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Criopreservacion de embriones bovinos producidos in vitro.

CRYOPRESERVATION OF IN VITRO DERIVED EMBRYOS

INTRODUCCION

Durante los ultimos veinte anos, se ha observado que la produccion de embriones bovinos ha crecido de forma progresiva, en especial en el area de la produccion in vitro (PIV), lo que ha hecho que esta se convierta en una tecnica importante no solo en el ambito cientifico, academico, sino tambien en el comercial. Consecuentemente, esto ha generado la necesidad de criopreservar los excedentes de embriones de dicha produccion. Sin embargo, la criopreservacion de embriones producidos in vitro a traves de los metodos convencionales, no ha alcanzado tasas de supervivencia satisfactorias (Vajta 2000). Debido a sus caracteristicas fisicas, principalmente en la membrana donde el embrion in vitro presenta una mayor cantidad de lipidos que impiden su facil congelamiento, se ha optado por el empleo de metodos alternativos como la vitrificacion. Este metodo, con curvas de enfriamiento superiores a las de la congelacion convencional, permite la reduccion del tiempo de exposicion del embrion en los puntos criticos de temperatura, con lo cual se disminuyen los danos termicos y mecanicos causados durante la formacion de hielo, y se aumenta la viabilidad de los embriones posteriormente a su vitrificacion (Lazar et al. 2000; Vajta y Kuwayama 2006; Mucci et al. 2006). No obstante, es importante resaltar que a pesar del alcance conseguido con estas tecnicas hasta hoy, aun es necesario el desarrollo de nuevos metodos y la busqueda de nuevas perspectivas que optimicen la vitrificacion de embriones producidos in vitro. La presente revision pretende mostrar los avances en el area de la criobiologia, en especial en el metodo de vitrificacion, que constituye hoy en dia la principal alternativa para la criopreservacion tanto de oocitos como de embriones producidos.

Criopreservacion de embriones

Con el nacimiento del primer bovino producido in vitro por Brackett et al. (1982), la tecnica de fertilizacion in vitro comenzo a ser reconocida mundialmente; sin embargo, su estado del arte hacia que fuera una metodologia aun restringida al ambito experimental, ademas de que las condiciones de mercado en la decada de los ochenta y noventa restringian su aplicacion comercial (Viana y Camargo 2007). Asi mismo, la introduccion de la transferencia de embriones in vitro estimulo el aumento no solo de la produccion, sino tambien de la distribucion de este tipo de embriones. Sin embargo, en algunos paises se ha incrementado de forma cuantiosa el numero de embriones producidos, superando el numero de receptoras, creando asi la necesidad de criopreservar los embriones excedentes para su posterior comercializacion alrededor del mundo (Viana y Camargo 2007; Cutaia y Bo 2007).

Uno de los principios mas importantes de la criopreservacion de embriones es lograr su almacenamiento en condiciones de bajas temperaturas (-196[grados]C), intentando mantener su integridad a traves de la remocion del maximo volumen posible de agua antes de su congelamiento, con lo cual se evita la formacion de hielo (Seidel 1986). Dentro de los metodos mas importantes para la criopreservacion se encuentran el metodo de congelacion convencional y el de vitrificacion. El metodo de congelamiento fue el primero en ser introducido, y hoy es el mas utilizado comercialmente (Vajta 2000). Su curva de congelacion lenta permite mantener el equilibrio entre los factores que pueden causar dano celular, como la formacion de cristales de hielo, la fractura del embrion, el dano toxico y osmotico, asi como las alteraciones de las organelas intracelulares y del citoesqueleto (Vajta y Kuwayama 2006; Dobrinsky 1996; Vanderzwalmen et al. 2002). Durante este procedimiento, los embriones normalmente van a ser equilibrados dentro de bajas concentraciones de crioprotectores, en pajillas de inseminacion de 0,25 ml, con tasas de enfriamiento entre 0,3 y 1[grados]C/min, hasta alcanzar los -30 a -35[grados]C, para posteriormente poder ser sumergidos en el nitrogeno liquido. Por su parte, la vitrificacion es una metodologia definida como la gelificacion de un liquido, producida no por la cristalizacion, sino por una extrema elevacion de la viscosidad durante el enfriamiento, por lo cual esta es la unica tecnica de criopreservacion que permite la eliminacion total de la formacion de hielo, tanto en la celula, como en el medio que la rodea (Fahy et al. 1984). En la vitrificacion, la curva de enfriamiento es mas rapida ([aproximadamente igual a] 2500[grados]C/ min) y necesita de la presencia de crioprotectores mas concentrados, que permitan la formacion del llamado "estado vitreo", que disminuye los danos quimicos y mecanicos causados por el paso entre los puntos criticos de congelacion (Dobrinsky 1996; Martino et al. 1996). La formacion del estado vitreo evita tales danos, al promover la distribucion ionica del liquido e impedir la formacion de cristales de hielo (Rall y Fahy 1985; Arav 1992; Kasai 2002).

