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Considerations of embryonic stem cells/Consideracoes sobre celulas-tronco embrionarias/Consideraciones de las celulas madre embrionarias.

INTRODUCAO

As celulas-tronco embrionarias (CTE) sao derivadas da massa celular interna do blastocisto e podem ser expandidas em cultura sem que ocorra perda da potencialidade e da capacidade de autorrenovacao, desde que sejam utilizados fatores que impecam sua diferenciacao. Estas celulas podem, ainda, se diferenciar em diversos tipos celulares de acordo com as condicoes de cultivo. Em ausencia de fatores troficos, as CTE podem se diferenciar em todos os tipos de tecidos, inclusive em celulas germinativas, de forma espontanea. Diversos tipos celulares sao obtidos dessas culturas, incluindo cardiomiocitos, condrocitos, adipocitos, celulas endoteliais, osteocitos, neuronios, astrocitos, oligodendrocitos, epitelio alveolar, hepatocitos e ilhotas pancreaticas (1, 2).

Os estudos desenvolvidos a partir das celulas-tronco tem favorecido um enorme progresso na medicina regenerativa, que consiste na utilizacao de celulas, fatores de proliferacao e diferenciacao celulares e biomateriais que permitem ao proprio organismo reparar tecidos e orgaos lesionados (3).

As CTE tem potencial para serem aplicadas em uma ampla variedade de enfermidades e tambem podem ser a melhor fonte de tecido humano para o teste de novas drogas in vitro (4). Entretanto, os metodos de diferenciacao empregados ate o momento nao produzem populacoes com 100% de pureza em termos de maturacao. Este fato prejudica a utilizacao clinica dessas celulas, visto que celulas indiferenciadas ou comprometidas com mais de uma linhagem celular podem levar a formacao de teratomas (tumores embrionarios). Outro obstaculo e representado pela imunorreatividade dessas celulas, que podem ser rejeitadas pelo hospedeiro, necessitando da utilizacao de terapias imunossupressoras concomitantes (1, 2, 5).

O objetivo desta revisao e abordar aspectos relacionados ao isolamento, cultivo, caracterizacao e aplicacao terapeutica das celulas-tronco embrionarias em mamiferos.

REVISAO DE LITERATURA

1. CONCEITO DE CELULAS-TRONCO (CT)

As CT sao celulas indiferenciadas que apresentam como caracteristicas: capacidade de proliferacao ilimitada, autorrenovacao, producao de diferentes linhagens celulares e regeneracao de tecidos (3).

A proliferacao das CT ocorre por meio de mitoses sendo responsavel por garantir um numero adequado de celulas-tronco em determinado local do organismo, em um momento especifico de seu desenvolvimento (3).

A autorrenovacao e o processo pelo qual as CT geram copias identicas de si mesmas por meio de sucessivas mitoses, o que significa que o organismo mantem um "estoque" permanente deste tipo celular (6).

A diferenciacao e a capacidade que as CT apresentam de gerar tipos celulares distintos. Nao se sabe exatamente como isso ocorre, mas e possivel afirmar que o processo de diferenciacao e regulado pela expressao preferencial de genes especificos nas CT (6).

A regeneracao de tecidos ocorre quando as CT presentes em diversos locais do organismo recebem sinais especificos para se dividirem e reporem as celulas perdidas se houver lesao tecidual.

Em virtude dessas propriedades peculiares das CT, muitos cientistas buscam a possibilidade de encontrar a cura para diversas enfermidades por meio da substituicao dos tecidos danificados por grupos de CT (7).

2. CLASSIFICACOES DAS CELULAS-TRONCO

De acordo com a potencialidade, ou seja, a capacidade de uma celula originar novos tipos celulares, as CT podem ser classificadas conforme descrito abaixo:

Totipotentes: capazes de gerar todos os tipos celulares embrionarios e extraembrionarios. Ex: zigoto, celulas embrionarias na fase de morula (8).

Pluripotentes: capacidade de diferenciacao em celulas pertencentes aos tres folhetos embrionarios: ectoderma, mesoderma e endoderma, assim como as celulas germinativas primordiais (CGP). Ex: celulas embrionarias derivadas da massa interna do blastocisto (8).

