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Cultivo de tejidos de piper sp.

Tissue culture of Piper sp. (Piperaceae): In vitro propagation, organogenesis and germplasm conservation

Introduccion

La familia Piperaceae es considerada una de las mas complejas y diversas entre las angiospermas basales, razon por la cual la definicion del numero de generos y especies que la componen, su filogenia y modelo de diversidad floral es, en la actualidad, motivo de grandes controversias (Jaramillo y Manos, 2001). Para algunos autores, incluye 14 generos y alrededor de 1950 especies (Mabberley, 1997), ampliamente distribuidas en ambos hemisferios. Comprende plantas herbaceas, arbustivas, algunas veces trepadoras y arboles. Conjuntamente con las Chlorantaceae y Saururaceae forman un grupo taxonomicamente aislado (Orden Piperales) de plantas relativamente arcaicas (Taylor y Hickey, 1992). Las especies americanas de Piperaceae se clasificaron en los generos Lepianthes Raf. (Pothomorphe Miq.), Peperomia R. & P., Piper L., Sarcorhachis Trel. y Trianaeopiper Trel. (Tebbs, 1989), aunque en el Peru se han descubierto unicamente los generos Peperomia, Piper y Sarcorhachis y 811 especies, de las cuales 528 son consideradas endemicas (Brako y Zarucchi, 1993); en el Ecuador los generos Peperomia, Piper, Sarcorhachis y Trianaeopiper y 441 especies, con 134 especies endemicas (Callejas, 1999) y en el Brasil los generos Ottonia, Peperomia, Piper, Pothomorphe y Sarcorhachis y 479 especies, sin precisarse el numero de endemicas (Yuncker, 1972); posteriormente, las especies de Ottonia fueron incorporadas a Piper (Tebbs, 1989).

Las especies del genero Piper tienen importancia comercial, economica y medicinal. Las semillas de P. nigrum constituyen la conocida "pimienta negra", utilizada como condimento en la preparacion de alimentos. Otras especies son consideradas remedios para el dolor de estomago, para aliviar dolores de pecho, fiebre y afecciones hemorroides, como antiinflamatorio, en el tratamiento del asma, bronquits; igualmente se les reconocen actividad insecticida y fungicida (Parmar et al., 1997). Recientemente, extractos de varias especies de Piper, colectadas en Antioquia (Colombia), han mostrado una moderada actividad antiplasmodial y baja actividad citotoxica (Mesa et al., 2012), y en el Peru, varias especies de Piper conocidas con el nombre popular de "matico", "nudillo" o "palo soldado", son empleadas en la medicina tradicional en el tratamiento de constipados y neumonia, como antiinflamatorio, antiseptico, en el tratamiento de infecciones vaginales, dolencias digestivas y bronquiales (Brack, 1999).

La familia Piperaceae contiene metabolitos secundarios como los fenilpropanoides (Orjala et al., 1993), lignanos y neolignanos (Benevides et al., 1999), amidas alifaticas y aromaticas (Silva et al., 2002), alcaloides (Dodson et al., 2000), policetidos (Cheng et al., 2003) y cromenes (Lago et al., 2004). La mayoria de estos estudios se realizaron en el genero Piper y en pocos casos en el genero Peperomia (Kato y Furlan, 2007). La importancia de los compuestos quimicos aislados en Piperaceae es notable, por ejemplo, el interes de los lignoides (lignanos, neolignanos y sustancias relacionadas) se debe a su amplia diversidad de actividades biologicas: antitumorales, antifungicas, bactericidas, anti PAF y anti HIV (Ayres y Loike, 1990), asi como las amidas, con destacado potencial como agentes insecticidas, moluscicidas y fungicidas (Dyer y Palmer, 2004).

En comparacion con especies de importancia economica, los estudios en Piper han sido relativamente escasos. Trabajos pioneros como el de Mathews y Rao (1984) tuvieron escaso exito debido a problemas de contaminacion endogena y oxidacion de los explantes. Posteriormente, se describio la induccion de diversas respuestas morfogenicas en P auritum (Dominguez et al., 2006), P. betle, P. longum y P. nigrum (Philip et al., 1992; Bhat et al., 1995; Aminuddin-Johri et al., 1993; Soniya y Das, 2002; Sujatha et al., 2003; Hussain et al., 2011; Rani y Kumar, 2012), P colubrinum (Kelkar et al., 1996; Kelkar y Krishnamurty, 1998), P. methysticum (Zhang et al., 2008; Maju y Soniya, 2012), P. solmsianum (Balbuena et al., 2009; Vasquez et al., 2010) y Pothomorphe umbellata (= Piper umbellatum) (Cesty et al., 2007). Asimismo, se indujo embriogenesis somatica en alta frecuencia en P nigrum y P colubrinum (Yusuf et al., 2001; Nair y Gupta, 2006) y de manera esporadica en P methysticum (Maju y Soniya, 2012), asi como el establecimiento de suspensiones celulares y la biosintesis de diversos metabolitos secundarios en P. aduncum (Delgado et al., 2002), P. cernuum y P. crassinervium (Danelutte et al., 2005) y P solmsianum (Balbuena et al., 2009).

Teniendo en cuenta que los especimenes de Piper son esporadicos en su ambiente natural, el endemismo de numerosas especies, la perdida rapida de viabilidad de las semillas, la recalcitrancia en la conservacion de las semillas por largos periodos de tiempo, la escasa regeneracion natural, la importancia creciente por sus propiedades farmacologicas, entre otros factores, se adelanto el presente trabajo, que comprende un conjunto de investigaciones iniciadas en Piperaceas en 1998 y que continuan en la actualidad, con el objetivo de inducir diversos procesos morfogenicos como la propagacion clonal y la organogenesis, asi como la conservacion y el intercambio internacional de germoplasma de varias especies de Piper de Peru, Brasil y Ecuador, haciendo uso de diversas tecnicas del cultivo de tejidos in vitro, que permitan la superviviencia y aprovechamiento de sus especies. La conservacion de germoplasma in vitro aseguraria la preservacion de los mejores genotipos en tanto que el intercambio de germoplasma minimizaria la transferencia de plagas y enfermedades de una region geografica a otra y posibilitaria el amplio uso de estas especies en diversas investigaciones.