Vitrificacion frente a congelamiento

El congelamiento convencional tiene una ventaja comparativa frente a los otros metodos de criopreservacion, al ser una metodologia que permite la utilizacion de bajas concentraciones de crioprotectores y permite la transferencia directa de los embriones despues de la descongelacion (Volkel y Hu 1992). Sin embargo, su habilidad para prevenir la formacion de hielo intracelular aun es limitada, ademas, los resultados in vitro de la criopreservacion de embriones han sido variables (Hasler et al. 1995; Massip et al. 1995; Hochi et al. 1996; Kaidi et al. 2001) y menores en comparacion a los datos obtenidos en embriones in vivo (Alvarenga et al. 2007; Dinnyes y Nedambale 2009).

La razon por la cual existe esta variacion en la viabilidad de los embriones producidos in vitro, en comparacion con los producidos in vivo, es probablemente por las caracteristicas fisicas propias del primer tipo de embriones, que hacen que sean mas sensibles a bajas temperaturas (Dinnyes y Nedambale 2009; Rodrigues 1996; Vajta 1997). Entre dichas caracteristicas, se encuentran diferencias no solo morfologicas sino tambien fisiologicas, como: 1) el aumento en el numero de vacuolas (Shamsuddin et al. 1992), 2) mayor fragilidad de la zona pelucida (Duby et al. 1997), 3) menor compactacion embrionaria (Van Soom et al. 1992), 4) un menor numero de blastomeras, sobre todo en la masa celular interna (Iwasaki et al. 1990; Rizos et al. 2002), 5) alteraciones en la expresion genica (Niemann y Wrenzychi 2000; Lazzari et al. 2002; Rizos et al. 2003; Lonergan et al. 2003), 6) mayor tasa de apoptosis (Pomar et al. 2005) y 7) aumento en el alto contenido citoplasmatico de lipidos (Massip et al. 1995).

Por estas razones, y en especial la ultima, se ha considerado que el metodo de congelacion convencional genera unas tasas de viabilidad considerablemente disminuidas en este tipo de embriones (Pereira y Marques 2008). El aumento de los tiempos de exposicion, debido al descenso progresivo de la temperatura durante el congelamiento, permite que el embrion permanezca un tiempo mayor en la franja de temperatura termotropica de la transicion de los lipidos (16[grados]C-4[grados]C), lo cual genera un mayor dano en la membrana, afectandolo considerablemente (Zeron et al. 1999). Mucci et al. (2006) confirmaron esta observacion, al comparar la criopreservacion de embriones bovinos producidos in vitro; por medio de las dos metodologias, los autores observaron un aumento en la viabilidad 72 horas despues del descongelamiento de los embriones que fueron conservados por medio de la vitrificacion (114/265; 43%), en comparacion con los que fue ron congelados (33/275; 12%). De igual forma, varios autores reportaron el aumento de las tasas de viabilidad no solo in vitro, sino tambien in vivo, despues de la vitrificacion, al comparar las dos metodologias (Hasler et al. 1995; Kaidi et al. 2001; Dinnyes et al. 1995; Reinders et al. 1995; Agca et al. 1996; Lane et al. 1999; Mezzalira et al. 2004). Ademas, la vitrificacion es una tecnica que tiene otras ventajas comparativas frente a la congelacion tradicional, ya que utiliza procedimientos mas simples, no necesita de equipos costosos y requiere poco tiempo para su realizacion (Baril et al. 2001).

