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Cyr61 expression in normal and neoplastic mammary glands of bitches/ Expressao de Cyr61 em glandulas mamarias normais e neoplasicas de cadelas.

INTRODUCAO

A Cyr61 e uma proteina rica em cisteina ligante de heparina que se liga a multiplos receptores de integrinas, podendo estar presente no citosol e/ou associada a membrana celular e a matriz extracelular de celulas mesenquimais e epiteliais. Atua na adesao celular, no estimulo a migracao celular e angiogenese, e no realce da sintese de DNA, operando como fator de crescimento promotor da proliferacao fibroblastica e de celulas endoteliais, bem como no estimulo da condrogenese em celulas mesenquimais (XIE et al., 2001b; BRIGSTOCK, 2002; TSAI et al., 2002). Nas celulas em repouso, apresenta-se em baixa quantidade, mas e rapidamente induzida em resposta a fatores de crescimento, divisao celular (O'BRIEN et al., 1990), ao estrogeno no tecido uterino (RIVERA-GONZALEZ et al., 1998), a vitamina D3 nos osteoblastos fetais (SCHUTZE et al., 2001) e ao fator VII-a e a trombina nos fibroblastos humanos (PENDURTHI, 2000).

Em humanos, o aumento da expressao da Cyr61 foi verificado em diversas enfermidades, como arteriosclerose (HILFIKER et al., 2002; SCHOBER et al., 2002), trombose (PENDURTHI et al., 2000) e, especialmente, neoplasias mamarias (XIE et al., 2001b; SAMPATH et al., 2001; MENENDEZ et al., 2003). Estudos demonstraram o aumento da expressao da Cyr61 em adenocarcinomas mamarios de mulheres e seu possivel envolvimento em tumores mediados por estrogenos (TSAY et al., 2000; SAMPATH et al., 2001; XIE et al., 2001a e b).

A avaliacao da expressao da Cyr61 em neoplasias mamarias de mulheres apresenta valor prognostico, pois essa proteina e um fator proangiogenico e regulador do crescimento, e o aumento da sua expressao indica maior grau de malignidade, permitindo que a evolucao clinica da neoplasia seja prevista, como a possibilidade de recidivas ou a sobrevida da paciente nao tratada (SAMPATH et al., 2001).

As neoplasias mamarias de cadelas apresentam etiologia e fatores predisponentes semelhantes aos das mulheres, como a acao de estrogeno e progesterona exogenos. Porem, a incidencia de neoplasia mamaria canina, quando comparada a humana, mostra-se tres vezes mais alta, mesmo considerando que ambas as especies apresentam aumento da incidencia dessas neoplasias na mesma magnitude. Ainda, ressalta-se que a classificacao histologica das neoplasias mamarias em cadelas difere da humana, especialmente no que diz respeito as malignas. Apesar disso, sugere-se que os estudos com neoplasias mamarias de cadelas possam ser utilizados como modelos para melhor entendimento da doenca na especie humana (MISDORP et al., 1999; MISDORP, 2002).

Assim, este trabalho teve o objetivo de determinar o perfil de expressao da Cyr61 em glandulas mamarias normais e neoplasicas de cadelas, verificando a expressao constitutiva e a intensidade de marcacao desta nos casos propostos. A utilizacao desse anticorpo em estudos com neoplasias mamarias de cadelas ainda nao havia sido realizada, sendo este o primeiro relato da marcacao de celulas da glandula mamaria canina por Cyr61.

MATERIAL E METODOS

Foram estudados 40 fragmentos de glandula mamaria de cadela, sendo 10 normais e 30 neoplasicos. As amostras de neoplasia mamaria foram adquiridas do arquivo do Setor de Patologia Animal da Escola de Veterinaria da Universidade Federal de Goias, Goiania, GO (EV/UFG). As amostras de glandula mamaria normal, avaliadas macro e microscopicamente, foram obtidas de 10 cadelas encaminhadas ao Setor de Patologia Animal da EV/UFG para exame anatomopatologico. O material foi fixado em formol tamponado a 10%, processado e incluido em parafina. As amostras foram inicialmente avaliadas em hematoxilina e eosina (HE) e agrupadas de acordo com a classificacao histologica, considerando glandula mamaria normal (n=10), adenoma simples (n=10), carcinoma complexo (n=10) e carcinoma simples solido (n=10). As neoplasias mamarias foram diagnosticadas segundo criterios da AFIP (Armed Forces Institute of Pathology) (MISDORP et al., 1999).