Materiales y metodos

Material vegetal

El material vegetal estuvo conformado por espigas maduras de 19 especies de Piper, colectadas en localidades de Peru, Brasil y Ecuador, y unicamente en el caso de P cernuum y P regnellii de hojas jovenes de 5 cm de largo de plantas adultas sembradas en invernadero (tabla 1). Las espigas se colectaron en diferentes epocas del ano y a lo largo de varios anos, seleccionandose de la region media de varias plantas adultas mayores de 5 anos de edad. Se consideraron espigas maduras porque tenian color negro y eran muy blandas al tacto. Las especies fueron identificadas por el Dr. Guillermo E. Delgado Paredes de la Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo (UNPRG) de Lambayeque, Peru, en base a las descripciones realizadas por Trelease (1936), Yuncker (1972, 1973) y Tebbs (1989, 1990, 1993). Los experimentos de cultivo in vitro se realizaron en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del Instituto de Quimica de la Universidade de Sao Paulo (Brasil), Laboratorio de Micropropagacion Vegetal de la Universidad Nacional de Loja (Ecuador) y el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales y Recursos Geneticos de la UNPRG. Unicamente para las especies de las que se colectaron mas de 25 semillas maduras se ensayo la germinacion in vitro.

Germinacion de semillas

En el laboratorio, las semillas se separaron de los frutos y fueron esterilizadas superficialmente en grupos de 50 unidades, con alcohol etilico 70% durante 1 min e hipoclorito de sodio concentrado (Clorox(r) 5,25% de cloro activo) con tres gotas de Tween(r)20 durante 10 min y posteriormente se enjuagaron con agua destilada esterilizada por tres veces consecutivas con permanencia del agua durante 1 min. El medio de cultivo se conformo con las sales minerales MS (Murashige y Skoog, 1962), las vitaminas m-inositol 100 mg [L.sup.-1] y tiamina.HCl 1 mg [L.sup.-1], sacarosa 2% y agar 0,8%. El pH del medio de cultivo se ajusto en 5,8 [+ or -] 0,1 con HCl 0,1N y NaOH 0,1N, antes de dispensarlo en tubos de ensayo de 150 x 18 mm, que despues de sellados, se esterilizaron a 121 [grados]C y 15 libras/pulgada (2) de presion durante 20 min. Se cultivaron 5 - 8 semillas por tubo de ensayo, distribuyendose uniformemente para evitar la competencia, teniendo en cuenta que la semilla tiene una longitud promedio de 1,3 mm. Las condiciones ambientales de incubacion se ajustaron a 24 - 26 [grados]C, 80 - 85 % de humedad relativa y oscuridad total.

Propagacion clonal

Plantas de 2-3 meses de edad, provenientes de semillas germinadas in vitro, se propagaron mediante el cultivo de apices caulinares y segmentos nodales, en medio de cultivo conformado por las sales minerales MS, vitaminas, sacarosa 3%, agar 0,8% y los reguladores de crecimiento acido indol-3-acetico (AIA) y acido giberelico ([AG.sub.3]) ambos a 0,02 mg [L.sup.-1], el mismo que resulto de varios ensayos previos realizados en la micropropagacion de diversas especias de Piper. En efecto, estos ensayos sobre elongacion y desarrollo de brotes realizados en P aduncum (Delgado et al., 2002), con interaccion AIA - [AG.sub.3] - BAP en varias concentraciones y en P solmsianum (Vasquez et al., 2010), con interaccion AIA--[AG.sub.3], suplementado con varios niveles de sacarosa y el fertilizante NPK Plant Prod 25 mg [L.sup.-1], posibilitaron definir a la interaccion AIA - [AG.sub.3] 0,02 mg [L.sup.-1], respectivamente, y sacarosa 3%, como el medio de cultivo a utilizar en la propagacion clonal de varias especies de Piper. Los explantes se cultivaron en el medio de cultivo contenido en tubos de ensayo de 150 x 25 mm y los subcultivos se realizaron cada 6 - 10 meses. En los ensayos de propagacion clonal se utilizaron 10 explantes por especie repitiendose el ensayo dos veces. Los cultivos se incubaron a 70 - 80 [micron]mol m-2 s-1 de irradiancia y con un fotoperiodo de 16/8 h, con luz blanca proveniente de lamparas fluorescentes de 40 w.

Organogenesis

En la induccion de respuestas organogenicas se utilizaron diversos explantes como peciolos, raices y entrenudos de 10 mm de largo y segmentos de hojas (limbos) de 10 mm de lado, provenientes de plantas in vitro de 45 - 60 dias de edad y segmentos de hojas jovenes de 10 mm de lado, removidos de plantas adultas en crecimiento activo en condiciones de invernadero. La asepsia de los explantes de plantas in vitro se considero per se en tanto que, para las plantas de invernadero la desinfeccion se realizo siguiendo el protocolo utilizado para la desinfeccion de semillas. Los explantes se cultivaron horizontalmente y, en el caso de las hojas, con la superficie abaxial en contacto con el medio de cultivo, el que estuvo conformado por las sales minerales MS, vitaminas, sacarosa 3% y diversas interacciones entre auxinas y citocininas. Entre las auxinas se utilizo acido indol-3-acetico (AIA), acido naftaleneacetico (ANA), acido 3,6-dicloro-o-anisico (DI CAMBA) y acido 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4-D), y entre las citocininas se utilizo la benzilaminopurina (BAP), kinetina (KIN) y tidiazuron (TDZ), en concentraciones de 0 - 2 mg [L.sup.-1]. En algunos tratamientos a las interacciones auxinas - citocininas se suplemento [AG.sub.3] 0,02 mg [L.sup.-1]. Los explantes se cultivaron en medio de cultivo contenido en frascos de vidrio transparente de 100 x 50 mm. Se utilizaron 15 explantes por tratamiento y cada tratamiento fue repetido dos veces. Los cultivos se incubaron a 50 - 70 Limol [m.sup.-2] [s.sup.-1] de irradiancia y con un fotoperiodo de 16/8 h.