Vitrificacion

Gracias a sus posibles efectos beneficos, esta tecnica ha tomado gran importancia en la criopreservacion no solo de embriones in vitro, sino tambien de oocitos y embriones producidos in vivo. Sin embargo, desde el primer procedimiento realizado con exito en embriones mamiferos por Rall y Fahy (1985), la vitrificacion ha sufrido multiples modificaciones, en el intento por simplificar sus procedimientos y mejorar las tasas de viabilidad. Algunas de estas tienen relacion con el uso de diferentes crioprotectores, sitemas de empaque de los embriones u oocitos y el uso de nitrogeno supercongelado.

Crioprotectores

Varios de los estudios han sido enfocados a la disminucion de los efectos toxicos y osmoticos causados por las altas concentraciones de los crioprotectores (Kasai y Mukaida 2004). La vitrificacion, al ser una tecnica que consiste en la criopreservacion a traves del aumento de la viscosidad de las soluciones crioprotectoras, necesita de concentraciones de crioprotectores mayores (4-8 M) a las utilizadas normalmente en las tecnicas convencionales de congelacion (1-2 M) (Woods et al. 2004). Por lo tanto, la busqueda de la disminucion de estos efectos deletereos se ha encaminado a traves de diferentes tecnicas, como por ejemplo, el uso de crioprotectores menos toxicos, el establecimiento de volumenes minimos, niveles de concentracion menores por medio de la asociacion de mas de un crioprotector, la adicion progresiva de los crioprotectores, asi como cambios de temperatura y tiempos en el momento de su exposicion (Liebermann et al. 2003).

El uso de soluciones crioprotectoras con bajo peso molecular es una de estas estrategias; los crioprotectores, al tener una mayor permeabilidad, permiten la reduccion de los tiempos de exposicion y la concentracion, con lo cual se previene el dano osmotico causado en la celula (Kasai y Mukaida 2004). Entre los crioprotectores de bajo peso molecular, el mas usado es el etilenglicol (EG) (Massip 2001). Sin embargo, varios experimentos sugieren que crioprotectores como 1-2 propanediol (PROH), glicerol (GLY), dimetilsulfoxido (DMSO) y sus posibles combinaciones con otros crioprotectores, son igualmente buenos candidatos para ser empleados en la vitrificacion de embriones (Ishimori et al. 1992; Hubalek 2003). De igual forma, la asociacion de uno o mas crioprotectores con caracteristicas mas estables, permitira la utilizacion de soluciones mas simples y la reduccion de su toxicidad especifica. De acuerdo con algunos investigadores, la permeabilidad de la combinacion de crioprotectores es mayor que la de sus componentes de forma individual (Vajta y Nagy 2006). La asociacion mas comunmente utilizada en vitrificacion es la compuesta por EG y DMSO (Mezzalira et al. 2004; Vajta y Nagy 2006), sin embargo, esta puede ser reemplazada por otro tipo de combinaciones de agentes crioprotectores, como el EG y PROH, con lo cual se obtienen excelentes resultados en la vitrificacion de embriones producidos in vitro y oocitos inmaduros (Vieira et al. 2008). La adicion de crioprotectores no permeables, tales como disacaridos (sucrosa, trealosa) o macromoleculas (Ficoll, poilivinilalcohol (PVA), polivinilpirrolidona (PVP)), igualmente contribuye a la reduccion de su toxicidad, ya que ayuda a disminuir las concentraciones del crioprotector dentro de las celulas (Kasai y Mukaida 2004; Liebermann et al. 2003).