Multipotentes: diferenciacao limitada a determinados tipos celulares. Ex: celulas em estagio posterior ao desenvolvimento fetal e que persistem apos o nascimento (9).

Unipotentes: capacidade de gerar um unico tipo de tecido. Ex: celulas da camada germinativa da epiderme, eritroblastos, espermatogonias dos testiculos (9).

Por outro lado, as CT tambem podem ser classificadas de acordo com a origem:

Embrionarias: obtidas nos estagios iniciais do desenvolvimento embrionario, a partir da massa interna do blastocisto (10).

Adultas: isoladas de orgaos e tecidos diferenciados, como: medula ossea, sangue (periferico ou de cordao umbilical), retina, cornea, cerebro, musculos esqueleticos, polpa dental, figado, pele, tecido adiposo, epitelio gastrointestinal e pancreas (11).

3. CELULAS-TRONCO EMBRIONARIAS (CTE)

3.1. DESENVOLVIMENTO EMBRIONARIO

Apos a penetracao do espermatozoide, o ovulo fecundado adquire a condicao de zigoto. Durante o trajeto pelo corno uterino, o zigoto sofre sucessivas mitoses resultando em um rapido aumento de suas celulas, as quais sao denominadas blastomeros. Estes continuam a divisao celular formando uma esfera compacta denominada morula. Neste estagio, os liquidos da cavidade uterina penetram nos espacos entre os blastomeros e duas populacoes celulares sao distinguidas: a massa celular externa (trofoblasto) e a massa celular interna (embrioblasto). Com o aumento do liquido, os espacos se fundem originando uma unica cavidade conhecida como blastocele. A partir dai, o concepto passa a ser chamado de blastocisto (12).

As CTE encontram-se na massa celular interna (MCI) do blastocisto e dao origem a todos os tipos celulares, sistemas, tecidos e orgaos do individuo em formacao. Ja as celulas da massa celular externa (MCE) originam os anexos embrionarios (12).

3.2. CARACTERISTICAS DAS CELULAS-TRONCO EMBRIONARIAS

As CTE tem como principal caracteristica a pluripotencia. Isso significa que elas possuem a capacidade de originar qualquer tipo celular do organismo, podendo ser induzidas a iniciar um programa de diferenciacao in vitro sem perder a pluripotencia e a capacidade de autorrenovacao, simulando o desenvolvimento normal de um embriao pre-implantado (10, 13, 14).

Em 1981, foram realizados os primeiros cultivos de CT a partir de embrioes de camundongos e, desde entao, novos cultivos foram conduzidos em ratos, humanos e, mais recentemente, em equinos (15-18).

As analises morfologicas, imunoistoquimicas e moleculares permitem identificar uma grande variedade de linhagens embrionarias na massa celular diferenciada, incluindo as hematopoieticas, as neuronais, as endoteliais, as cardiacas e as musculares. Desta maneira, as CTE sao utilizadas como modelo de desenvolvimento embrionario precoce in vitro, o que as tornam um poderoso instrumento de pesquisa para o estudo dos mecanismos de diferenciacao celular e dos efeitos de substancias toxicas e biologicamente ativas no desenvolvimento embrionario (15). Por outro lado, o perfil genetico das CTE apresenta dados controversos. Apesar de muitos genes terem sido identificados, ainda nao ha um consenso entre a comunidade cientifica.

Publicacoes de diferentes grupos demonstraram que, em uma mesma especie, linhagens diferentes apresentavam alto grau de heterogeneidade quanto a sua capacidade de diferenciacao e expressao genica, levando a diferentes respostas quando submetidas aos mesmos tratamentos (19, 20). No entanto, de maneira geral, as celulas pluripotentes apresentam algumas caracteristicas que indicam tratar-se de uma celula indiferenciada, como: a atividade de fosfatase alcalina, presenca do fator de transcricao Oct-4, alta atividade da telomerase e uma variedade de marcadores celulares reconhecidos por anticorpos monoclonais nos antigenos estagio-especificos embrionarios (21). As CTE requerem adesao a uma matriz celular ou extracelular para sobrevivencia e crescimento (22).