A los valores de las diferentes variables obtenidas, tanto en los ensayos de propagacion clonal como de organogenesis, se les realizo un analisis de varianza bifactorial y en los casos en que se observaron diferencias significaticas se aplico la prueba de Rangos Multiples de Duncan al 5%, para la comparacion de medias, mediante el programa Statgraphics[R] (Statistical Graphics Corporation, 1999).

Conservacion de germoplasma

En el proceso de conservacion de germoplasma, explantes de 1,5 cm de altura, conformados por el apice caulinar y un nudo, se establecieron en el mismo medio de cultivo de propagacion clonal contenido en tubos de ensayo de 150 x 25 mm a razon de un explante por recipiente y de 10 repeticiones por especie. El metodo utilizado fue el de "limitacion del crecimiento a tasas minimas" (Roca et al., 1991) donde el factor limitante fue la irradiancia puesto que los cultivos se sometieron a un regimen de 20 - 40 Lmol [m.sup.-2] [s.sup.-1] con el mismo fotoperiodo (16/8 h), en tanto que el medio de cultivo fue el mismo utilizado en la propagacion clonal, MS suplementado con AIA y [AG.sub.3] 0,02 mg [L.sup.-1].

Resultados y discusion

Germinacion de semillas

En la tabla 2 se muestran los resultados sobre germinacion de semillas la misma que alcanzo tasas tan altas como 98,9 y 98,1% en Piper umbellatum y P solmsianum, respectivamente, asi como tan bajas como 20,0 y 26,0% en P aduncum y P cernuum, respectivamente, despues de cuatro semanas de cultivo, cuando se utilizaron semillas de una semana de colectadas. Estos datos guardan cierta relacion con los mostrados para P solmsianum donde la tasa de germinacion fue 35 y 80%, despues de cuatro y ocho semanas de cultivo, respectivamente (Balbuena et al., 2009). Por otro lado, semillas cultivadas a las tres semanas de colectadas alcanzaron tasas de germinacion de 43,7% como en P. flavoviride, y a los tres meses de colectadas 0,0% de germinacion como en P cernuum. Con excepcion de P. aduncum y P flavoviride, que aun conservaron un porcentaje de germinacion de semillas de 9,6 y 13,2, respectivamente, cuando fueron cultivadas despues de siete meses de colectadas. En el resto de especies de Piper no hubo germinacion despues de tres meses de colectadas las semillas. Un caso particular resulto P mohomoho cuyas semillas colectadas en la localidad de Catache (Cajamarca, Peru) no germinaron, aun sometidas a tratamientos con acido giberelico ([AG.sub.3]).

Una clasificacion muy aceptada sobre la viabilidad de las semillas es en ortodoxas y recalcitrantes (Roberts, 1973). Las semillas ortodoxas preservan su viabilidad durante periodos muy largos bajo condiciones de almacenamiento con temperaturas bajas (-10 a -20 [grados]C) y un contenido de humedad de las semillas por debajo de 10%; en tanto que las semillas recalcitrantes no toleran las condiciones de almacenamiento y mueren. En el caso de las semillas de Piper, debido a que pierden rapidamente su viabilidad se les puede clasificar como semillas recalcitrantes puesto que aun conservadas en refrigeracion (10 [grados]C) o en condiciones de temperatura ambiente, pierden totalmente su viabilidad despues de 3 meses de colectadas. En ensayos de germinacion de semillas de varias especies de Piper, (Vasquez-Yanes, 1974) y en P hispidium (Ludlow y Vazquez-Yanes, 1979), realizados en cajas de Petri, demostraron que el proceso era fuertemente influenciado por la luz, resultando favorables las condiciones de longitud de onda roja, azul y blanca.

El conocimiento que se tiene sobre la viabilidad y germinacion de las semillas de Piper, es aun escaso. Varios factores, como la colecta estocastica de las semillas, la posicion de los frutos en el tallo, los factores ambientales y el metodo de polinizacion, la edad de la planta, el contenido de reservas en los tejidos nutricios, los mecanismos que conllevan a la dormicion ya sea impuesta o innata, estarian influenciando la viabilidad y germinacion, que si bien resultan de caracter general para las semillas de las angiospermas (Barcelo et al., 2000), merecerian una detallada investigacion en el caso de Piper.

Por otro lado, algunos autores han enfatizado sobre la contaminacion endogena de las semillas de Piper por hongos, bacterias, fitoplasmas y patogenos virales (Mathews y Rao, 1984). En el caso de P nigrum y en P colubrinum la contaminacion endogena de bacterias provoco contratiempos en el establecimiento in vitro de las semillas (Mathews y Rao, 1984; Philip et al., 1992; Kelkar et al., 1996). Sin embargo, en P solmsianum la tasa de contaminacion fue 10% (Balbuena et al., 2009) mientras en este trabajo solo se presento 2 al 5%, debido al uso de alcohol etilico e hipoclorito de sodio, sin necesidad de recurrir a desinfestantes altamente toxicos como cloruro de mercurio, tal como reporto Philip et al., (1992) para P nigrum.

Propagacion clonal

En el ensayo realizado, P aduncum en solo tres meses de evaluacion alcanzo una altura de 16,0 cm y 7,6 nudos formados; en tanto que P regnellii, P solmsianum y P cernuum, en cinco meses de cultivo, alcanzaron una altura de 8,4; 4,4 y 3,8 cm, y 7,4; 6,0 y 4,9 nudos formados, respectivamente (tabla 3). Es posible que estas diferencias significativas en el crecimiento obedezcan, ademas de los factores geneticos intrinsecos, al efecto de las condiciones ambientales del cultivo, resultando favorables para P aduncum respecto al resto de las especies ensayadas. P aduncum tiene una distribucion cosmopolita y crece muy bien en temperaturas altas, en tanto que las otras especies tienen una distribucion restringida a determinadas regiones de America y crecen mejor en temperaturas templadas a frias.