Para a tecnica de imunoistoquimica, cortes de 5 [mu] m foram distendidos sobre laminas silanizadas (3, aminopropyl-triethoxysilane, Sigma--Aldrich, St. Louis, MO, USA), sendo incubados em estufa a 36 [degrees]C, desparafinizados e hidratados. Foram realizados o bloqueio da peroxidase endogena ([H.sub.2] [O.sub.2] 30%, 15 minutos), a recuperacao antigenica (tampao citrato pH 6,0, panela de pressao, tres minutos) e o bloqueio de reacoes inespecificas (BSA a 3%, 1h30min, temperatura ambiente, camara umida). Em seguida, os cortes foram incubados com o anticorpo policlonal anti-Cyr61 (H78; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), na diluicao de 1:1000, durante 18 horas, a 4 [degrees]C e em camara umida. Como controle negativo utilizou-se BSA 1,5%. Na sequencia, empregou-se o complexo streptoavidina-biotina-peroxidase (LSAB, Dako, K0690), em duas etapas de 20 minutos, em camara umida e a temperatura ambiente. A reacao foi revelada com solucao de diaminobenzidina (DAB, Dako, K3468), por um minuto. Solucao de PBS foi utilizada para as lavagens entre as etapas. Os cortes foram contracorados com hematoxilina de Mayer, por 30 segundos, e montados com resina sintetica (Sigma) e laminulas histologicas.

As laminas submetidas a imunoistoquimica com anti-Cyr61 foram analisadas em microscopio optico de campo claro quanto a localizacao e tonalidade da marcacao. A intensidade de marcacao das celulas epiteliais normais e neoplasicas foi mensurada por avaliacao semiquantitativa apos a avaliacao de todas as laminas e posterior definicao de tonalidades em escores de gradacao de cor, considerando as tonalidades ausente (0), discreta (1), moderada (2) e acentuada (3), sendo todos os fragmentos avaliados em aumento de 100x. Na analise estatistica, foram aplicados os testes de Mann-Whitney e analise de variancia de postos de Kruskal-Wallis (SAMPAIO, 2007).

RESULTADOS E DISCUSSAO

Houve marcacao do anticorpo anti-Cyr61 no citoplasma de celulas epiteliais e estromais do tecido mamario canino normal e neoplasico, incluindo as tubuloalveolares, os fibroblastos, as endoteliais e as musculares lisas de arterias e arteriolas. De forma semelhante, porem em tecido humano, MOUSSAD & BRIGSTOCK (2000) e BRIGSTOCK (2002) descrevem que a Cyr61, bem como as demais proteinas da mesma familia, sao expressas em fibroblastos, celulas epiteliais, endoteliais, do musculo liso e celulas neuronais.

Neste estudo, houve variacao na intensidade de marcacao da Cyr61 nas celulas epiteliais normais e neoplasicas dos diferentes grupos (Tabela 1). Em 80% das amostras de tecido normal, a marcacao foi moderada, e em 20%, acentuada. No diagnostico de adenoma simples, foi constada marcacao acentuada na maioria dos casos (80%) e moderada em 20% (Figura 1A). Ja nos carcinomas complexos, a marcacao foi discreta em 20% das amostras e moderada em 80%, semelhante ao observado em tecidos normais. Nos casos de carcinoma simples solido, 50% apresentaram marcacao moderada e 50% discreta (Figura 1B). Em todas as amostras, mais de 70% das celulas apresentaram a intensidade de marcacao referida.