3.3. ISOLAMENTO E CULTIVO DAS CTE

As celulas da MCI do blastocisto podem ser isoladas por meio de microcirurgia ou imunocirurgia e transferidas em placas de cultivo previamente preparadas com monocamada de fibroblastos inativados. Tal monocamada de fibroblastos visa o crescimento e sobrevivencia das CTE, pois essas requerem adesao a uma matriz celular ou extracelular (22-24).

Geralmente, as CTE sao cocultivadas com fibroblastos mitoticamente inativos (Fig.1), mas, metabolicamente ativos, permitindo a sintese estavel de receptores e citocinas necessarios ao crescimento das CTE. Para esse fim, sao utilizadas a inativacao quimica por meio de Mitomicina C ou a inativacao por irradiacao gama, que inibem a replicacao do DNA (25).

A Mitomicina C e um agente quimioterapico que evita a separacao da dupla fita de DNA durante a replicacao celular por formar ligacoes covalentes entre as fitas opostas, enquanto a sintese de RNA e de proteinas continua. E capaz de bloquear o ciclo celular em G1, S e G2 enquanto as celulas permanecem viaveis (26). Ja a irradiacao gama quebra as fitas de DNA impedindo a duplicacao do material genetico (27).

Essa camada de fibroblastos inativos contribui com varios fatores essenciais para a manutencao da autorrenovacao das CTE, entretanto, a identidade bioquimica desses e desconhecida. Acredita-se que seja um conjunto de fatores de crescimento, moleculas de superficie celular, matriz extracelular e neutralizantes de produtos toxicos e metabolitos produzidos pelas CTE (28). Por outro lado, pesquisadores identificaram o LIF (Fator inibidor de leucemia) como sendo um fator liberado por fibroblastos embrionarios murinos (29).

Fibroblastos secretam promotores da manutencao do estado indiferenciado como o fator de crescimento fibroblastico (FGF), fator de crescimento transformante P (TGFP), activinas, proteinas WNT e antagonistas da sinalizacao de proteinas morfogeneticas osseas (BMP).

No cultivo de CTE humanas, a monocamada de fibroblastos murinos pode ser substituida por celulas do parenquima da glandula mamaria, fibroblastos fetais, celulas endometriais uterinas, celulas musculares fetais e epiderme adulta de humanos (29).

O LIF atua em um receptor especifico que ativa o transdutor de sinal gp130, o qual atua em duas vias de sinalizacao intracelular: JAK-STAT e Shp-Erk2 (30). A ativacao do fator de transcricao STAT3 e suficiente para a manutencao da pluripotencia em relacao a via Shp-Erk2. A ativacao de STAT3 e essencial para a manutencao da pluripotencia, mesmo sem a presenca de LIF (31, 32).

As CTE de camundongos podem ser mantidas indiferenciadas quando cultivadas em meio de cultivo com adicao do LIF (Fig.2). O efeito do LIF consiste em ativar o fator STAT3 indispensavel para a continuacao da multiplicacao de celulas indiferenciadas. Possivelmente, os fatores de transcricao Oct-4 e STAT3 interagem afetando a funcao dos mesmos genes (33, 34).

Estudos preliminares demonstraram que celulas da MCI de blastocistos bovinos apresentam receptores para LIF. No entanto, a presenca da LIF nao auxiliou no estabelecimento e manutencao de CTE em outros ungulados (35). De fato, existe um efeito deleterio da adicao de LIF ao cultivo de CTE em bovinos. Da mesma maneira, outros fatores de crescimento que suprimem a diferenciacao de CTE murinas, como o bFGF, EGF e IGFs, nao sao capazes de inibir a diferenciacao de CTE de suino. Acredita-se que o bFGF atua na fosforilacao da tirosina de varias proteinas e ativacao da sinalizacao extracelular das kinases ERK1/2 (36).