El modelo general de propagacion clonal establecido por Murashige (1974) y para el caso de P longum por Bhat et al., (1995), abarco dos etapas: elongacion del brote e induccion de raices, en dos medios de cultivo distintos, tal como se observo en P auritum donde brotes regenerados de hojas se elongaron en medio de cultivo con 2,4-D - KIN, 0,1 y 1,0 mg [L.sup.-1], respectivamente, en tanto que el enraizamiento se alcanzo en medio de cultivo con AIA 2,0 mg [L.sup.-1] (Dominguez et al., 2006) y en P nigrum donde la regeneracion y elongacion de brotes se observo en medio de cultivo con BAP 0,5 mg [L.sup.-1] y el enraizamiento en medio de cultivo con AIB (acido indolbutirico) 1,5 mg [L.sup.-1] (Hussain et al., 2011). Sin embargo, en este estudio, ambas etapas fueron alcanzadas en un unico medio de cultivo. Dicho procedimiento permitio obtener tasas elevadas de plantulas a ser utilizadas en investigacion sobre morfogenesis, establecimiento de suspensiones celulares, conservacion e intercambio de germoplasma y aclimatacion de plantas a condiciones de suelo.

Organogenesis

El potencial morfogenico de varias especies de Piper en medio de cultivo MS suplementado con diferentes concentraciones e interacciones de ANA, BAP, [AG.sub.3], KIN y TDZ se resume en la tabla 4. En P aduncum, se ensayo TDZ 0,05 y 0,5 mg [L.sup.-1], alcanzando una mayor respuesta de regeneracion de brotes con TDZ 0,5 mg [L.sup.-1], tanto en hojas como en peciolos, con porcentajes de regeneracion de 32,8 y 70,4%, respectivamente, aunque en escaso numero (1-10 brotes/explante). Otras combinaciones de reguladores de crecimiento (ANA-BAP-[AG.sub.3]) posibilitaron la regeneracion de brotes, tanto en hojas como en entrenudos, los cuales mostraron un mayor potencial morfogenico con 66,5% de respuesta, aunque siempre en escaso numero de formacion de brotes (1-10 brotes/explante). En ambos tratamientos de reguladores de crecimiento, tambien fue posible la induccion de callos friables que cubren de 1/2 a 2/3 del explante (++), y que cubren totalmente el explante (+++). En P. cernuum la regeneracion de brotes fue observada en los tratamientos con BAP y KIN 2,0 mg [L.sup.-1], asi como con TDZ 0,5 a 2,0 mg [L.sup.-1], tanto en hojas como peciolos, en niveles tan altos como 75 y 65%, respectivamente, con TDZ 2,0 mg [L.sup.-1]. Sin embargo, en todos los casos el numero de brotes regenerados por explante fue escaso (1-10 brotes/explante). En P crassinervium una alta tasa de regeneracion de brotes (30-50 brotes/explante) se observo en el 65,7% de las hojas tratadas con TDZ 0,5 mg [L.sup.-1] y en las interacciones ANA 0,5 mg [L.sup.-1] - BAP 1,0 y 2,0 mg [L.sup.-1], en explantes de hojas, peciolos y raices, alcanzandose tasas de regeneracion de 100% y un numero elevado de brotes regenerados (>50 brotes/explante). En P. solmsianum la interaccion ANA 0,01 - BAP 1,0 mg [L.sup.-1], BAP 0,5 mg [L.sup.-1] y TDZ 0,5 mg [L.sup.-1], indujeron hasta 100% de regeneracion de brotes en hojas y entrenudos e incluso con una alta tasa de numero de brotes formados (>50 brotes/explante). En general, la regeneracion de brotes fue tan eficiente en hojas como en peciolos en todas las especies de Piper ensayadas e incluso en entrenudos, como fue el caso de P aduncum y P solmsianum, y en raices como fue el caso de P crassinervium, lo que indica que todos estos explantes tienen el potencial morfogenico necesario que permite la formacion de brotes, pero ello dependera de la calidad y concentracion de los reguladores de crecimiento utilizados.

La induccion de callos friables (++ y +++) fue observada solamente en P aduncum en todos los tratamientos de reguladores de crecimiento ensayados, en tanto que la formacion de raices fue observada unicamente en hojas y peciolos de P crassinervium en los tratamientos TDZ 0,05 y ANA 0,5 mg [L.sup.-1], respectivamente. En un trabajo pionero de organogenesis directa con P. longum, P. betle y P. nigrum de la India, Bhat et al., (1995) demostraron el potencial morfogenico de diversos explantes como raices, hojas (limbo y peciolo), nudos y entrenudos, en la induccion de brotes, despues de seis semanas de cultivo. En P. longum se demostro que el mayor numero de brotes formados correspondio a las raices seguido de los nudos, entrenudos y hojas, en las concentraciones de 1 y 2 Lm (0,2 y 0,4 mg [L.sup.-1]) de BAP y KIN, en tanto que en P. betle y P nigrum los brotes se diferenciaron solamente en entrenudos y nudos, en las concentraciones de 5 y 10 Lim (1 y 2 mg [L.sup.-1]) de BAP. Estos resultados guardan concordancia con los obtenidos en este trabajo, puesto que los mayores porcentajes de explantes que formaron brotes y el mayor numero de brotes formados se presento en los tratamientos con las citocininas BAP o TDZ. Asi mismo, resulto significativo que en este trabajo las raices de P crassinervium exhibieran un alto potencial morfogenico al igual que P longum (Bhat et al., 1995). Recientemente, en P nigrum, alrededor de 18 brotes se formaron en apices caulinares en medio de cultivo con BAP - AIA, 2,5 y 0,5 mg [L.sup.-1], respectivamente, en tanto que el enraizamiento fue mejor en medio de cultivo con AIB 0,5 mg [L.sup.-1] (Maju y Soniya, 2012) y en Pothomorphe umbellata (Piper umbellatum), la regeneracion de plantas, a partir de callos inducidos en semillas, fue alrededor de cinco, en medio de cultivo con [AG.sub.3] - BAP 0,1 y 0,5 mg [L.sup.-1], respectivamente (Cesty et al., 2007).

