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Cryopreservation of boar semen: progress and perspectives/Criopreservacao de semen suino: avancos tecnologicos e perspectivas/Criopreservacion de semen de verraco: avances y perspectivas tecnologicas.

Introducao

A criopreservacao de semen e uma biotecnica reprodutiva consolidada e difundida desde 1975(19). Contudo, com relacao a especie suina, ainda existem muitas dificuldades no processo de criopreservacao do semen, devido a notoria sensibilidade dos espermatozoides ao processo de congelamento/descongelamento.

Melhorar a fertilidade do semen congelado/descongelado tem sido um dos objetivos da comunidade cientifica e da industria suina, pois a utilizacao do semen suino criopreservado e altamente desejavel, principalmente para a internacionalizacao de mercados da especie, para a manutencao de germoplasma, preservacao e dispersao da diversidade genetica, e o controle da transmissao de patogenos, impedindo a disseminacao de patologias, como a Sindrome Multissistemica Pos-Desmame e a Sindrome Respiratoria.

Contudo, esta tecnologia ainda nao e suficiente para reproduzir indices de fertilidade satisfatorios apos a inseminacao artificial (IA) quando comparada ao semen resfriado (27), devido a perda da capacidade fertilizante e da nao sobrevida de 40-50% dos espermatozoides durante o processo de criopreservacao. Fato que resulta em uma diminuicao das taxas de paricao, em cerca de 20-30% e do tamanho da leitegada de 2-3 leitoes (40).

A biotecnica de criopreservacao compreende todo o processo de manipulacao do ejaculado, correspondendo a diluicao, resfriamento, crioprotecao, congelamento, armazenamento a--196[degrees]C e descongelamento (20). Sendo dependente das interacoes de fatores internos (caracteristicas inerentes dos espermatozoides e das diferencas entre machos e ejaculados) e fatores externos (composicao de diluentes, tipo e concentracao de agentes crioprotetores, taxas de diluicao e de refrigeracao, do congelamento e do descongelamento). A relacao destes fatores e capaz de influenciar a capacidade do espermatozoide em sobreviver e manter suas qualidades fertilizantes ao final do processo e, portanto, determinante para o sucesso da tecnica.

Desta forma, a presente revisao, tem como objetivo ressaltar alguns fatores limitantes do processo de criopreservacao de semen suino, apontando as adaptacoes realizadas ate o presente momento nas distintas etapas do processo e suas perspectivas.

Caracteristicas da celula espermatica suina

De modo geral, o processo de criopreservacao causa inumeros danos a celula espermatica, reduzindo a proporcao de espermatozoides viaveis, bem como sua capacidade funcional. As lesoes ocasionadas tem sido atribuidas a variacao de temperatura--resultando na formacao de cristais de gelo intracelulares e extracelulares, danos oxidativos, alteracoes de membrana e DNA-alem da toxidade de crioprotetores e estresse osmotico (49).

Em nivel celular, os danos ocasionados levam ao aumento da permeabilidade da membrana plasmatica, inibicao da atividade enzimatica e alteracao do balanco bioenergetico celular (15), contudo cada especies possui um potencial de crioprotecao distinto, devido a caracteristicas intrinsecas de suas celulas (29).

Um dos grandes desafios para a criopreservacao de semen suino sao as particularidades de sua celula espermatica quando comparada com a de outras especies. O espermatozoide suino possui uma menor porcentagem de moleculas de colesterol em sua membrana plasmatica, distribuidas de forma assimetrica, com maior disposicao na monocamada interna (49). Essas diferencas estruturais contribuem para a grande sensibilidade ao choque termico, caracterizado por uma reducao da motilidade e danos funcionais de membrana e acrossoma (22, 45).

Outra peculiaridade e a grande concentracao de acidos graxos insaturados nos fosfolipideos presentes na membrana plasmatica, com poucas ligacoes duplas do tipo cis (10), tornando esta celula suscetivel a peroxidacao lipidica, devido ao estresse oxidativo produzido pelas especies reativas de oxigenio (EROs). A producao excessiva e desequilibrada EROs resulta em numerosos eventos indesejaveis como danos da membrana plasmatica, inibicao da respiracao e vazamento de enzimas intracelulares (47). Este fato ainda e agravado pela baixa capacidade antioxidante do plasma seminal suino (7).

