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Correlacion entre la infeccion por microquistes de S. lamacanis y CK-MB, AST y LDH en alpacas.

CORRELATION BETWEEN THE INFECTION BY S. lamacanis MICROCYSTS AND CK-MB, AST AND LDH IN ALPACAS

INTRODUCCION

Sarcocystis lamacanis y S. aucheniae ocasionan la sarcocistiosis en camelidos sudamericanos. La alpaca es el hospedero intermediario donde el parasito realiza su reproduccion asexual, formando los macro y micro quistes que pueden afectar en forma masiva las fibras musculares estriadas y cardiacas (Guerrero y Leguia, 1987). Esta enfermedad constituye una zoonosis toxica, pues el consumo de carne infectada, cruda o insuficientemente cocida, puede producir un cuadro de gastroenteritis que cursa con nauseas, diarreas, colicos y escalofrios, especialmente con el consumo de musculo cardiaco infectado con microquistes (Leguia y Casas, 1999). Asi mismo, se ha demostrado que Sarcocystis lamacanis cursa con cuadros clinicos en alpacas, es asi que en inoculaciones experimentales con 160,000 esporoquistes realizadas en crias de alpacas se evidencio signos clinicos agudos que incluian anorexia, pirexia, incoordinacion postracion y finalmente la muerte (Leguia et al, 1990), mientras que La Perle et al. (1999) reportaron un caso de miositis eosinofilica y aborto en una alpaca.

Las manifestaciones sintomaticas de una cardiomiopatia aguda pueden ser variadas, y el ECG no es el unico medio usado para dicho diagnostico. Por otra parte, los marcadores bioquimicos y enzimas cardiacas tambien son considerados importantes para el diagnostico de cardiomiopatias (Rajappa y Sharma, 2005). Los marcadores sericos sirven para diagnostico de miopatias (Braun et al., 1996), dano de miocardio por cirugia (Adams, 1997), ejercicio (Laslett et al., 1996; Siegel et al., 1997) y miocarditis (Franz et al., 1996; Lauer et al., 1997).

Inicialmente la creatina quinasa (CK) fue utilizada como marcador-diagnostico, pero fue superado por la creatina cardiaca banda miocardica (CK-MB) que evoluciono y tienden a ser tan buenas como las troponinas en el diagnostico de miocardiopatias (Maynard et al., 2000).

Los investigadores han descrito las caracteristicas que deberia tener un marcador cardiaco ideal (Mercer, 1997), como la alta especificidad que se determina por sus altas concentraciones en el dano de miocardio y sus bajas concentraciones mas bajas en tejido no cardiaco (Rajappa y Sharma, 2005).

Generalmente es aceptado que los niveles de los marcadores enzimaticos como CK-MB, la aspartato aminotransferasa (AST) y lactato deshidrogenasa (LDH), varian al evaluar la lesion miocardica (Alpert et al., 2000).

Es por estos motivos que el presente estudio tuvo objetivo determinar la correlacion existente entre la infeccion por microquistes de S. Lamacanis y los niveles en sangre de biomarcadores enzimaticos CK-MB, AST y LDH en alpacas, a fin de establecerlos como predictores de salud o determinar el grado de infeccion por sarcocistiosis.

MATERIALES Y METODOS

Animales y muestras

Se han utilizado 41 alpacas aparentemente sanas de 3-5 anos de edad, provenientes del matadero Municipal de Huancavelica en la Provincia de Huancavelica. La sangre se obtuvo por puncion de la vena yugular (5 ml), ante-mortem teniendo en cuenta los lineamientos de bienestar animal (GECS, 2012), y fue colocada en tubos de ensayo sin anticoagulante para venipuncion, inmediatamente se centrifugaron las muestras a 3000 rpm por 15 minutos, en una centrifuga automatica (GEMMY, Taiwan) para obtener el suero, el suero se almaceno a -196[grados]C en tanque de liquido (GEMMY, Taiwan) para su posterior analisis (Diaz et al, 2015).

Las muestras de tejido cardiaco fueron obtenidas postmortem de los ventriculos derecho, izquierdo y apice cardiaco, se seccionaron porciones de miocardio de 1-1,5 [cm.sup.2] los que se conservaron en frascos plasticos que contenian formol bufferado al 10%, y posteriormente fueron embebidos en parafina.

Analisis bioquimico sanguineo

Mediante analisis bioquimico serico de alpacas se determino los niveles de las enzimas Creatina fosfokinasa-MB (CK-MB, UI/L). Se utilizo el metodo de inmunoinhibicion (activado por N-acetilcisteina), para la determinacion cuantitativa de la actividad de la isoenzima MB de la Creatina fosfokinasa (Valtek, Chile).