En un trabajo previo realizado en P solmsianum se observo que BAP 0,5 mg [L.sup.-1] y BAP 1,0 mg [L.sup.-1], con ANA 0,01 mg [L.sup.-1], indujeron 100% de formacion de brotes en entrenudos, mientras que TDZ 0,5 mg [L.sup.-1] y TDZ 0,5 mg [L.sup.-1], con ANA 0,01 mg [L.sup.-1], indujeron 100% de formacion de brotes tanto en entrenudos como en hojas con un maximo de 16,6 brotes/explante (Vasquez et al., 2010). En este trabajo se obtuvieron resultados similares, es decir, en las mismas concentraciones se alcanzo 100% de formacion de brotes pero siempre en un rango de 1-10 brotes/explante. Por otro lado, Balbuena et al., (2009), trabajando con discos de hojas y peciolos de P solmsianum, en varios tratamientos de la interaccion BAP (0; 0,2 y 2,0 mg [L.sup.-1]) con las auxinas AIA, ANA y 2,4-D (0; 0,2 y 2,0 mg [L.sup.-1]) observaron la formacion de raices cuando se utilizo unicamente AIA 0,2 y 2,0 mg [L.sup.-1], tanto en hojas como en peciolos; mientras que la formacion de brotes ocurrio en la interaccion BAP - AIA, en hojas y peciolos y BAP - ANA solamente en peciolos. Un hecho significativo fue la formacion de callos, unicamente en peciolos, en la interaccion BAP - 2,4-D, en tanto que en la misma interaccion los brotes fueron formados mayormente en hojas. Es posible asumir que tanto en este estudio como en el trabajo de Balbuena et ai, (2009) la aplicacion de auxinas - citocininas resulto esencial para inducir respuestas morfogenicas en P solmsianum, en especial BAP para la induccion de brotes, aunque este regulador de crecimiento no resulto esencial para otras especies de Piper (Mathews y Rao, 1984; Philip et al., 1992; Aminuddin-Johri et al., 1993; Kelkar et al, 1996). Por otro lado, en P solmsianum la induccion de brotes fue a lo largo y en los extremos del peciolo (Balbuena et al., 2009) y en P longum en la region proximal de las hojas (Soniya y Das, 2002).

En un experimento adicional, la organogenesis directa fue inducida en explantes de hojas colectadas de plantas en crecimiento activo en condiciones de invernadero. De las tres especies ensayadas, P regnellii mostro una mayor totipotencia puesto que los brotes fueron inducidos en los tres tratamientos de BAP ensayados, aunque un mayor porcentaje lo fue en el tratamiento BAP 2,0 mg [L.sup.-1]. En ese mismo tratamiento, tambien fue inducida la formacion de brotes en P cernuum, en cambio en P aduncum no hubo respuesta morfogenica en ninguno de los tratamientos ensayados (tabla 5). El caso de P regnellii resulto particularmente significativo, puesto que es una especie donde se observo escasa formacion de frutos y los pocos colectados no presentaron semillas viables. En trabajos pioneros realizados en P betle, P longum y P nigrum (Bhat et al, 1995), los cultivos fueron iniciados con segmentos nodales obtenidos de plantas en crecimiento activo en condiciones de invernadero, pero los explantes (hojas, peciolos, entrenudos y raices) utilizados en los cultivos posteriores (induccion de callos y organogenesis) se originaron de las plantulas micropropagadas y no de explantes obtenidos directamente de plantas de invernadero. Al igual que en los estudios de Bhat et al, (1995), la tasa de contaminacion observada en este estudio fue superior a 90%.

Conservacion de germoplasma

En un informe elaborado por el International Plant Genetic Resources Institute (IPGRI, ex IBPGR) se aclaro el marco conceptual basico de la conservacion in vitro, se identificaron las areas criticas de investigacion y las especies que requerian atencion prioritaria para este proposito (IBPGR, 1983). En tal sentido, fueron incluidas en esta relacion las especies de propagacion vegetativa y las de propagacion sexual con semilla recalcitrante o plantas "dificiles" (Withers y Williams, 1985), como es el caso de las especies de Piper. En las condiciones de conservacion por "limitacion del crecimiento a tasas minimas", el lapso de mantenimiento del cultivo fue de 12 a 18 meses mostrando una viabilidad de 100% cuando los explantes fueron transferidos a medio de cultivo fresco, en tanto que en condiciones de irradiancia normal (70 - 80 Limol m-2 s-1) el lapso de mantenimiento del cultivo fue de 6 - 10 meses.

La metodologia del cultivo in vitro ha sido aceptada por diversos paises como uno de los medios mas seguros para recibir el material vegetativo (Roca et al., 1991). A partir de este trabajo, se realizo el intercambio internacional entre el Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Recursos Geneticos de la Facultad de Ciencias Biologicas de la UNPRG-Lambayeque, el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del Instituto de Quimica de la USP-Sao Paulo y el Laboratorio de Micropropagacion Vegetal de la UNL-Loja de germoplasma in vitro (tabla 6). Para lograr esto, cinco dias antes de la transferencia las plantulas se establecieron en condiciones de 10 30 Limol m-2 s-1 de irradiancia para minimizar el efecto del estres luminico que significa el permanecer 24 - 72 horas en absoluta oscuridad. Este mecanismo de intercambio de material genetico permite minimizar la transferencia de plagas de insectos, acaros, nematodes y enfermedades causadas por bacterias y hongos, aunque no por virus y relacionados. Una vez recibido en el laboratorio de destino, las plantulas se subcultivaron en medio de cultivo de la misma formulacion, obteniendo una tasa de supervivencia del 100%.

Conclusiones

Este trabajo describe un protocolo de germinacion de semillas in vitro, propagacion clonal, a partir de apices caulinares y segmentos nodales, y organogenesis directa de varias especies de Piper, a partir de diversos explantes, para la induccion de brotes organogenicos.