Alem disso, existe uma grande variacao entre racas e, inclusive, entre ejaculados de um mesmo individuo (11,30). Isto demonstra uma possivel relacao genetica no processo de criopreservacao, capaz de influenciar em uma expressao proteica ou de lipideos da composicao da membrana diferentes, ou ainda em alteracoes na composicao do plasma seminal ou funcionalidade das glandulas acessorias (23). Contudo essas variabilidades sao determinadas por varios fatores, alguns desconhecidos, e outros ainda pouco estudados.

Desta forma, estudos que visem compreender os processos bioquimicos e fisiologicos associados com a estrutura e atividade fisiologica do espermatozoide, principalmente as relacionadas ao processo de crioprotecao, sao cruciais para agregar conhecimento e direcionar estudos que aperfeicoem esta biotecnica.

Manipulacoes no semen para congelamento e descongelamento

Como citado anteriormente, a tolerancia ao congelamento e influenciado por caracteristicas individuais do macho e ejaculado, ou ate mesmo entre as porcoes coletadas de um mesmo ejaculado (44).

Os primeiros 10mL do ejaculado sao considerados como "esperma rico", apresentando uma maior tolerancia a criopreservacao, pois se acredita que esta porcao possui uma quantidade substancial de fluido da cauda do epididimo, incluindo proteinas relevantes como a prostaglandina sintase, com peso molecular de 10,56 kDa (46) e outras com 18, 19, 44, 65, 80 e 100 kDa (10:1, relacionadas com melhores resultados na criopreservacao, devendo-se priorizar esta porcao para o processo.

Apos a coleta, uma das etapas primordiais para o congelamento, e a remocao do plasma seminal, geralmente utilizada para melhorar a motilidade do esperma congelado/descongelado e a fertilidade in vitro. Esta etapa e recomendada principalmente para machos considerados maus congeladores (36). Uma pre-incubacao com o plasma seminal ainda e bastante controversa. Alguns autores indicam uma pre-incubacao de pelo menos 24 h a 15[degrees]C de todo ejaculado, visto que este tempo de estabilizacao melhora sua congelabilidade, enquanto, ha relatos do efeito prejudicial do plasma seminal, especialmente em espermatozoides armazenados por pelo menos 6h antes da criopreservacao (35).

Para a remocao do plasma seminal e concentracao dos espermatozoides de modo que eles possam ser rediluidos com extensores de congelamento, e necessario o uso de centrifugacoes, sendo o tempo de centrifugacao considerado mais critico do que a forca G aplicada para a inducao de danos espermaticos (39). Carvajal et al(9) testou diferentes forcas e tempo de centrifugacao, analisando a recuperacao espermatica com acrossoma integros e sobrevida celular, indicando um curto prazo de centrifugacao com uma forca centripeta relativamente alta (2400xg durante 3 min) para a minimizacao de danos apos criopreservacao.

Uma alternativa para o processo de centrifugacao seria a realizacao de dialise, removendo componentes de baixo peso molecular, como ions livres e metabolitos, que poderiam ter um efeito negativo na funcao do esperma, mas sem perder proteinas ou componentes de interacao presentes no plasma seminal capazes de promover uma melhor sustentacao a criopreservacao (16), contudo a dialise ainda e pouco utilizada.

Apos a remocao do plasma seminal, o pellet de espermatozoides concentrados devido a centrifugacao e resuspenso em diluentes de resfriamento e congelamento, ajustando desta forma a concentracao de celulas espermaticas de 106 a 109 espermatozoides/mL, alem de fornecer nutrientes para a sustentacao do metabolismo celular e componentes que irao auxiliar na crioprotecao.

Devido aos problemas inerentes do processo, a criopreservacao de semen suino e realizada em duas etapas, primeiramente e realizado um resfriamento, considerado um dos principais pontos, pois a faixa critica de temperatura durante o processo de resfriamento varia de +15 a 5[degrees]C, a qual ocorre a solidificacao dos lipidios de membrana. Nesta etapa e indicado um resfriamento lento (em torno de 4 a 30[degrees]C/min) (76) ate a temperatura de 5[degrees]C, na qual e adicionado os crioprotetores internos e realizado o congelamento.

Com relacao a velocidade de congelamento, com objetivo de diminuir os danos toxicos dos diluentes internos utilizados, os sistemas convencionais preveem curvas rapidas de congelamento, sendo o recomendado ser -30 [degrees]C/min e a velocidade de descongelamento de 1200[degrees]C/ min (27). O envase para criopreservacao deve ser efetuado em palhetas de 0,5 mL ou menores, pois os resultados sao superiores a pellets, antiga forma de congelamento (27).