Para la determinacion de Lactato Deshidrogenasa (LDH, UI/L) se utilizo el Kit comercial LDH--Liquida metodo cinetico UV para la determinacion de Lactato Deshidrogenada (LDH) en suero y plasma (FAR Diagnostics) y para Aspartato Aminotransaminasa (AST/GOT, UI/L) se utilizo el Kit comercial AST/GOT Liquido metodo cinetico UV--IFCC para la determinacion cuantitativa de Aspartato Amino Transaminasa (AST/GOT) en suero y plasma (FAR Diagnostics, Italia), siguiendo las especificaciones del fabricante y por medio de un analizador bioquimico semiautomatico (SINOWA, China).

Analisis histologico

Las muestras de miocardio en parafina fueron tenidas con Hematoxilina-Eosina (HE). Los microquistes de Sarcocystis lamacanis se observaron por microscopia optica con un objetivo a 4X (Primo Star Carl Zeiss, Alemania), y mediante una camara digital incorporada AxionCam ERc5s (Carl Zeiss, Alemania) se obtuvieron fotografias a 4X y se determino la infeccion parasitaria determinada por el numero de microquistes en 25 [mm.sup.2] de miocardio (NoMq) con el Software de medicion ZEN 2012 SP1 Blue edition, Carl Zeiss, Alemania (Rodriguez et al., 2012).

Analisis de datos

Los valores del analisis bioquimico y del Numero de microquistes (NoMq) se presentan como Promedios (Prom) [+ o -] Desviacion estandar (DE). Los No Mq fueron agrupados en tres rangos de acuerdo al grado infeccion 1-10 NoMq, 11-100 NoMq y >100 NoMq, y los resultados de la bioquimica sanguinea se distribuyeron dentro de ellos. Mediante el Coeficiente de Pearson se determino la relacion entre el No Mq y la bioquimica sanguinea cardiaca; mientras que, por analisis de varianza (ANOVA), con un nivel de significacion del 95%, se evaluo la existencia de diferencias estadisticas significativas (p<0.05) entre los tres rangos El coeficiente de Correlacion de Pearson y el Analisis de Varianza (ANOVA) se realizo mediante el paquete estadistico GraphPad Prism version 6 (GraphPad Software, Inc, 2015).

RESULTADOS

En el 100 % de los animales se identificaron microquistes de S. Lamacanis. Los valores del Numero de microquistes (NoMq) se expresan como promedio [+ o -] desviacion estandar, determinandose para el rango de 0-10, 6.36 [+ o -] 3.41; para 11-100, 41.01 [+ o -] 19.82 y para >100, 130.31 [+ o -] 27.99 microquistes en 25[mm.sup.2] de miocardio (Figura 1).

La bioquimica sanguinea para CK-MB, AST/GOT y LDH no mostraron diferencias estadisticas significativas (p > 0.05) al compararlos entre los rangos de agrupacion por ANOVA. De acuerdo al orden creciente de los rangos (0-10; 11-100 y >100) se determinaron en sangre para CK-MB (UI/L) 29.19 [+ o -] 8.34, 30.41 [+ o -] 8.93 y 32.93 [+ o -] 12.45; para AST/GOT (UI/L) 260.52 [+ o -] 59.79, 243.44 [+ o -] 48.31 y 253.00 [+ o -] 37.79; y para LDH (UI/L) 937.41 [+ o -] 209.52, 965.78 [+ o -] 162.15 y 966.46 [+ o -] 125.33 (Figuras 2, 3 y 4).

El cuadro 1 muestra el coeficiente de correlacion entre el NoMq y los valores de las enzimas CK-MB, AST/GOT y LDH. Se puede observar que la correlacion es muy baja para el caso de CK-MB y para el resto de enzimas casi nula o hasta negativa.

[FIGURA 1 OMITIR]

[FIGURA 2 OMITIR]

[FIGURA 3 OMITIR]

[FIGURA 4 OMITIR]

DISCUSION

En nuestro estudio el 100% de los animales presentaban microquistes de Sarcoscystis lamacanis, lo que anteriormente fue reportado por Mostajo (1983) quien hallo prevalencias del 70 al 100% de micro y macroquistes en las cuatro especies de camelidos sudamericanos en todas las regiones alpaqueras del Peru. Por otra parte, este es el primer estudio en documentar sobre la correlacion que podria existir entre la presencia de microquistes de Sarcocystis lamacanis en miocardio de alpacas y los niveles sericos del biomarcador CK-MB, LDH y AST/GOT en alpacas. Asi mismo, se ha reportado que las concentraciones de CK-MB tienen 88.2 % de sensibilidad y 93.2 % de especificidad como biomarcador cardiaco (Alpert y Thygesen 2000; Jaffe et al., 2010).

