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Contaminacion in vitro de cepillos dentales.

INTRODUCCION

Los cepillos dentales han sido usados para control de la higiene oral desde tiempos inmemoriales. El primer cepillo dental conocido provino de la China y fue hecho en marfil con cerdas de crin de caballo (1). Una variante de este cepillo fue reinventada en 1498 con cerdas de pelo de cerdo. En el siglo XIX, se usaron los cepillos dentales con mango de plata de la epoca Victoriana por la elite social de la epoca (2). En el siglo XX. con la aparicion de los procesos industriales y la expansion de los mercados comerciales, los cepillos dentales se popularizaron. En 1920, en los Estados Unidos se comercializaban mas de un centenar de cepillos dentales. La introduccion de las cerdas de Nylon y los mangos de plastico en 1938, terminaron por revolucionar la tecnologia de los cepillos dentales, incorporandose algunas ventajas al producto como la homogeneidad y elasticidad en los cepillos, la modificacion de las propiedades de las cerdas, el incremento en la repulsion del agua y la menor susceptibilidad a la contaminacion por microorganismos (3). En los anos 80, se difundio la idea del cepillo " ideal" que deberia poseer una cabeza pequena para facilitar el acceso a todos los dientes, poseer un mango largo y ancho para facilitar su agarre, poseer cerdas redondeadas de 0.2 mm de diametro y de 10 mm de longitud para no lesionar la encia, y cerdas organizadas en multipenachos para incrementarla efectividad de la limpieza dental (4). El concepto del cepillo "ideal" en los ultimos 5 anos ha sido reemplazado por la formulacion profesional de los cepillos dentales de acuerdo a las necesidades individuales de los pacientes, asi los cepillos son formulados.

CONTAMINACION DE LOS CEPILLOS DENTALES

El primer trabajo sobre la contaminacion de cepillos revelo que ellos tienen elevados porcentajes de microorganismos patogenicos y oportunistas (5), Otros estudios han confirmado estos hallazgos, (6). Se acepta en la actualidad que la caries dental y las periodontitis son enfermedades infecto-contagiosas, (7,8) y que la contaminacion entre individuos por microorganismos patogenicos se puede presentar por la saliva, besos, el compartir alimentos o utensilios de alimentacion o elementos de higiene oral, (6). La contaminacion del cepillo dental es inevitable pues los humanos poseemos una microbiota oral (9,10,11). Ademas de los cepillos dentales, otros elementos de higiene oral han sido reportados como contaminados, entre ellos, los vasos, el hilo y la crema dental, los enjuagues e irrigadores orales, los palillos y los enhebradores de hilo interdental (11). Un estudio realizado en Colombia, con estudiantes de odontologia demostro que los cepillos dentales se contaminaron primero con diversos microorganismos orales, despues con bacterias entericas y por ultimo con contaminantes ambientales como hongos-levaduras (12). En 1988 Glass y Jensen (13), demostraron que los cepillos dentales tambien podrian mantener viable el virus del herpes simplex tipo-L Resulta teoricamente factible que otros virus humanos puedan diseminarse con la ayuda de los cepillos dentales contaminados (14).

Un factor importante en el grado de contaminacion microbiana de los cepillos dentales es su tiempo de recambio. Hingst recomendo que los cepillos dentales se cambien cada tres meses, en ningun caso se deberian usar mas de seis meses y se deberian cambiar cuando se presenten inflamaciones o infecciones virales de la garganta y/o la boca. Resulta paradojico que la profesion odontologica no haya hecho estudios sistematicos sobre el papel de los cepillos dentales en las enfermedades virales recurrentes/cronicas, en las enfermedades periodontales y en los riesgos de contaminacion con individuos VIH. Protocolos para la regular desinfeccion y/o el adecuado almacenamiento de los cepillos dentales tampoco han sido establecidos. Este estudio determino la viabilidad bacteriana y viral de 3 importantes patogenos sobre los cepillos dentales mediante el subcultivo bacteriano y la visualizacion del efecto citopatogenico del HSV-1 en monocapas celulares de pulmon embrionario humano.