Apos o descongelamento, Larsson et al. (30) demonstrou que a adicao de 10% de plasma seminal na solucao de descongelamento e uma alternativa interessante, pois restauraria a competencia da fertilizacao in vivo. Estando relacionado a capacidade do plasma seminal em regular diretamente funcoes uterinas, como a supressao de celulas do sistema imunologico, levando a diminuicao da inflamacao uterina (41,42)

Neste ambito, fica evidente que modificacoes em protocolos de congelamento/descongelamento sao necessarias para trazer novas perspectivas, tal como o uso de recipientes criogenicos, que estao sendo desenvolvidos com o objetivo de uniformizar o resfriamento e descongelamento, alcancando resultados similares aos obtidos com o congelamento em palhetas de 0,5 mL em qualidade seminal, mas com taxas de paricao e total de leitoes vivos similares com as IA utilizando semen resfriado (14).

Diluentes para resfriamento e congelamento

Nas duas etapas dos protocolos de rotina para criopreservacao de semen suino-resfriamento e congelamento, e utilizando a gema de ovo como diluente basico. Primeiramente o semen e resfriado em diluente a base de gema de ovo ate a temperatura de 5[degrees]C, e posteriormente dilui-se com um extensor contendo crioprotetor interno. Essa metodologia e aplicada com o objetivo de diminuir o tempo de exposicao da celula espermatica ao crioprotetor interno, reduzindo a toxidade deste (34).

Os ingredientes basicos para a confeccao dos diluentes sao os mesmos que os utilizados ha 35 anos, incluindo acucares, glicerol e a gema de ovo (2). Os acucares sao substancias de grande importancia na criopreservacao, pois alem de atuarem como substrato energetico para as celulas (33), criam uma pressao osmotica externa, induzindo a desidratacao celular e diminuindo a formacao de gelo intracelular, preservando a membrana plasmatica (17).

A lactose e o acucar mais utilizado para criopreservacao de semen suino, devido aos bons resultados relatados (13,43). No entanto, outros estudos mostram que dissacarideos de forma geral, que incorporam glicose na sua composicao (lactose, sacarose, trealose e melobiose) tem efeito crioprotetor maior do que monossacarideos (glucose e frutose) (13,33), evidenciando que esses tipos de acucares adaptam-se melhor com a celula espermatica suina, mantendo a integridade estrutural e propriedades de permeabilidade das bicamadas lipidicas.

Com relacao ao crioprotetor interno, ou seja, permeavel a membrana plasmatica, o glicerol e o mais utilizado, desidratando e reduzindo o ponto crioscopio do interior das celulas, dificultando a formacao de cristais de gelo intracelular (49). O glicerol e utilizado em concentracoes baixas (inferiores a 4%), pois apresenta uma potencial acao de toxicidade ao ser metabolizado como fonte de acucar pela celula, sendo responsavel pela producao de metilglioxal, por exemplo--mediador da ativacao de fosfolipases e proteases provocando irreversiveis danos na celula (1).

Contudo, Buhr et al. (8) mostraram que nenhuma concentracao de glicerol maximiza os parametros funcionais do esperma criopreservado. Desta forma busca-se encontrar crioprotetores para a substituicao do glicerol, a exemplo disso, a trealose (25) e a dimetilacetamida (5) mostram resultados promissores, sugerindo desta forma sua utilizacao.

A gema de ovo e o crioprotetor externo mais utilizado em protocolos de congelamento de forma geral, fornecendo protecao contra choque frio para os espermatozoides especialmente abaixo de 15[degrees]C (51), devido a sua constituicao de lipoproteinas de baixas densidades capazes de associar-se a membrana plasmatica, diminuindo a perda de fosfolipidios e colesterol (3). O seu efeito protetor pode ser melhorado pela adicao de Orvus Es Past (OEP), tambem conhecido como Stm Equex (Nova Chemical, Scituate, MA), detergente sintetico baseado em sodio e laurilsulfato de trietanolamina. Tem sido sugerido que a OEP da protecao, pois modifica os constituintes da gema de ovo no diluente (38).

No entanto, por ser a gema de ovo produto de origem animal, e propensa a uma variacao em sua composicao dependente do animal, origem e nutricao (24). Muitos estudos buscam o preparo de meios quimicamente definidos para sua substituicao, a exemplo das lecitinas de soja (21), trealose e glicina (48) ou ainda da propria lipoproteina de baixa densidade purificada (26), contudo nenhum dos materiais testados demonstrou melhores resultados do que o obtido com a gema de ovo.