Houve diferenca (P<0,05) entre todos os diagnosticos, exceto entre glandula mamaria normal e com carcinoma complexo (P>0,05) (Tabela 1). A intensidade de marcacao foi maior na glandula mamaria normal quando comparada ao carcinoma simples solido, e menor quando comparada ao adenoma simples, que tambem apresentou marcacao mais acentuada quando comparado ao carcinoma complexo e ao carcinoma simples solido.

Considerando apenas as neoplasias malignas, o carcinoma complexo apresentou maior escore de marcacao quando comparado ao carcinoma simples solido. Acerca disso, XIE et al. (2001b), em estudo comparativo da expressao de Cyr61 em glandulas mamarias humanas normais e neoplasicas, verificaram aumento da expressao dessa proteina em 39% dos adenocarcinomas mamarios primarios invasivos, menor expressao em adenocarcinomas de baixo grau e ausencia de expressao no tecido mamario normal. Em estudos similares, JIANG et al. (2004) e O'KELLY et al. (2008) encontraram expressao aumentada de Cyr61 em celulas de adenocarcinomas mamarios de mulheres quando comparada com celulas normais e, entre os adenocarcinomas, observaram maior expressao nos tipos mais invasivos em comparacao aos de baixo grau de malignidade. Tambem, SAMPATH et al. (2001) encontraram aumento da expressao da Cyr61 em 70% dos adenocarcinomas ductais invasivos. Diante disso, e possivel que a diferenca de intensidade de marcacao observada entre as neoplasias malignas neste estudo esteja relacionada ao grau de malignidade, ja que, segundo MISDORP et al. (1999), estudos sobre prognostico de neoplasias mamarias malignas em cadelas mostram que o carcinoma complexo apresenta menor grau de malignidade quando comparado ao carcinoma simples solido. Contudo, ressalta-se que no tecido mamario canino a expressao diminui conforme aumenta a malignidade tumoral, ao contrario do que se observa no tecido mamario da mulher, em que quanto maior o grau de malignidade, maior a expressao da Cyr61.

De acordo com MEUTEN (2002), tumores de mama em cadelas possuem receptores para estrogeno, progesterona, androgenos, prolactina e fator de crescimento epidermal. Nas femeas dessa especie, grande parte dos tumores benignos mamarios e positiva para receptores de estrogeno e progesterona, enquanto poucas neoplasias malignas expressam os mesmos receptores e em concentracoes menores (CASSALI, 2000; GERALDES et al., 2000). Assim, com a progressao do tumor e o aumento da malignidade das neoplasias mamarias em cadelas, ocorre reducao da dependencia hormonal e maior autonomia das celulas neoplasicas (GERALDES et al., 2000). Diante disso, e possivel que a expressao moderada a acentuada de Cyr61 nos adenomas simples de glandula mamaria de cadelas relacione-se a maior concentracao de receptores de estrogeno nesses tumores enquanto que a expressao discreta a moderada nos carcinomas mamarios relacione-se a diminuicao desses receptores, o que tambem pode explicar a diferenca de marcacao entre os carcinomas, ja que XIE et al. (2001b) relataram que a hiperexpressao de Cyr61 esta diretamente relacionada a positividade de receptores de estrogeno em celulas epiteliais mamarias neoplasicas malignas em humanos.

[FIGURE 1 OMITTED]

A intensidade de marcacao verificada na glandula mamaria normal variou de moderada a acentuada e, neste grupo, alem da marcacao citoplasmatica, tambem foi observada marcacao nuclear nas celulas epiteliais ductais. Considerando que a glandula mamaria e o unico orgao em que o desenvolvimento de ductos ocorre apos a fase embrionaria (WISEMAN & WERB, 2002), e possivel a participacao da Cyr61 na promocao da proliferacao e adesao das celulas epiteliais dos ductos mamarios, ja que essa proteina esta envolvida nos processos de mediacao da migracao e adesao celular, operando como fator de crescimento em diversas situacoes (XIE et al., 2001b; BRIGSTOCK, 2002; TSAI et al., 2002).