Porem, a remocao dos fibroblastos e de LIF e seu cultivo em suspensao podem induzilas a entrar em um programa de diferenciacao in vitro de forma sincronizada. Nestas condicoes, as CTE formam espontaneamente agregados de celulas diferenciadas chamados "corpos embrioides" (EB=embryoid bodies), simulando o desenvolvimento de um embriao pre-implantado. Nos primeiros dois a quatro dias de cultura em suspensao, observa-se a formacao de endoderma na superficie dos agregados de CTE. Apos mais alguns dias em cultura, forma-se uma cavidade cistica, celulas do endoderma e ectoderma se desenvolvem e, a seguir, uma serie de linhagens embrionarias podem ser caracterizadas, incluindo linhagens hematopoietica, neuronal, endotelial, cardiaca e muscular (37).

Assim, a diferenciacao de CTE em cultura em suspensao representa um modelo in vitro poderoso para o estudo da determinacao das linhagens embrionarias durante o desenvolvimento mamifero. O potencial pluripotente pode ser avaliado in vitro pela inducao da diferenciacao celular. Um metodo simples de se verificar a diferenciacao espontanea e o cultivo por um periodo superior a sete dias sem que as celulas sejam replicadas (38). No entanto, a melhor maneira de caracterizar a pluripotencia de CTE e a inducao de sua diferenciacao para linhagens celulares com origem ectodermal, mesodermal e endodermal (39).

Estrategias diferentes tem sido utilizadas para inducao da diferenciacao in vitro das CTE. As CTE se diferenciam espontaneamente em celulas derivadas das 3 camadas embrionarias: endoderme, mesoderme e ectoderme pela formacao dos corpos embrioides. A maior parte dos metodos para diferenciacao das CTE utiliza o plaqueamento dos corpos embrioides em placas cobertas de gelatina, na ausencia de monocamada de suporte e suplementacao com fatores de crescimento e/ou fatores indutores de diferenciacao.

E importante ressaltar que a habilidade dos pesquisadores em manipular de maneira eficiente as CTE para diferenciacao em celulas especificas, permitira a criacao de uma fonte ilimitada de celulas que poderao ser usadas nao apenas para o crescimento de tecidos implantaveis, mas tambem para testar novas drogas para cura de enfermidades e identificar genes com potencial problematico (2, 40, 41).

3.4. MARCADORES DE PLURIPOTENCIA DAS CTE

De maneira geral, as celulas pluripotentes apresentam algumas caracteristicas que indicam tratar-se de uma celula indiferenciada, como: atividade de fosfatase alcalina, presenca do fator de transcricao Oct-4, alta atividade da telomerase e uma variedade de marcadores celulares reconhecidos por anticorpos monoclonais nos antigenos estagio-especificos embrionarios (21).

Em embrioes de ratos, a pluripotencia e mantida primariamente pelos seguintes genes: POU5F1 (denominado de Oct-4), Sox-2 e Nanog. Esses genes sao ativados por fatores de transcricao proprios que tambem se ligam a genes responsaveis em codificar componentes que irao inibir vias essenciais para o desenvolvimento. A expressao de Oct-4 e considerada um marco fundamental para a identificacao de celulas pluripotentes de rato. O Oct-4 e expresso em celulas pluripotentes durante as clivagens, na massa celular interna, no epiblasto em inicio da fase pos-implantacao do embriao e em celulas-tronco embrionarias em cultivo (42, 43).

Apesar de o gene Oct-4 ser necessario para manutencao da pluripotencia de CTE em ratos, o mesmo padrao nao e apresentado em outras especies. Genes ortologos de Oct-4 com alta homologia de sequencia, assim como regioes reguladas pela proteina, foram identificadas em varias especies de mamiferos (44). No entanto, blastocistos humanos em diferentes estagios apresentam diferentes niveis de expressao do Oct-4. Alem disso, diferentes laboratorios demonstraram que a proteina Oct-4 e expressa tanto pela MCI como pelo trofectoderma em embrioes de ungulados (35).