Antioxidantes

A celula espermatica suina esta propensa a acao de agentes oxidantes devido a sua estrutura rica em acidos graxos poliinsaturados. A geracao excessiva dessas substancias acarreta em mudancas nas caracteristicas do esperma e causa danos proteicos e estruturais (12). Devido ao baixo poder antioxidante do plasma seminal suino torna interessante compor diluentes utilizando antioxidantes externos (52).

Bilodeau et al.(6) sugeriram que um fator importante para a sobrevivencia e funcionalidade da celula espermatica, durante todo processo de congelamento e descongelamento e o balanco entre a producao de EROs e sua desintoxicacao, fato que exerce influencia direta sobre a fertilidade.

Assim, nos ultimos anos, a investigacao sobre a aplicacao de antioxidantes para melhorar a criopreservacao do esperma suino e melhorar a qualidade pos-resfriamento e pos-descongelamento tem sido desenvolvida. Dentre os antioxidantes ja relatados, podemos citar alguns compostos como a glutationa, acido ascorbico e L-cisteina.

E tambem o uso de antioxidantes naturais, dada a sinergia dos compostos ativos presentes--tais como o acido rosmainico, flavonoides e polifenois, extrato de Rhodiola (planta da familia Crassulaceae encontrada em regioes frias) e de Alecrim (planta da familia Baccharis). Essas substancias foram capazes de incrementar a qualidade espermatica pos-descongelamento, como podem ser vistos na tabela 1.

Conclusoes e perspectivas

Devido aos baixos indices de concepcao, resultantes de inseminacoes artificiais com doses criopreservadas, o uso do semen suino congelado ainda nao e uma realidade comercialmente. Mas os recentes avancos acerca de conhecimentos bioquimicos e fisiologicos da celula espermatica tem possibilitado adaptacoes em diluentes e a adicao de adjuvantes como antioxidantes de forma promissora. Desse modo, acredita-se que essa tecnologia se tornara comercialmente viavel em pouco tempo, aumentando a produtividade do rebanho comercial, auxiliando na manutencao de biosseguranca e incentivando o intercambio internacional de material genetico.

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Taina Figueiredo Cardoso [1] *, Biot.; Estela Fernandes e Silva [2], Biot.; Carine Dahl Corcini [3], MV Dr.

* Autor para correspondencia: Taina Figueiredo Cardoso. Av Italia Km.8 Carreiros, Rio Grande/Rs. E-mail: tainafcardoso@gmail.com

[1] Programa de Pos-Graduacao em Ciencias Fisiologicas: Fisiologia Animal Comparada. Universidade Federal do Rio Grande.

[2] Programa de Pos-Graduacao em Ciencias Fisiologicas: Fisiologia Animal Comparada. Universidade Federal do Rio Grande.

[3] Faculdade de Vetermaria,Universidade Federal de Pelotas (UFPel).

(Recibido: 9 de septiembre, 2013; aceptado: 18 de octubre, 2013)
Tabla 1. Antioxidantes utilizados na cripreservacao de semen suinos e
seu incremento na qualidade espermatica

                        pos-descongelamento.
Substancia              Incremento              Autores

Glutationa reduzida     Aumento significativo   Gadea J. et al.(18)
                        na capacidade de
                        fertilizacao dos
                        espermatozoides
                        quando utilizada no
                        extensor de
                        descongelamento.

Extrato de Sacra        Aumento da              Zhao HW et al. (52)
rosea (Rhodiola)        concentracao de
                        glutationa, da
                        atividade
                        mitocondrial, e
                        diminuicao da
                        concentracao de
                        malondialdeido (MDA).

Extrato de Rosmarinus   Diminuicao na           Malo C et al. (31,32)
officinalis (Alecrim)   producao de MDA e
                        aumento na
                        viabilidade apos 2
                        horas de incubacao.
                        Eficaz no sistema de
                        fertilizacao in
                        vitro.

Vitamina E Trolox       Aumento na motilidade   Pena FJ et al. (37)
                        e elevacao da
                        atividade
                        mitocondrial.

L-cisteina              Aumento da motilidade   Kaeoket K et al.(25)
                        progressiva, na
                        viabilidade e na
                        integridade
                        acrosomal.
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Title Annotation:articulo en portugues
Author:Cardoso, Taina Figueiredo; e Silva, Estela Fernandes; Corcini, Carine Dahl
Publication:Revista CES Medicina Veterinaria y Zootecnia
Date:Jul 1, 2013
Words:3906
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