MATERIALES Y METODOS

Este es un estudio microbiologico in vitro de la determinacion de la viabilidad un organismo periodontopatico como el A. actinomycetemcomitans, de un organismo oportunista como el E. cloacae y de un prevalente herpesvirus oral como el HSV-1 en cepillos dentales. Inicialmente, se cultivaron y estandarizaron en el laboratorio las cepas de referencia ATCC de los organismos. actinomycetemcomitans y de E. cloacae y un aislado clinico para HSV-1 de la seccion de virus del departamento de microbiologia de la Universidad del Valle. Posteriomente se inoculo por duplicado sobre las cerdas de los cepillos Colgate Junior, un equivalente ala dilucion 0.5 en la escala de McFarland, conteniendo aproximadamante 5 millones de bacterias. Los cepillos inoculados se mantuvieron a temperarura ambiente en una camara de flujo laminar hasta su subcultivo que se efectuo a las 3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 5 dias, 12 dias y 16 dias. Los subcultivos se hicieron en una atmosfera con 10% de CO2 en el medio selectivo soya tripticasa agar con vancomicina y bacitracina (TSB V). Cada par de cepillos dentales fue identificado con la fecha y la hora del subcultivo. Para el subcultivo, se agrego 1 ml de VMGA I en un vial esteril de vidrio por 1 minutos y se mezclo continuamente la solucion por pipeteo suave sobre las cerdas para desprender los microorganismos y esta mezcla se sometio a vibracion en un vortex por 30 segundos para homogenizar la solucion. 0.1 ml de la muestra se cultivo en el medio selectivo y se incubo por 2 dias a 36[grados]C. Las colonias bacterianas se visualizaron por microscopia estereoscopica y se realizaron pruebas adicionales de identificacion como la catalasa, el MUG, la oxidasa, la asimilacion de sustratos (API 20E) y la reaccion en cadena de la polimerasa (RCP).

Para comprobar la viabilidad de herpes simplex virus tipo 1 en los cepillos dentales, estos fueron inoculados con 1 ml de [10.sup.5] dosis infectiva de cultivo de tejido o (tissue culture infective dose) TC1D50/0.1 ml de solucion de Hank's y los cepillos fueron mantenidos tambien a temperatura ambiente. El virus fue cuantificado en pulmon embrionario humano crecido en microplacas de 96 huecos para establecer la TCID50 mediante diluciones con base 10 del inoculo fueron hechas con medio esencial de Eagle's suplementado con 2% de suero fetal bovino y gentamicina 50 g/ml. 0.1 ml de las muestras fueron inoculadas para cada dilucion. La microplaca fue visualizada por 5 dias para registrar la aparicion del efecto citopatogenico de infeccion por HSV-1 y la positividad fue comprobada por pase seriado e immunofluorescencia indirecta con un monoclonal contra HSV-1.

Una fraccion de la suspension original de los cepillos dentales previa extraccion del ADN fue usada para deteccion de A. actinomycetemcomitans especie-especifico usando la cadena de la polimerasa, con los primers y condiciones reportadas por Ashimoto (15).

Para A. actinomycetemcomitans:

Pares de primers (5"-3")

Posiciones en el gen 16S rRNA

AAA CCC ATC TCT GAG TTC TTC TTC

ATG CCA ACT TGA CGT TAA AT

478-1.034 (504) pares de bases

Para la extraccion del ADN bacteriano, 500 [micron]l de la suspension en VMGA I de los cepillos dentales fue mezclada con un Vortex y se adicionaron otros 500 [micron]l de agua destilada en un tubo Eppendorf. Esta mezcla se hirvio por 10 minutos e inmediatamente se preservo en hielo por 5 minutos. Esta muestra se centrifugo a 12.000 Xg por 2 minutos y el sobrenadante se paso a otro tubo eppendorf esteril para descartar los restos celulares. 5 [micron] del sobrenadante se usaron como templado para el RCP anadiendo 45 [micron]l de la mezcla de la reaccion que contuvo 5 [micron]l de 10xRCP buffer, 1.25 unidades de Taq DNA polimerasa y 0.2mM de cada uno de los deoxiribonucleotidos. El perfil de la temperatura para el A. actinomycetemcomitans incluyo un paso inicial de desnaturalizacion a 95[grados]C por 2 mininutos, seguido por 36 ciclos de 94[grados]C por 30 seg, 55[grados]C por 1 mininuto y 72[grados]C por 2 mininutos y un paso final de 72[grados]C por 10 mininutos. Los productos de RCP fueron analizados por electroforesis en 1.5% gel de agarosa a 4V/cm en Tris -- acetate EDTA buffer. El gel fue tenido con 0.5 [micron]g/ml de bromuro de etidio y fotografiado bajo 300-nm de luz ultravioleta. 1 kb de ADN ladder digest se uso como marcador de peso molecular Ashimoto et al, 1996 (15).