Estos resultados son importantes, ya que permiten la conservacion ex situ del material genetico, debido a la recalcitrancia de las semillas, y el intercambio de germoplasma minimizando el riesgo de transferir plagas y enfermedades. Ademas, pueden apoyar una estrategia de domesticacion, multiplicacion y aclimatacion a gran escala de las especies en riesgo, que permita establecerlas en su ambiente natural e iniciar trabajos que conlleven al establecimiento de suspensiones celulares con el proposito de inducir la biosintesis de diversos metabolitos secundarios. De esta forma, se estaria contribuyendo con la conservacion de la diversidad de especies de Piper de Brasil, Ecuador y Peru, y la preservacion del acervo etnobotanico de las poblaciones que conforman ampliamente el sector rural de estos paises.

Agradecimientos

G.E. Delgado agradece a la Fundacao do Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP) por la beca de Pos-doutorado en el Instituto de Quimica de la Universidad de Sao Paulo, Brasil.

Recibido: mayo 15 de 2012

Aprobado: noviembre 21 de 2012

Bibliografia

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Guillermo E. Delgado-Paredes *, Massuo J. Kato **, Nancy Vasquez-Duenas ***, Julia Minchala-Patino ****, Consuelo Rojas-Idrogo *****

* Ph.D. Facultad de Ciencias Biologicas, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, Ciudad Universitaria, Juan XXIII 391, Lambayeque, Peru. guidelg2001@yahoo.es

** Ph.D. Instituto de Quimica, Universidade de Sao Paulo, Av. Prof. Lineu Prestes, 748 - Bloco 11T, 05508-900, Sao Paulo, Brasil. majokato@iq.usp.br

*** Biologa. Facultad de Ciencias Biologicas, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, Ciudad Universitaria, Juan XXIII 391, Lambayeque, Peru. dremys74@hotmail.com

**** Ing. Agr. Laboratorio de Micropropagacion Vegetal, Area Agropecuaria y de Recursos Naturales Renovables, Universidad Nacional de Loja, Ecuador. jminchala@gmail.com

***** M.Sc. Facultad de Ciencias Biologicas, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, Ciudad Universitaria, Juan XXIII 391, Lambayeque, Peru. crojasi2001@yahoo.es
Tabla 1. Especies de Piper colectadas en Peru, Brasil y
Ecuador, utilizadas en diversos procesos de cultivo de
tejidos in vitro.

No Esp.           Especie            No. Colecta (c)

1         Piper aduncum L.           LCT/UNPRG-083
          P. aduncum L.              IQ/USP-026
2         (a) P. aequale Vahl.       IQ/USP-32
3         (a) P. amalago L.          LMV/UNL-015
          P. amalago L.              LCT/UNPRG-062
4         P. arboreum Aublet         IQ/USP-036
5         P. cernuum Vell.           IQ/USP-045
          P. cernuum Vell.           LCT/UNPRG-063
6         P. crassinervium Kunth     IQ/USP-042
7         P. flavoviride C. DC.      IQ/USP-34
8         P. gaudichaudianum Kunth   IQ/USP-003
9         P. hispidum Sw.            IQ/USP-040
10        P. marginatum Jacq.        IQ/USP-052
          P. marginatum Jacq.        LCT/UNPRG-071
11        P. mohomoho C. DC.         LCT/UNPRG-084
12        P. permucronatum Yuncker   IQ/USP-015
13        (b) P regnellii (Miq.)     IQ/USP-006
          C. DC.
14        P. solmsianum (Kunth)      IQ/USP-047
          Yuncker
15        P. tuberculatum Jacq.      LCT/UNPRG-036
16        P. umbellatum L.           IQ/USP-008
          P. umbellatum L.           LCT/UNPRG-064
17        P. variegatum              LCT/UNPRG-070
          (Ruiz & Pav.) Pers.
18        Piper sp. 1                IQ/USP-063

19        Piper sp. 2                IQ/USP-054

No Esp.           Especie                     Procedencia

1         Piper aduncum L.           Catache, Santa Cruz
                                     (Cajamarca/Peru)
          P. aduncum L.              Araraquara (Sao Paulo/Brasil)
2         (a) P. aequale Vahl.       Serra do Mar, Picinguaba
                                     (Sao Paulo/Brasil)
3         (a) P. amalago L.          La Argelia (Loja/Ecuador)
          P. amalago L.              La Palma, Nunajalca, Bagua
                                     (Amazonas/Peru
4         P. arboreum Aublet         Serra do Mar, Picinguaba
                                     (Sao Paulo/Brasil
5         P. cernuum Vell.           Parque Estadual de Ubatuba
                                     (Sao Paulo/Brasil)
          P. cernuum Vell.           La Palma, Nunajalca, Bagua
                                     (Amazonas/Peru
6         P. crassinervium Kunth     Praia do Iporanga
                                     (Sao Paulo/Brasil)
7         P. flavoviride C. DC.      Serra do Mar, Picinguaba
                                     (Sao Paulo/Brasil
8         P. gaudichaudianum Kunth   Jardim Botanico da USP
                                     ((Sao Paulo/Brasil)
9         P. hispidum Sw.            Serra do Mar, Picinguaba
                                     (Sao Paulo/Brasil
10        P. marginatum Jacq.        Manaus (Amazonas, Brasil)
          P. marginatum Jacq.        Belen, Iquitos (Loreto, Peru)
11        P. mohomoho C. DC.         Catache, Santa Cruz
                                     (Cajamarca/Peru)
12        P. permucronatum Yuncker   Araraquara (Sao Paulo/Brasil)
13        (b) P regnellii (Miq.)     IQ/USP (Sao Paulo/Brasil)
          C. DC.
14        P. solmsianum (Kunth)      Parque Estadual de Ubatuba
          Yuncker                    (Sao Paulo/Brasil)
15        P. tuberculatum Jacq.      El Cumbil, Chota
                                     (Cajamarca/Peru)
16        P. umbellatum L.           IQ/USP (Sao Paulo/Brasil)
          P. umbellatum L.           La Palma, Nunajalca, Bagua
                                     (Amazonas/Peru)
17        P. variegatum              Belen, Iquitos (Loreto, Peru)
          (Ruiz & Pav.) Pers.
18        Piper sp. 1                Vale do Ouro (Sao
                                     Paulo/Brasil)
19        Piper sp. 2                Manaus (Amazonas, Brasil)