Por meio da imunoistoquimica, a expressao do Oct-4 foi estudada em blastocistos produzidos in vitro e in vivo nas especies murina, suina e bovina. Em camundongos, a expressao do Oct-4 foi restrita a MCI, enquanto em suinos (7 dias apos a fertilizacao) e bovinos (8 dias apos a fertilizacao), sua expressao foi observada tanto na MCI quanto no trofectoderma, nao havendo diferencas entre embrioes produzidos in vitro e in vivo. Esses dados corroboram com a literatura, segundo os quais, houve expressao de Oct-4 na MCI e trofectoderma de blastocistos caprinos produzidos in vivo. Concluiu-se, portanto, que existe marcada diferenca na regulacao do Oct-4 entre camundongos e animais domesticos (45, 46).

Por outro lado, o Nanog parece ser um bom candidato a marcador de pluripotencia em ruminantes, pois estudos detectaram o mRNA para o Nanog e a proteina na MCI de embrioes de caprinos, sendo que estes estavam fortemente reprimidos no trofectoderma (47). O gene Nanog tambem tem se mostrado muito importante, pois a ausencia de sua transcricao induz a diferenciacao celular para linhagens de endoderme extraembrionaria, enquanto uma expressao 50 a 60% menor induz a geracao de varios tipos de tecidos, ativando genes da endoderme, mesoderme e ectoderme (48). Sua hiperexpressao permite o crescimento em sistemas livres do cocultivo e melhora a eficiencia na producao de celulas clones (49).

O Sox-2 e um fator de transcricao que e essencial para a manutencao de autorrenovacao das celulas do embriao indiferenciado e de celulas estaminais. Este gene codifica um membro da familia de fatores de transcricao envolvidos na regulacao do desenvolvimento embrionario e na determinacao do destino da celula. A proteina transcricional codificada pode atuar como um ativador apos formar um complexo proteico com outras proteinas. O Sox-2 e um dos principais fatores de transcricao exigido em celulas-tronco com pluripotencia induzida. Um grupo de pesquisadores concluiu que o principal papel do Sox-2 em celulas-tronco pluripotentes e controlar a expressao de Oct-4, sendo que estes genes perpetuam a sua propria expressao, quando expressos espontaneamente (50).

As CTE da especie equina apresentam marcadores em sua superficie celular como antigeno estagio especifico 1 (SSEA-1), alem de serem caracterizadas por expressar o fator de transcricao STAT3 e o Oct-4. Esse padrao de expressao difere do encontrado em camundongos e humanos que, por sua vez, tambem diferem entre si. O gene Oct-4 e considerado essencial na formacao da MCI, pluripotencia e renovacao celular nas tres especies citadas (51).

Apesar de compartilharem similaridades quanto a morfologia e alguns marcadores de superficie celular e de expressao genica, as CTE possuem caracteristicas unicas em cada especie. As CTE murinas apresentam colonias espessas com celulas sobrepostas e com bordas nao definidas, enquanto as celulas embrionarias humanas e equinas formam colonias de espessura fina e com bordas bem definidas (17).

A morfologia das celulas, assim como sua capacidade de formar corpos embrioides quando em cultivo, tem sido utilizada como criterio para definir linhagens de CTE. Em bovinos, as CTE devem apresentar tamanho pequeno, aspecto arredondado e alto indice nucleo:citoplasma (52). Esta classificacao e particularmente importante, pois, com frequencia, ocorre a contaminacao do cultivo por celulas do trofectoderma, bem como por celulas do endoderma visceral (hipoblasto). Sendo assim, a caracterizacao de linhagens de CTE de ungulados deve ser acompanhada pela expressao de marcadores especificos para os tipos celulares contaminantes do cultivo, ou seja, transferrina ou a-fetoproteina para deteccao de celulas da endoderme; interferon-tau para deteccao de celulas do trofectoderma de bovinos; citoqueratina para deteccao de celulas da ectoderme, incluindo o trofoblasto. A propagacao continuada de linhagens de CTE inapropriadamente caracterizadas pode induzir os pesquisadores ao erro e, dessa forma, prejudicar a descoberta de condicoes de cultivo mais adequadas ao cultivo de verdadeiras CTE (35).