Sistemas de empaque

Los grandes volumenes de crioprotectores tambien son limitantes de las tasas de enfriamiento. Los primeros elementos de empaque utilizados con exito en la vitrificacion de oocitos y embriones, fueron las pajillas de inseminacion de bovinos, las cuales utilizaban relativamente grandes volumenes (> 20 [micron]L) y solo alcanzaban tasas de enfriamiento de 2.500[grados]C/min (Palasz y Mapletof, 1996). Posteriormente, con el desarrollo de empaques de menor volumen (< 5 [micron L), asociados con el contacto directo con el nitrogeno liquido, se logro aumentar las tasas de enfriamiento hasta casi los 30.000[grados]C/min (He et al. 2008). La mayoria de estas formas de empaque, ademas permitieron la disminucion de las concentraciones de los crioprotectores, reduciendo asi el dano toxico y mecanico causado por la vitrificacion (tabla 1). Dentro de los principales sistemas de empaque desarrollados se encuentran: el tamano minimo de la gota (MDS) (Arav 1992), las rejillas para microscopia electronica (EM) (Martino et al. 1996), las pajillas estiradas abiertas conocidas como open-pulled straws (OPS) (Vajta et al. 1998), las asas para congelacion o cryoloops (Lane et al. 1999), el volumen minimo de congelacion (MVC) (Hamawaki et al. 1999), el sistema de hemi-pajilla (Vanderzwalmen et al. 2000), la superficie solida de vitrificacion (Dinnyes et al. 2000), puntas gel-loading tips (Tominaga y Hamada 2001), pajillas estiradas cerradas closed-pulled straws (CPS) (Chen et al. 2001), mallas de nylon (Matsumoto et al 2001), pipetas flexibles, flexipet denuding pipette (FDP) (Liebermann et al. 2002), pajillas estiradas abiertas superfinas superfinely OPS (SOPS) (Isachenko et al. 2003), las micropipetas plasticas de diametro fino (Cremades et al. 2004), puntas de pipeta de 100 [L (Hredzak et al. 2005), puntas de congelacion cryotip y cryotops (Kuwayama et al. 2005).

Dentro de estos sistemas, el metodo de empaque mas usado es la OPS, la cual alcanza tasas de enfriamiento de mas de 20.000[grados]C/min, por lo que disminuye los danos toxicos y osmoticos en las celulas (Vajta et al. 1998). Sin embargo, modificaciones posteriores de este modelo consiguieron aumentar aun mas las tasas de enfriamiento, al utilizar para su fabricacion materiales distintos al plastico. El plastico, debido a sus caracteristicas fisicas, tiene una baja conductividad de calor, lo que limita las tasas de congelacion, por lo tanto, el uso de otros materiales con mayor conductividad como el vidrio (Mezzalira et al. 1999), el metal (Bunn et al. 2006) o el cuarzo (He et al. 2008), permiten aumentar el intercambio de calor y las tasas de enfriamiento, alcanzando velocidades de casi 30.000[grados]C/min. Varios autores demostraron esta eficacia, al alcanzar mayores tasas de congelacion con micropipetas de vidrio (GMP) en comparacion con las OPS, y mayores tasas de sobrevivencia in vitro posvitrificacion. En el experimento realizado con embriones bovinos, por ejemplo, se obtuvieron 36/63 (57,1%) de blastocitos eclosionados al ser vitrifcados con las GMP en comparacion a 28/54 (51,8%) con las OPS, debido a la mayor conductividad del empaque y la utilizacion de un menor volumen de crioprotectores (Kong et al. 2000; Cho et al. 2002) (figuras 1 y 2).