Bogin (2000), midio enzimas cardiacas en camelidos cuyos resultados se expresan en el promedio y desviacion estandar para cada enzima: En camellos CK-MB (88 [+ o -] 37 UI/L), AST (105 [+ o -] 17 UI/L) y LDH (392 [+ o -] 64 UI/L). En alpacas CK-MB (41 [+ o -] 30 UI/L), AST (292 [+ o -] 50 UI/L) y LDH (320 [+ o -] 116 UI/L).

En el presente trabajo los niveles de CK-MB en alpacas adultas de 3-5 anos de edad con presencia de microquistes de S. lamacanis van de 17.9-41.4 UI/L (Cuadro 2) y estan por debajo de los valores hallados en el estudio realizado por Tharwat et al. (2013 a) determinaron que en camellos adultos sanos de Arabia Saudita el valor de CK--MB promedio fue de 139 [+ o -] 22 UI/L; mientras que en camellos de tiro sometidos a estres de transporte los valores obtenidos fueron de 320 [+ o -] 170 UI/L. Las enzimas AST y CK-MB podrian ser consideradas economicas al momento de usarlas como marcadores de dano cardiaco. Por su parte, AST presento valores promedio de 80 [+ o -] 17 UI/L en animales control, y se noto un incremento en animales sometidos a estres de transporte cuyo valor fue de 92 [+ o -] 17 UI/L.

El analisis bioquimico del suero sanguineo con frecuencia provee informacion valiosa sobre la salud cardiaca y enfermedad en los animales (Coodley, 1970). Cuando hay dano en el miocardio los niveles de enzimas tales como CK-MB (Kaneko, 1989), LDH (Reinaldo et al., 2010), AST y ALT (Coodley, 1970), homocisteina (Ciaccio et al., 2008) y Troponina I (cTnI) (Radostits et al., 2007) se encuentran elevadas en suero.

Los valores sericos pueden variar dependiendo de la metodologia que se emplee en el laboratorio (Santalo et al., 2003). Es por esto que se recomienda establecer, en cada laboratorio, sus propios rangos referenciales (Sodikoff, 1996). Por ello, en esta investigacion se presenta valiosa informacion de valores referenciales sericos, de estas enzimas, en alpacas adultas aparentemente normales. Pero, teniendo en cuenta que por la cantidad de animales estudiados, estos valores resultan ser no significativos estadisticamente.

Son pocos los estudios como el nuestro que relacionan la infeccion parasitaria en tejido cardiaco y los niveles de biomarcadores cardiacos (Cuadro 2). Otro estudio que hace esta correlacion es uno desarrollado en ratas que fueron infectados oralmente con huevos de Toxocara canis y se evidencio los cambios producidos en la bioquimica serica para CK-MB la cual se elevo a 674 UI/L cuando el rango de animales no infectados va de 385-605 UI/L, mientras que LDH se encontro dentro de los valores normales (1473-2401 UI/L) (Braga et al., 2012).

Las tres enzimas determinadas en nuestro estudio tambien fueron evaluadas por Pourjafar et al. (2013) en dromedarios de 1-3 anos de edad y hallaron valores de: AST (UI/L), 101.57 [+ o -] 14.38; CK-MB (UI/L), 225.06 [+ o -] 109.40; LDH (UI/L), 2833.49 [+ o -] 748.05. Por su parte en los animales de 4-6 anos de edad: AST (UI/L), 72.42 [+ o -] 24.37; CK- MB (UI/L), 250.16 [+ o -] 62.61 y LDH (UI/L) 1714.44 [+ o -] 887.57. Mientras que nosotros hemos determinado para CK-MB (UI/L) 29.19+8.34, 30.41 [+ o -] 8.93 y 32.93 [+ o -] 12.45; para AST/GOT (UI/L) 260.52 [+ o -] 59.79, 243.44 [+ o -] 48.31 y 253.00 [+ o -] 37.79; y para LDH (UI/L) 937.41 [+ o -] 209.52, 965.78 [+ o -] 162.15 y 966.46 [+ o -] 125.33, en los tres rangos de agrupacion, respectivamente (0-10; 11-100 y >100) (Figuras 2, 3 y 4). Bacbugan et al. (2010) desarrollaron un trabajo donde obtuvieron valores de enzimas relacionadas a dano cardiomuscular en 8 bovinos, 10 ovejas y 10 cabras mayores de 12 meses de edad y clinicamente saludables, se determinaron los niveles de CK- MB (UI/L): 21.3 [+ o -] 1.25, 21.60 [+ o -] 1.40 y 27.8 [+ o -] 2.55, respectivamente. AST (UI/L): 56.00 [+ o -] 6.53, 67.60 [+ o -] 2.4 y 58.00 [+ o -] 2.7, respectivamente. LDH (UI/L): 958.5 [+ o -] 63.5, 386.9 [+ o -] 25.4 y 267.1 [+ o -] 19.2, respectivamente.