No Esp.           Especie            Altitud    Fecha de
                                     (msnm)     Colecta

1         Piper aduncum L.            1 355    17-07-2005
          P. aduncum L.                 705    05-02-1999
2         (a) P. aequale Vahl.          150    15-03-1999
3         (a) P. amalago L.           2 200    15-03-2012
          P. amalago L.               1 400    20-04-2002
4         P. arboreum Aublet            150    15-03-1999
5         P. cernuum Vell.               55    12-04-1999
          P. cernuum Vell.            1 400    21-04-2002
6         P. crassinervium Kunth         10    18-03-1999
7         P. flavoviride C. DC.         150    15-03-1999
8         P. gaudichaudianum Kunth      860    18-10-1998
9         P. hispidum Sw.               150    15-03-1999
10        P. marginatum Jacq.            72    23-05-1999
          P. marginatum Jacq.           104    20-06-2002
11        P. mohomoho C. DC.          1 355    17-07-2005
12        P. permucronatum Yuncker      705    15-12-1998
13        (b) P regnellii (Miq.)        860    20-10-1998
          C. DC.
14        P. solmsianum (Kunth)          55    12-04-1999
          Yuncker
15        P. tuberculatum Jacq.         668    09-05-2000
16        P. umbellatum L.              860    20-10-1998
          P. umbellatum L.            1 400    21-04-2002
17        P. variegatum                 104    20-06-2002
          (Ruiz & Pav.) Pers.
18        Piper sp. 1                   730    05-06-1999
19        Piper sp. 2                    72    23-05-1999

(a) Especie con menos de 25 semillas colectadas y 3-5 germinadas;

(b) Especie con menos de 25 semillas colectadas y ninguna germinada;

(c) LCT/UNPRG, Laboratorio de Cultivo de Tejidos/Universidad
Nacional Pedro Ruiz Gallo, IQ/USP, Instituto de Quimica/
Universidade de Sao Paulo, LMV/UNL, Laboratorio de Micropropagacion
Vegetal/Universidad Nacional de Loja.

Tabla 2. Germinacion de semillas in vitro de varias especies
de Piper.

Especie                       Tiempo de sembradas      Germinacion
                             despues de la colecta

                                                        Semillas
                                                     cultivadas (No)

Piper aduncum                        01 s                  50
P. aduncum                           07 m                  166
P. arboreum                          01 s                  175
P. cernuum                           01 s                  50
P. cernuum                           03 m                  50
P. crassinervium                     01 s                  74
P. flavoviride C. DC.                03 s                  174
P. flavoviride C. DC.                07 m                  175
P. gaudichaudianum Kunth             01 s                  155
P. hispidum Sw.                      01 m                  112
P. marginatum                        01 m                  94
P. mohomoho C. DC.                   01 s                  110
P. permucronatum                     01 s                  57
P. solmsianum                        01 s                  270
P. solmsianum                        03 m                  50
P. solmsianum                        04 m                  50
P. tuberculatum                      01 m                  126
P. umbellatum                        01 s                  290
P. variegatum Pers.                  01 m                  68
Piper sp. 1 (Vale do Ouro)           01 m                  35
Piper sp. 2 (Amazonas)               01 m                  28

Especie                                  Germinacion

                                Semillas        Porcentaje de
                             germinadas (No)   germinacion (%)

Piper aduncum                      10               20,0
P. aduncum                         16                9,6
P. arboreum                        164              93,7
P. cernuum                         13               26,0
P. cernuum                          0                0,0
P. crassinervium                   50               67,6
P. flavoviride C. DC.              76               43,7
P. flavoviride C. DC.              23               13,2
P. gaudichaudianum Kunth           113              72,9
P. hispidum Sw.                    92               82,1
P. marginatum                      26               27,6
P. mohomoho C. DC.                  0                0,0
P. permucronatum                   53               92,9
P. solmsianum                      265              98,1
P. solmsianum                       0                0,0
P. solmsianum                       0                0,0
P. tuberculatum                    45               35,7
P. umbellatum                      287              98,9
P. variegatum Pers.                19               27,9
Piper sp. 1 (Vale do Ouro)         15               42,8
Piper sp. 2 (Amazonas)              0                0,0

MS, vitaminas (m-inositol 100 mg [L.sup.-1] y tiamina H.Cl 1
mg [L.sup.-1]), sacarosa 3% y agar 0,8% s, semana; m, mes

Tabla 3. Elongacion de brotes y numero de nudos y brotes
formados, a partir de apices caulinares y segmentos
nodales de varias especies de Piper.

Tiempo de                        P. aduncum
cultivo (meses)

                    Elongac. (cm)         Nudos (No)

                   Media [+ o -] DS    Media [+ o -] DS

1                 3,8 [+ o -] 0,4 b    3,5 [+ o -] 0,2 b
2                 5,0 [+ o -] 0,7 b    3,7 [+ o -] 0,3 b
3                 16,0 [+ o -] 0,9 a   7,6 [+ o -] 0,4 a
4
5

Tiempo de                        P. cernuum
cultivo (meses)

                    Elongac. (cm)        Nudos (No)

                  Media [+ o -] DS    Media [+ o -] DS

1                 0,5 [+ o -] 0,1 b   1,1 [+ o -] 0,2 b
2
3                 2,4 [+ o -] 0,1 a   1,9 [+ o -] 0,2 b
4
5                 3,8 [+ o -] 0,1 a   4,9 [+ o -] 0,2 a

Tiempo de                       P. regnellii
cultivo (meses)

                    Elongac. (cm)        Nudos (No)