[FIGURAS 1-2 OMITIR]

Nitrogeno supercongelado

Por ultimo, otra de las estrategias para aumentar la velocidad de congelamiento ha sido la reduccion de temperatura del nitrogeno liquido. El uso de nitrogeno supercongelado (slush de nitrogeno, SN2) reduce el punto de ebullicion, mediante la estabilizacion a traves de la presion negativa, minimizando el efecto aislante del vapor del nitrogeno, lo cual permite mayor eficiencia en la transferencia de calor entre las muestras y el nitrogeno liquido (Vieira et al. 2008). De esta forma, al evitar el revestimiento de las capas de nitrogeno durante la inmersion, el nitrogeno liquido puede alcanzar temperaturas hasta de -210[grados]C, con curvas de congelamiento mas rapidas (32.200[grados]C/min), que reducen la posibilidad de recristalizacion (formacion irregular de hielo intracelular), que se puede presentar en las muestras durante el descongelamiento, y la vitrificacion de muestras mas sensibles como en el caso de los oocitos humanos (Arav et al. 2000; Santos et al. 2006). Sobre este sistema, se han realizado varios trabajos que demuestran su efecto positivo, aun con el procedimiento de envases sellados, y se han alcanzado tasas de supervivencia in vitro superiores (56%) en comparacion con las de un sistema de vitrificacion convencional en nitrogeno liquido a -196[grados]C (10%) (p < 0,005) (Yavin et al., 2009).

Nuevas perspectivas

Es claro que la criopreservacion de embriones in vitro esta ligada a la calidad en el proceso de su produccion. Por tanto, para poder generar metodos mas eficientes de criopreservacion se requiere no solo el desarrollo de nuevas tecnologias, sino igualmente modificaciones dentro del proceso de produccion que permitan una mayor sobrevivencia de los embriones en el momento de la vitrificacion. La modificacion de los medios de cultivo puede ser una de las opciones. El desarrollo de mejores sistemas de cultivo in vitro, eventualmente mejorara considerablemente la calidad embrionaria y, por tanto, la criotolerancia de los embriones. De forma que metodologias como el sistema de congelacion convencional podran ser igualmente utilizadas con exito en la criopreservacion de este tipo de embriones (Nedambale et al. 2006). Diferentes estudios han demostrado que la produccion de embriones in vitro en cierto tipo de medios de cultivo (Leibo y Loskutoff 1993; Mahmoudzadeh et al. 1994; Massip et al. 1995) o a traves del cocultivo con celulas de la granulosa o celulas vero (Leibo y Loskutoff 1993; Desai et al. 2000) pueden aumentar las tasas de sobrevivencia de los embriones posvitrificacion.

El suero de origen animal utilizado en los medios de cultivo y la composicion de lipidos en los sistemas de cultivo pueden cumplir el importante papel de la criotolerancia de los embriones. Se ha comprobado que la presencia del suero en el suplemento de los medios de cultivo puede influenciar la composicion quimica de los embriones (Saha y Suzuki, 1997) y su sensibilidad a la criopreservacion (Dinnyes et al. 1995). Los medios de cultivo libres de suero permiten el desarrollo y la eclosion de casi el 100% de los embriones despues de la vitrificacion (Hochi et al. 1996). De igual forma, el uso de etosulfato de fenazina (PES), permite mejorar las tasas de desarrollo embrionarias con la reduccion del contenido citoplasmatico de lipidos en los embriones en el momento de la vitrificacion (Seidel 2006). La adicion de la hialurona (Palasz et al. 2008) o acido linoleico (Hochi et al. 1999; Laowtammathron et al. 2005; Pereira y Marques 2008) tambien aumenta la criotolerancia de los embriones bovinos in vitro, cultivados en medios de cultivo libres de suero.

Por otro lado, se puede reducir igualmente el alto nivel de lipidos que se encuentra en los embriones producidos in vitro, por medio de la remocion de lipidos por centrifugacion o a traves de la micromanipulacion por medio del desnudamiento por micropipeta o pipeteado intenso, con lo cual se aumentan las tasas de sobrevivencia de los embriones criopreservados.