RESULTADOS

La contaminacion con microorganismos diferentes a los estudiados aqui no se presento en los cepillos dentales, puesto que siembras, el almacenamiento y los subcultivos se realizaron en una camara de flujo laminar. Un total de 48 cepillos fueron inoculados, 16 con A, actinomycetemcomitans, 16 con E. cloacae. y 16 con HSV-1. Cuatro cepillos dentales fueron estudiados como controles negativos y resultaron esteriles despues de la incubacion de una suspension en tioglicolato y en monocapas de pulmon embrionario humano. Los cepillos inoculados se cubrieron con un tubo de vidrio esteril hasta la mitad del mango del cepillo y se mantuvieron a temperatura ambiente. 30[grados]C durante el tiempo de los experimentos.

Despues de dos dias del subcultivo, se procedio a la lectura de los mismos teniendo en cuenta la morfologia tipica de la colonia la respuesta positiva a la catalasa, el MUG, la velocidad del crecimiento bacteriano y algunas pruebas bioquimicas como la asimilacion de sustratos (API 20E). Las colonias de A. actinomycetemcomitans formaron en TSBV colonias circulares pequenas, de borde aserrado, firmemente adheridas ala superficie de agar, con una frecuente estructura interna estrellada. A. actinomycetemcomitans, fue ademas catalasa positivo y lactosa-negativo, MUG (-). La identificacion definitiva de 5 aislados de A. actinomycetemcomitans se efectuo por RCP, en donde se consiguio una banda igual a la del control positivo de 504 pares de bases.

E. cloacae produjo una colonia grande, mucosa, aplanada, catalasa positiva con crecimiento rapido y tendencia al crecimiento confluente, y arginina, ornitina y Voges/Proskauer positivos (API 20E).

Cultivo positivo para HSV-1 genero la aparicion de efecto citopatogenico en monocapas de pulmon embrionario humano que se caracterizaron por alteracion de la polaridad celular, redondeamiento y desprendimiento de los fibroblastos. El efecto citopatico aparecio a las 24/48 horas del subcultivo. La positividad viral fue demostrada por pase seriado y por IFA.

A. actinomycetemcomitans y HSV-1 resultaron viables hasta las 72 horas de la inoculacion en cepillos dentales mantenidos a temperatura ambiente o a 30[grados]C. E. cloacae resulto viable hasta los 16 dias sobre los cepillos dentales a temperatura ambiente. Tabla 1.

DISCUSION

Este estudio demostro que los cepillos dentales pueden retener viables por dias, importantes microorganismo orales cuando son inoculados in vino. Incluso un virus considerado como muy sensible a las condiciones ambientales, como el HSV-1, se mantuvo viable e infectivo hasta por 72 h. E. cloacae se subcultivo hasta el dia 16 dias despues de inoculado, lo es indicativo de su elevada resistencia a soportar condiciones ambientales extremas. Este hallazgo convierte E cloacae en un microorganismo dificil de erradicar y controlar en la humedad relativa de los cepillos dentales. A. actinomycetemcomitans permanecio viable hasta por 72 horas lo que indica una menor resistencia a soportar condiciones ambientales, pero incluso esta resistencia limitada tendria implicaciones clinicas en pacientes portadores del organismo.

La importancia de estos hallazgos radica en que in vivo, los cepillos dentales pueden facilitar la diseminacion/transmision de importantes microorganismos patogenicos. Los pacientes con periodontitis que porten bacterias periodontopaticas contaminarian sus cepillos dentales con cada cepillado, perpetuando un circulo vicioso de inoculacion/reinfeccion y la de transmision patogenos a sus familiares. Pacientes con infecciones virales agudas orales infectarian los cepillos dentales facilitando la transmision o la inoculacion del virus en sitios sanos o a otros individuos. Ademas, el trauma que sobre las barreras naturales contra la infeccion, que generan las cerdas del cepillo, podria eventualmente diseminar los microorganismos sistemicamente.