Como os marcadores convencionais de pluripotencia tem se demonstrado inespecificos em outros ungulados, e importante a utilizacao de outros metodos que confirmem a origem embrionaria das celulas em cultivo (52).

A pluripotencia das CTE pode ser avaliada pela administracao intraperitoneal ou subcutanea dessas celulas indiferenciadas em camundongos imunossuprimidos (SCID mice) resultando na formacao de teratomas. Em suinos, teratomas foram pouco observados (53, 54).

3.5. APLICACAO TERAPEUTICA

O principio da terapia celular consiste em restaurar a funcao de um orgao ou tecido com a substituicao das celulas perdidas por uma enfermidade ou substituir celulas que nao funcionam adequadamente devido a um defeito genetico, vascular ou iatrogenico (3).

A aplicacao das CT na reconstituicao de tecidos nao reparaveis cresce de forma marcante. Enfermidades dos sistemas hematologico (leucemias, linfomas), nervoso (acidente vascular cerebral, esclerose multipla, traumatismo raquimedular) e cardiovascular (infarto do miocardio, insuficiencia cardiaca) sao alvos naturais de interesse (55).

Recentemente, testaram a aplicacao de CTE e CTM (celulas-tronco mesenquimais) para tratamento de tendinite no tendao do musculo flexor digital superficial de equinos. Os resultados revelaram que as CTE apresentaram taxa de sobrevida maior que as CTM, sendo encontradas em todas as areas de injuria tecidual, diferentemente das CTM, que apenas se mantiveram no local onde foram injetadas. Ainda, durante os 90 dias de realizacao do experimento, as CTE nao induziram resposta imune ou formacao de tumores no local de aplicacao (56).

As CTE apresentam evidente potencial de aplicacao em diversas areas da medicina, uma vez que sao capazes de originar todas as celulas de um individuo adulto. Porem, por questoes eticas e de biosseguranca, o uso das CTE para fins terapeuticos ainda encontra-se limitado (55).

CONSIDERACOES FINAIS

Os estudos sobre CTE tem gerado grandes expectativas na area da saude. Entretanto, consideracoes de ordem etica, religiosa, moral, legal e economica sao inevitaveis e geram uma grande polemica no que diz respeito a obtencao dessas celulas.

O desenvolvimento biotecnologico alcancado podera permitir que muitas enfermidades consideradas incuraveis ate a ocasiao, possam ser tratadas com as celulas-tronco embrionarias permitindo uma perspectiva de vida melhor para muitos pacientes. Porem, os resultados ainda sao preliminares tornando-se necessaria muita cautela na execucao e divulgacao de novos resultados, particularmente, para fins terapeuticos.

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Recebido em: 05/12/11

Aceito em: 25/07/12

Aline Silva Rocha [1]

Leandro Maia [2]

Mydian Daroz Guastali [1]

Rodrigo Volpato [3]

Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga [4]

[1] Mestranda do Departamento de Reproducao Animal e Radiologia Veterinaria da Faculdade de Medicina Veterinaria e Zootecnia da UNESP/Botucatu.

Distrito de Rubiao Junior s/n, Depto de Reproducao Animal e Radiologia Veterinaria da Faculdade de Medicina Veterinaria e Zootecnia da UNESP, CEP: 18618-000. Botucatu/SP. Fone/Fax: (014) 3811-6249. aline-srocha@hotmail.com

[2] Doutorando do Departamento de Clinica Veterinaria da Faculdade de Medicina Veterinaria e Zootecnia da UNESP/Botucatu

[3] Doutorando do Departamento de Reproducao Animal e Radiologia Veterinaria da Faculdade de Medicina Veterinaria e Zootecnia da UNESP/Botucatu

[4] Docente do Departamento de Reproducao Animal e Radiologia Veterinaria da Faculdade de Medicina Veterinaria e Zootecnia da UNESP/Botucatu
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Author:Rocha, Aline Silva; Maia, Leandro; Guastali, Mydian Daroz; Volpato, Rodrigo; Alvarenga, Fernanda da
Publication:Veterinaria e Zootecnia
Date:Sep 1, 2012
Words:4747
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