                  Media [+ o -] DS    Media [+ o -] DS

1                 0,6 [+ o -] 0,1 c   1,2 [+ o -] 0,2 c
2
3                 3,2 [+ o -] 0,5 b   4,4 [+ o -] 0,5 b
4
5                 8,4 [+ o -] 0,8 a   7,4 [+ o -] 0,6 a

Tiempo de                     P. solmsianum
cultivo (meses)

                    Elongac. (cm)        Nudos (No)

                  Media [+ o -] DS    Media [+ o -] DS

1                 1,5 [+ o -] 0,7 c   2,4 [+ o -] 0,3 c
2
3                 3,6 [+ o -] 0,6 b   4,1 [+ o -] 0,2 b
4
5                 4,4 [+ o -] 1,8 a   6,0 [+ o -] 0,7 a

MS, vitaminas (m-inositol 100 mg [L.sup.-1] y tiamina H.Cl 1
mg [L.sup.-1]), sacarosa 3%, AIA 0,02 mg [L.sup.-1], AG3 0,02
mg [L.sup.-1] y agar 0,8%.

Medias con letras comunes no difieren estadisticamente, segun
Prueba de Rangos Multiples de Duncan para p < 0,05.

Tabla 4. Efecto de varios reguladores de crecimiento
en la organogenesis directa en diversos tipos de
explantes de varias especies de Piper, despues de 60
dias de cultivo (a,b,c,d).

Especie (e)              (mg [L.sup.-1])

              ANA    BAP    [AG.sub.3]   KIN   TDZ

P. adu.                                        0,05
                                               0,5
P. cer.              2,0
                                         2,0
                                               0.05
                                               0,5
                                               1,0
                                               2,0
P. crs.                                        0,05
                                               0,5
P. adu.       0,02   0,05      0,02
              0,02   0,1       0,02
P. crs.       0,5
              0,5    1,0
              0,5    2,0
                     1,0
                     2,0
P. sol.                                        0,5
                     0,5
              0,01   1,0

Especie (e)             Explantes

                   Hoja           Peciolo

P. adu.       +++/B * (16,5)         ++
              +++/B * (32,8)   ++/B * (70,4)
P. cer.        B ** (50,0)          -
                B * (50,0)       B * (16,0)
                   -/R              --
                B * (42,8)       B * (25,0)
                B * (50,0)       B * (43,0)
                B * (75,0)       B * (65,0)
P. crs.            -/R               -
              -/B *** (65,7)         -
P. adu.       ++/B * (50,0)
               +/B * (24,0)
P. crs.            -                R
              B *** (100,0)     B ** (100,0)
              B **** (100,0)   B **** (100,0)
               B ** (35,0)      B * (100,0)
               B ** (35,0)      B * (100,0)
P. sol.        B * (100,0)
               B * (100,0)
               B * (100,0)

Especie (e)             Explantes

                Entrenudo          Raiz

P. adu.
P. cer.
P. crs.
P. adu.       ++/B * (66,5)
              ++/B * (55,0)
P. crs.                             -
                              B **** (100,0)
                              B **** (100,0)
                              B *** (100,0)
                              B *** (100,0)
P. sol.        B * (100,0)
               B * (100,0)
               B * (100,0)

(a) MS, vitaminas (m-inositol 100 mg [L.sup.-1] y tiamina
H.Cl 1 mg [L.sup.-1]), sacarosa 3% y agar 0,8%

(b) -, sin formacion de callo; +, callo cubre 1/3 del
explante; ++, callo cubre 1/2 a 2/3 del explante; +++,
callo cubre todo el explante; B, brotes; R, raices.

(c) Numero entre parentesis indica el procentaje de
explantes con brotes

(d) * 1-10, ** 11-30, *** 31-50 y **** mas de 50 brotes
por explante

(e) P. adu. = Piper aduncum; P. cer. = P. cernuum; P. crs.
= P. crassinervium; P. sol. = P. solmsianum.

Tabla 5. Organogenesis directa en hojas de plantas silvestres
de Piper cernuum y P. regnellii, despues de 60 dias de
cultivo (a,b,c).

BAP (mg/[L.sup.-1])             Induccion de brotes (%)

                      P. aduncum   P. cernuum   P. regnellii

0,5                       -            -        B ** (15,4)
1,0                       -            -         B * (7,1)
2,0                       -        B * (10,0)   B ** (23,0)

(a) MS, vitaminas (m-inositol 100 mg [L.sup.-1] y tiamina H.Cl
1 mg [L.sup.-1]), sacarosa 3% y agar 0,8%

(b) Numero entre parentesis indica el procentaje de explantes
con brotes; B, brotes

(c) * 1-10 y ** 10-30 brotes por explante

Tabla 6. Intercambio internacional de germoplasma
de Piperaceaea.

Especie            Introducida (de)   Transferida (a)

P. aduncum              IN/USP              USP
P. amalago            IN/USP/UNL
P. cernuum              IN/USP              USP
P. crassinervium         USP
P. hispidum             IN/USP              USP
P. permucronatum         USP
P. regnellii             USP
P. solmsianum            USP                UNL
P. tuberculatum         IN/USP            USP/UNL
P. umbellatum           IN/USP              USP
P. variegatum             IN

(a) IN, introduccion nativa (areas naturales del Peru); USP, Instituto
de Quimica, Universidad de Sao Paulo, Brasil; UNL, Laboratorio
de Micropropagacion Vegetal, Universidad Nacional de Loja,
Ecuador.

MS, vitaminas (m-inositol 100 mg [L.sup.-1] y tiamina H.Cl 1 mg
[L.sup.-1]), sacarosa 3%, AIA 0,02 mg [L.sup.-1], AG3 0,02 mg
[L.sup.-1] y agar 0,8%.
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Title Annotation:ARTICULO DE INVESTIGACION
Author:Delgado-Paredes, Guillermo E.; Kato, Massuo J.; Vasquez-Duenas, Nancy; Minchala-Patino, Julia; Rojas
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Dec 1, 2012
Words:8541
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