a 3000 rpm; un volumen de 140 [micron]l del sobrenadante se sometio a extraccion de ARN mediante el estuche comercial QIAamp Viral RNA MiniKit[R] (Qiagen, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN obtenido fue guardado en -80[grados]C hasta su utilizacion. El cADN (ADN complementario) fue preparado a partir de 5 [micron]l ARN utilizando el estuche comercial RevertAid Enzyme Mix[R] (Fermentas-ThermoScientific, EUA) siguiendo las indicaciones del fabricante y usando hexanucleotidos al azar Random Hexamer Primer[R] (Fermentas-ThermoScientific, EUA) como iniciadores de la retrotranscripcion. La retrotrascripcion se incubo por 10 min a 25[grados]C, luego 60 min a 43.5[grados]C y un periodo final de incubacion de 5 minutos a 72[grados]C.

PCR anidada del ORF1 del VHE

Un fragmento de 170 pares de bases del ORF 1 (marco abierto de lectura 1, del ingles Open Reading Frame) se amplifico mediante una PCR anidada segun lo descrito por otros investigadores (Fogeda et al. 2009) con ligeras modificaciones. Brevemente, 3 [micron]l de cADN se sometieron a una primera ronda de amplificacion usando una mezcla maestra que contenia: 2.5 [micron]l de Buffer (10X), 2 [micron]l de Mg[Cl.sub.2] (50 mM), 1 [micron]l de dNTPs a (20 [micron]M de cada dNTP), 2 [micron]l (10 [micron]M) de cada uno de los cebadores (ORF-1F 5' CCAYCAGTTYATHAAGGCTCC'3; ORF-1R 5'TACCAVCGCTGRACRTC 3'), 0.2 [micron]l de Taq DNA polimerasa (Bioline 5 U/[micron]l), para un volumen final de 25 [micron]l. El perfil de amplificacion se desnaturalizo inicialmente a 94[grados]C por 4 min y luego se amplifico por 39 ciclos a 94[grados]C por 38 seg, 51[grados]C por 45 seg y 72[grados]C por 60 seg; se realizo una extension final a 72[grados]C por 4 min. Para la segunda ronda se utilizaron 3 [micron]l del producto de amplificacion de la primera ronda, con una solucion y volumen final identico pero variando los cebadores por ORF-1 FN 5' CTCCTGGCRTYACWACTGC 3' y ORF-1RN GGRTGRTTCCAIARVACYTC. El perfil de temperaturas de la PCR fue: desnaturalizacion inicial a 95[grados]C por 3 minutos con 35 ciclos a 94[grados]C por 35 segundos, 48[grados]C por 30 seg y 60 seg a 72[grados]C, con una extension final a 72[grados]C por 3 min. Los fragmentos amplificados fueron verificados en gel de agarosa al 2.5% usando EZ-Vision[R] (Amresco, EUA) como agente intercalante. Se uso como control positivo un cDNA obtenido de una muestra de heces positiva, gentilmente donado por la doctora Munne del Laboratorio Nacional de Referencia Hepatitis Virales en el INEI --Anlis Dr. Carlos G. Malbran en Buenos Aires, Argentina.

Analisis estadistico

Para el analisis de positividad de VHE en heces de cerdos en las plantas de beneficio, y segun la subregion de procedencia, se calcularon las frecuencias de los datos, los intervalos de confianza (con un nivel de confianza del 95%) y las diferencias entre proporciones (con base en la prueba exacta de Fisher con un nivel de confianza del 95%); se consideraron significativos valores de P<0.05. Todos los analisis fueron realizados usando las herramientas del programa GraphPadPrism 5[R] (GraphPad Software Inc., La Jolla, EUA).

RESULTADOS Y DISCUSION

La deteccion molecular del VHE en las muestras de heces obtenidas en las cinco plantas de beneficio mostro que el 26.9 % de las muestras fueron positivas para el ORF1 (Figura 1). En porcentaje realtivamente alto si lo comparamos con un estudio similar realizado en Italia (en una sola planta de beneficio) donde se encontro que de 150 muestras de heces analizadas 11(7.3%) fueron positivas por RT-PCR (Di Martino et al. 2010). Sin embargo otros trabajos realizados en cerdos entre las 13 y 22 semanas de edad (en general a las 22 semanas de vida es el tiempo donde los cerdos se envian a beneficio) recolectadas en diversas granjas del Reino Unido, Portugal Italia y Holanda se encontro porcentajes de deteccion del virus en heces del 10%, 30%, 23% y 73% respectivamente (Berto et al. 2012); lo que indica que los resultados en las plantas de faenado de Antioquia son similares y aun menores que paises catalogados como industrializados.