Em humanos, varios estudos tem procurado caracterizar o padrao de expressao da Cyr61 em diferentes tipos de processos patologicos, principalmente os neoplasicos (BRIGSTOCK, 2002; HILFIKER et al., 2002; SAKAMOTO et al., 2004). Pesquisas evidenciando a importancia dessa proteina na carcinogenese mamaria de mulheres tem ampliado as perspectivas de terapeutica e a prevencao da progressao desses tumores (TSAI et al., 2000; SAMPATH et al., 2001; MENENDEZ et al., 2003). Embora a expressao da Cyr61 no tecido mamario normal e neoplasico das cadelas tenha sido diferente da que se observa na mama da mulher, a avaliacao tecidual dessa proteina pode representar uma ferramenta na determinacao do prognostico das neoplasias mamarias das femeas da especie canina. Ainda, a possivel relacao entre hormonios, como estrogeno e progesterona, e a ativacao e a expressao da Cyr61 suscita a necessidade da investigacao da expressao desses receptores hormonais e dessa proteina no tecido mamario canino, especialmente naquele com proliferacoes malignas.

CONCLUSOES

A marcacao de Cyr61 no tecido mamario canino e mais acentuada nas glandulas normais e com neoplasia benigna em comparacao aquele com proliferacoes malignas. Entre os tipos neoplasicos, o adenoma simples apresenta maior intensidade de marcacao para Cyr61. Ja quando consideradas as neoplasias malignas, ha maior intensidade de marcacao no carcinoma complexo. A utilizacao do anticorpo policlonal anti-Cyr61, por meio de imunoistoquimica, em fragmentos de glandulas mamarias normais e neoplasicas de cadelas, permite demonstrar a expressao constitutiva da proteina, e mostra potencial para indicar o grau de malignidade entre os diferentes tipos histologicos.

AGRADECIMENTOS

A Prof.a Dr.a Renee Laufer Amorim (FMVZ, UNESP, Botucatu, SP) e ao Prof. Msc. Helder Esteves Thome (UNIFEOB, Sao Joao da Boa Vista, Sao Paulo), pela colaboracao na obtencao das neoplasias mamarias.

REFERENCIAS

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Marina Pacheco Miguel (I), Tatyane Penha Sales (II), Liliana Borges de Menezes (III) Julia Miranda Moraes (II), Veridiana Maria Brianezi Dignani de Moura (IV), Luiz Augusto Batista Brito (IV), Eugenio Goncalves de Araujo (IV)

(I) Curso de Biomedicina, Campus Jatai, Universidade Federal de Goias (UFG), Rodovia Br-364, Km 192, CP 03, 75800-970, Jatai, GO, Brasil. E-mail: marinavet2005@yahoo.com.br. Autor para correspondencia

(II) Programa de Pos-graduacao em Ciencia Animal, Escola de Veterinaria (EV), UFG, Goiania, GO, Brasil.

(III) Departamento de Patologia, Instituto de Patologia Tropical e Saude Publica (IPTSP), Goiania, GO, Brasil.

(IV) Setor de Patologia Animal, Departamento de Medicina Veterinaria, EV, UFG, Goiania, GO, Brasil.

Recebido para publicacao 13.03.09 Aprovado em 21.04.10 Devolvido pelo autor 24.05.10 CR-1774
Tabela 1--Medias de postos e frequencia dos diferentes escores de
intensidade para o anticorpo anti-Cyr61 em glandulas mamarias normais
e neoplasicas de cadelas.

                                                   Escores
                           Medias de
Grupos                      postos     0      1         2         3

Normal                     3,2 (a)     0      0      8 (80%)   2 (20%)
Adenoma Simples            3,8 (b)     0      0      2 (20%)   8 (80%)
Carcinoma Complexo         2,8 (ac)    0   2 (20%)   8 (80%)      0
Carcinoma Simples Solido   2,5 (d)     0   5 (50%)   5 (50%)      0

Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenca entre grupos
(P<0,05).

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moderada e 3-marcacao acentuada.
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Author:Miguel, Marina Pacheco; Sales, Tatyane Penha; de Menezes, Liliana Borges; Moraes, Julia Miranda; de
Publication:Ciencia Rural
Date:Jun 1, 2010
Words:3277
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