Por su parte, la formacion de radicales libres durante la criopreservacion puede causar dano celular y disminuir la viabilidad de los embriones. Por esta razon, la adicion de EDTA (0,1 mM) y/o glutation (GSH; 1 mM) en el cultivo antes de la vitrificacion puede llegar a mejorar el desarrollo de los embriones, al disminuir la oxidacion de las membranas celulares insaturadas de lipidos, promoviendo su integridad celular (Aksoy et al. 1999). Ademas, la adicion de agentes como el EDTA y el [beta]- mercaptoetanol, pueden llegar a aumentar sustancialmente las tasas de sobrevivencia, aun en ambientes con bajos niveles de oxigeno, al proteger al embrion de los radicales libres y la autoperoxidacion de lipidos (Nedambale et al. 2006).

Otras estrategias de optimizacion del proceso de vitrificacion pueden realizarse por medio de la modificacion de las caracteristicas propias del embrion antes de ser expuesto al proceso de criopreservacion. Por ejemplo, la inyeccion de trealosa en oocitos aumenta la proteccion de las estructuras, principalmente en las membranas, y disminuye los efectos deletereos debido a la toxicidad de los crioprotectores (Eroglu et al. 2003). Por otra parte, la reduccion artificial del fluido blastocelico, al modificar el volumen de liquido intracelular, consigue reducir el shock osmotico y los problemas de permeabilidad, asi como la formacion de cristales de hielo (Vanderzwalmen et al. 2002; Chen et al. 2001; Son et al. 2003). Por ultimo, la utilizacion de estabilizadores del citoesqueleto con la adicion de citocalasina B (Dobrinsky et al. 2000) reduce la despolimerizacion de los microfilamentos y microtubulos, y mejora las tasas de sobrevivencia de los oocitos y embriones criopreservados. Por lo tanto, todas estas metodologias seran probablemente utiles al minimizar ciertas anormalidades celulares propias de los embriones producidos in vitro, y hacer que cada vez sean menos sensibles a la vitrificacion.

CONCLUSION

La utilizacion de la vitrificacion como metodo de criopreservacion de embriones producidos in vitro ha abierto nuevas perspectivas en relacion con la mejora de los sistemas de preservacion o congelacion de embriones y oocitos, ya que ha disminuido el riesgo de lesion del embrion producido por los metodos convencionales. Sin embargo, aun se necesitan varias modificaciones y mejoras en su metodologia para que sea una herramienta aplicada ampliamente en el ambito comercial.

Articulo recibido: 8 de octubre de 2010; aprobado: 9 de diciembre de 2010

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P. Rodriguez, [1] * C. Jimenez [2]

[1] Instituto de Reproduccion Animal de Cordoba (Argentina).

[2] Clinica de Reproduccion Animal, Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogota. Carrera 30 nro. 45-03, Bogota (Colombia).

* Autor para correspondencia: prodriguezv@iracbiogen.com.ar.
TABLA 1. Viabilidad posvitrificacion de embriones bovinos
producidos in vitro en diferentes tipos de empaque

                                                       Viabilidad

Metodo             Autores                       % Eclosion   % Prenez

Pajilla 0,25 mL    Massip et al. (1987)              --         38%

Open pulled        Vajta et al. (1998)              94%          --
straws (OPS)

Cryoloop           Lane et al. (1999)               80%          --

Minimo volumen     Hamawaki et al. (1999)           75%          --
de congelacion
(MVC)

Pajilla 0,25 mL    Pugh et al. (2000)               71%         32%
(microvolumen)

Hemi-pajilla       Vanderzwalmen et al. (2000)      44%          --

Gel loading tips   Tominaga y Hanada (2005)         17%          --

Micropipeta de     Vieira et al. (2006)             75%         19%
vidrio (GMP)

Cryotop            De Rosa et al. (2007)            75%          --

Micropipeta de     Rios et al. (2010)              61,30%        --
vidrio (GMP)

OPS sellada        Yu et al. (2010)                34,7%
(CPS)
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Author:Rodriguez, P.; Jimenez, C.
Publication:Revista Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia
Date:Aug 1, 2011
Words:6475
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