La proporcion de cerdos positivos en cada planta de beneficio, fue de: (43/9)20.9%, (22/7)31.8%, (29/9)31.0%, (36/7)19.4% y (22/9)40.9% para las plantas A, B, C, D y E, respectivamente (Figura 1). Aunque los porcentajes son variables no se encontro diferencia estadisticamente significativa en las proporciones de positividad entre cada una de las plantas (prueba exacta de Fisher con un [alfa] < 0.05). Lo anterior indica que no hay un efecto en la positividad al HEV atribuible a las plantas de beneficio analizadas, las cuales tienen un nivel de tecnificacion apropiado y practicas de manufactura similares y son las que reunen la mayor proporcion de sacrificio legal en Antioquia.

Los cerdos analizados pasaron la inspeccion sanitaria de cada una de las plantas y provenian de cinco de las nueve subregiones en las que se divide el departamento. Las subregiones Norte y Valle de Aburra agruparon la mayor cantidad de muestras (69 y 43, respectivamente), lo que fue consistente con el volumen de produccion de cerdos aportados para el consumo humano en la region (FNP 2012). La positividad por subregion a VHE vario de 11.6% para la region Norte a 58.3% para la region Oriente (Figura 2). No se presentaron diferencias estadisticas significativas respecto de la positividad al virus en los cerdos que provenian de las subregiones Suroeste, Occidente, Valle de Aburra y Oriente; sin embargo en la subregion Norte, la de mayor volumen de produccion de cerdos para consumo humano en Antioquia (FNP 2012), se presento la menor positividad a HEV al compararse con las demas subregiones (prueba de exacta de Fisher con valores de p=0,0162, p=0,0019 y p= 0,0009 para las Norte vs. Suroeste, Norte vs. Valle de Aburra y Norte vs. Oriente, respectivamente). Se desconoce la razon de esta diferencia si bien podria estar relacionado con el manejo de los protocolos de sanidad en cada granja o tambien por la menor capacidad de infeccion de las variantes del virus que circulan en esa region por lo que se hace necesario realizar estudios sobre la dinamica de trasmision en las producciones porcinas y su asociacion con las practicas sanitarias en granjas del departamento e incluso del pais.

Los resultados de esta investigacion concuerdan con lo reportado por otros investigadores, quienes encontraron que el genoma viral del VHE es detectable en heces de cerdos naturalmente infectados hasta la semana 22 (de Deus et al. 2008; Leblanc et al. 2007), que es la edad promedio en la que, por lo general, los cerdos son beneficiados para el consumo humano en Antioquia (Diaz et al. 2011).

Los porcentajes de positividad encontrados en las muestras analizadas sugieren que, independientemente de la plantas de beneficio, los cerdos en edad de sacrificio en el departamento de Antioquia estan excretando virus al ambiente y, aunque las tecnicas de deteccion del genoma viral empleadas no permiten establecer si el virus es infeccioso o no, es claro que el VHE se encuentra circulando en las producciones porcinas de Antioquia. Esta circunstancia pone en riesgo de infeccion a los trabajadores de la cadena porcicola puesto que la presencia del genoma del VHE en las heces de cerdos en el momento del beneficio, aumenta el riesgo de contaminacion de la carne de cerdo para consumo humano.

Las investigaciones sobre la dinamica del trasmision del virus son escasas en nuestro pais, por lo cual se hace necesario llevar a cabo trabajos conjuntos con las autoridades de salud con el fin de generar la informacion necesaria para tomar las medidas pertinentes que permitan evitar la diseminacion del virus hacia las fuentes de agua y disminuir el riesgo de infeccion en trabajadores de la cadena porcicola.

HTTP://DX.DOI.ORG/10.15446/RFMVZ.V61N3.46868

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J. E. Forero (1), J. E. Parra (1), A. Lopez (1) *

Articulo recibido: 3 de abril de 2014 * Aprobado: 1 de septiembre de 2014

(1) Grupo Biodiversidad y Genetica Molecular--Biogem--, Departamento de Produccion Animal, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Colombia, sede Medellin. AA1779, Autopista Norte Calle 59A nro.63-20, bloque 50, oficina 310, Medellin (Colombia).

* Autor para correspondencia: alherrera@unal.edu.co

Leyenda: FIGURA 1. Proporcion de cerdos positivos para el ORF1 del genoma del VHE en cinco plantas de beneficio porcino de Antioquia (Colombia). No se encontraron diferencias estadisticas significativas respecto de la positividad entre las cinco plantas estudiadas.

Leyenda: FIGURA 2. Proporcion de cerdos positivos para el ORF1 del genoma del HEV segun la region de procedencia de los cerdos. La region Norte es significativamente diferente a las regiones Suroeste, Occidente, Valle de Aburra y Oriente.
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Title Annotation:INVESTIGACION
Author:Forero, J.E.; Parra, J.E.; Lopez, A.
Publication:Revista Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia
Date:Sep 1, 2014
Words:3476
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