Es importante recalcar que citomegalovirus, virus del Epstein Barr, herpes simpex virus tipos 1 y 2, hepatitis A, Hepatitis B, hepatitis C, HTLV 1 y 2 y H1V han sido detectados en la saliva, y podrian asi contaminar los cepillos dentales. El riesgo del uso de cepillos dentales en individuos contaminados con estos virus no ha sido establecido. Sin embargo, Glass y Jensen en 1988 (13) establecieron que en pacientes con episodios de herpes labial, el solo cambio de los cepillos dentales disminuia la severidad de la enfermedad clinica. En otro estudio, Glass en 1980 demostro que diversas enfermedades inflamatorias orales tales como, la estomatitis anosa recurrente, la glositis migratoria, la glosopirosis, y la enfermedad periodontal severa tuvieron una resolucion mas rapida y un mejor pronostico en los casos en que se cambio el cepillo dental. Resulta racional especular que la contaminacion de los cepillos dentales facilitaria la aparicion de ciertas enfermedades infecciosas orales y un incremento en la severidad de las enfermedades orales y periodontales. Los cepillos dentales deberian ser cambiados con una mayor frecuencia o en su defecto deberian desinfectarse regularmente en pacientes que sufran de enfermedades infecto/contagiosas.

CONCLUSIONES

Se demostro que los cepillos dentales pueden retener viables por varios dias importantes microorganismos orales cuando son inoculados in vitro. In vivo, los cepillos dentales podian facilitar la diseminacion/transmision de infecciones. Los cepillos dentales deberian cambiarse con mayor frecuencia o desinfectarse diariamente.

RECOMENDACIONES

Resulta necesario realizar estudios in vivo sobre la contaminacion de los cepillos dentales con diversos grupos de poblacion, incluyendo pacientes de alto riesgo, pacientes con immunodeficiencias, con enfermedad periodontal, diabeticos y enfermedades infecto-contagiosas, para conocer cual es la real contribucion de los cepillos a la salud oral y general de estos pacientes. Un modelo animal usando cepillos contaminados con patogenos, resulto en septisemia y enfermedad sistemica. Si el uso de los cepillos dentales contribuye a la aparicion y agravamiento de enfermedades orales y sistemicas, nuevas regulaciones seran necesarias para efectuar el recambio mas frecuente de los cepillos dentales y su apropiado almacenamiento y desinfeccion.

ANEXO

AGRADECIMIENTOS:

Los autores agradecen a la senora Senovia Buritica, Departamento de Microbiologia de la Universidad del Valle y al doctor Cesar Buitrago, de la Compania Colgate Palmolive, la colaboracion prestada para la realizacion de este estudio.
Tabla 1. Vi abilidad de A. actinomycetemcomitams, E cloacae
y herpes simplex tipo 1 (HSV-1) en cepillos dentales.

Tiempo de             A.                          Herpes simplex
subcultivo   actinomycetemcomitams   E. cloacae       tipo 1

3 horas                +                 +              +
24 horas               +                 +              +
48 horas               +                 +              +
72 horas               +                 +              +
96 horas               -                 +              -
5 dias                 -                 +              -
12 dias                -                 +              -
16 dias                -                 +              -

Subcultivo positivo = +
Subcultivo negativo = -


REFERENCIAS

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Paola Andrea Gaviria [1]

Heidy Liliana Rosales [1]

Adolfo Contreras [2]

* Esta publicacion obtuvo Mension de Honor en el XI Encuentro Nacional de Investigaciones en ACFQ 2UOU.

[1] Estudiantes de 9 semestre de Odontologia, Escuela de Odontologia, Universidad del Valle.

[2] Profesor Titular, Escuela de Odontologia, Universidad del Valle
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Author:Gaviria, Paola Andrea; Rosales, Heidy Liliana; Contreras, Adolfo
Publication:Estomatologia
Date:Sep 1, 2001
Words:2939
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