Otros estudios en veterinaria como los de Fredericks et al. (2001) determinaron la concentracion de CK-MB (UI/L) directamente de tejido cardiaco en diferentes especies de uso comun en laboratorio y hallo en perro 1.3 [+ o -] 0.19, humano 10.3, mono 1.2 [+ o -] 0.93, cerdo 0.6 [+ o -] 0.07 y rata 2.5 [+ o -] 1.31.

No hemos podido demostrar que a mayor grado de infeccion cardiaca haya mayores niveles de CK-MB, AST y LDH (Cuadro 1 y Figura 2), a pesar que esta es la primera enzima es la mas sensible de las tres usadas en nuestro estudio. Hay tres isoformas de creatinina kinasa: BB, MM y MB. El musculo esqueletico contiene primariamente la isoforma MM con trazas de MB (estimado en 1-4 % de la actividad CK) y el musculo cardiaco contiene primariamente la isoforma MM pero con altas cantidades de MB (estimado en 20 % de la actividad CK) (Henderson et al., 2001). En humanos la principal, isoforma contenida en suero es la MM, mientras que la MB es pequena. La presencia de la secrecion incrementada de CK MB en sangre puede estar relacionada a numerosos sucesos, que esten supeditados al dano del miocardio. Sin embargo, un estudio publicado recientemente, muestra que camellos envenenados con narasina mostraron danos miocardicos en la histopatologia pero los valores de CK-MB no se incrementaron (Hassen et al., 2012).

CONCLUSIONES

* La correlacion entre el numero de microquistes y los niveles de CK-MB, AST y LDH fueron muy bajas en alpacas infectadas con microquistes de S. lamacanis, por lo que las enzimas evaluadas no serian de utilidad como predictores de dano cardiaco por infeccion de S. lamacanis.

* En comparacion con los valores referenciales de otros estudios, se observo que la actividad de las enzimas CK-MB y AST/GOT mantuvieron sus valores, a diferencia de la enzima LDH que se incremento en las alpacas con microquistes de S. lamacanis.

http://dx.doi.org/10.5209/rev_RCCV.2015.v9.n1.48845

Agradecimientos

El presente estudio fue financiado con fondos provenientes del Vicerrectorado de Investigacion (VRI) de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos y del Proyecto No 173-FINCyT-IB-2013, Lima-Peru.

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(1) Laboratorio de Farmacologia y Toxicologia; (2) Estacion Experimental del Centro de Investigacion IVITA--El Mantaro, (3) Laboratorio de Patologia Clinica y Biologia Molecular, (4) Laboratorio de Epidemiologia y Economia Veterinaria, Facultad de Medicina Veterinaria-Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima-Peru; (5) SENASA, Region Junin-Peru; (6) Departamento de Fisiologia Animal, Universidad Complutense de Madrid-Espana

* E-mail: joserodriguezmv@gmail.com; belopezt@gmail.com
Cuadro No. 1. Coeficiente de Correlacion entre el No de microquistes de
S. lamacanis y los niveles de CK/MB, AST/GOT y LDH.

No.                         CK-MB
microquistes
               Total     0-10    11-100    >100

Total           0.17
0-10                    -0.15
11-100                            0.19
>100                                       0.07

No.                       AST/GOT
microquistes
               Total     0-10    11-100    >100

Total           0.04
0-10                    -0.52
11-100                            0.08
>100                                       0.05

No.                           LDH
microquistes
               Total     0-10    11-100    >100

Total           0.06
0-10                    -0.55
11-100                            0.06
>100                                       0.30

Cuadro No. 2. Valores minimos y maximos del No de microquistes de S.
lamacanis, CK-MB, AST/GOT y LDH dentro de los rangos de agrupacion.

                               Rangos de agrupacion

                       0-10          11-100           >100

No. microquistes     1.1-10.3       12.5-84.6      100.5-170.5
CK-MB (UI/L)        17.9-41.4       13.9-46.9       22.1-56.6
AST/GOT (UI/L)     173.1-329.8     151.3-363.6     200.6-238.2
LDH (UI/L)         828.5-658.4    455.6-1212.2    790.2-1144.3
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Author:Lopez-Torres, B.; Espinoza, J.; Rodriguez, J.; Lucas, J.; Barrios-Arpi, M.; Arroyo, G.; Rodriguez, A
Publication:Revista Complutense de Ciencias Veterinarias
Date:Jan 1, 2015
Words:3700
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