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Consideraciones importantes acerca de la produccion in vitro de embriones equinos.

Important considerations about in vitro production of equine embryos *

Consideracoes importantes sobre a producao in vitro de embrioes equinos

Introduccion

La biotecnologia reproductiva permite aumentar la eficiencia reproductiva de los animales mediante el aprovechamiento de sus rasgos geneticos de valor, en la busqueda de un mayor beneficio productivo y rentable para el hombre. Hay evidencias que demuestran que la biotecnologia reproductiva no es una herramienta nueva en la relacion del hombre con los animales, dado que algunos pueblos de Asia Menor alrededor del 2.500 A.C, la utilizaban de forma empirica, castrando los machos que no reunian las condiciones requeridas como reproductores (32).

Para la especie equina se han implementado biotecnologias reproductivas como la inseminacion artificial, la transferencia de embriones, la produccion in vitro de embriones (PIVE) y la clonacion, sin embargo las tasas de exito para algunas de ellas, se han visto limitadas ya sea por restricciones de tipo tecnico, o por barreras de tipo fisiologico propias de dicha especie. La inseminacion artificial y la transferencia de embriones han logrado un posicionamiento significativo en las practicas reproductivas equinas en paises desarrollados donde esta explotacion es altamente relevante, sin embargo la difusion de estas biotecnologias en los denominados paises en desarrollo es aun muy escasa para el gremio de los productores.

Para el caso de la clonacion son varios los reportes de exito desde los primeros nacimientos de equinos clonados en 2003, a pesar de esto, la tecnica sigue siendo altamente ineficiente con menos de un 3% de casos exitosos (44). Para la PIVE en equinos, aunque el exito ha sido menor comparado con la PIVE en otras especies (8), se han logrado valiosos avances en paises como Estado Unidos, Italia, Holanda y Francia, donde diversos estudios se han realizado para tratar de mejorar la eficiencia de la tecnica, evaluando los diferentes factores que pueden interferir en los resultados de la misma (17, 22, 29). Dentro de las principales limitantes planteadas para este procedimiento, estan la baja disponibilidad de oocitos, la baja competencia para el desarrollo de los oocitos usados (8), las dificultades para alcanzar altas tasas de fertilizacion in vitro, y sobretodo en el ambito comercial, los altos costos tecnicos que involucra.

En el desarrollo in vitro de embriones equinos han sido evaluadas diferentes alternativas como los cocultivos celulares (40) y la suplementacion de los medios con moleculas como gonadotropinas, factor de crecimiento insulinoide I (IGF-I) (7), factor de crecimiento epidermal (EGF) (31), hormonas esferoidales, suero fetal bovino (7, 14), glucosa (9), BSA y aminoacidos (21). A pesar de esto, la eficiencia de la tecnica aun es limitada respecto a la obtencion de embriones viables para los procedimientos de reproduccion asistida en esta especie. El objetivo de esta revision es estudiar algunas consideraciones importantes acerca de la produccion in vitro de embriones equinos y las perspectivas futuras de investigacion y aplicacion en el campo de la biotecnologia.

La biotecnologia y produccion de embriones equinos in vitro

Una variedad de tecnicas de reproduccion asistida han sido implementadas en la reproduccion equina. La fertilizacion in vitro (FIV), la transferencia de oocitos y embriones, la inyeccion intracitoplasmatica de espermatozoides (ICSI), y la transferencia nuclear han sido desarrolladas con gametos equinos. Sin embargo la baja eficiencia de estos procedimientos ha impedido su aplicacion comercial (42). El primer reporte de fertilizacion in vitro en equinos se dio en 1989 (4), y la mayoria de las investigaciones reportan tasas de fertilizacion in vitro de oocitos equinos entre 4 y 33% (5, 47).

Las tecnicas de maduracion in vitro (MIV) de oocitos, de FIV convencional, y de cultivo de cigotos hasta el estado de blastocistos han sido inadecuadas para la especie equina (41). Se ha reportado escasos nacimientos de potros por FIV convencional, mientras con la implementacion de ICSI (21, 30), multiples nacimientos han sido logrados principalmente por transferencia de cigotos post-clivaje, y en menor medida por la transferencia de blastocistos producidos in vitro (15,35,41).

Un estimado adecuado de la competencia de los oocitos esta dado por su habilidad para desarrollarse en blastocistos, y luego por la capacidad de estos embriones para establecer una gestacion que conduzca al nacimiento de una cria viable (20). La produccion in vitro de embriones equinos ha tenido un exito limitado, posiblemente relacionado con la baja competencia para el desarrollo de los oocitos usados (8), la cual es influenciada no solo por el ambiente de cultivo, sino tambien por las condiciones de maduracion de los mismos (20).

Una de las dificultades en el desarrollo de estudios de PIVE para la especie equina es la limitada disponibilidad de oocitos, dado que una de las principales fuentes para su obtencion son las plantas de faenado equino, las cuales son poco comunes en muchos paises respecto aquellas dedicadas al sacrificio bovino y de otras especies. Adicionalmente la fisiologia ovarica de esta especie limita el numero de foliculos presentes en el ovario, por lo cual se hace necesario recurrir a tecnicas como aspiracion folicular, la diseccion de foliculos y el raspado de la pared folicular de los ovarios (22, 24) con el fin de maximizar el numero de estructuras recuperadas.

La maduracion in vitro y la suplementacion de los medios

Las tasas de MIV de oocitos equinos son del 50% al 75%, las cuales son menores a las obtenidas en otras especies (40). Para ganar en el entendimiento de las razones por las cuales las tasas de maduracion de oocitos equinos son bajas, y para seleccionar poblaciones de oocitos capaces de madurar in vitro, se ha planteado el uso de la aspiracion transvaginal guiada por ultrasonido. Sin embargo la coleccion de oocitos por este metodo solo produce 0.7 oocitos por ciclo (22).

Goudet et al. (1998) (23) realizaron aspiracion folicular a un grupo de yeguas que se encontraban en diferentes etapas del ciclo estral, y evaluaron la competencia de los oocitos para la maduracion; encontrando que los oocitos obtenidos de yeguas finalizando la fase folicular, tienen una tasa de maduracion mayor (51%), a diferencia de las encontradas en yeguas en fase lutea (34%), y durante la fase folicular (15%).

Son multiples los factores relacionados con las condiciones de cultivo in vitro, que afectan la maduracion, la fertilizacion y el desarrollo embrionario. La duracion ideal de la MIV para lograr tasas optimas de FIV es aun un parametro en discusion (27), Hinrichs et al. (1993) (28), determinaron que no existe un efecto significativo de la duracion de la MIV (24 o 42h) sobre la tasa de FIV. El estado de compactacion de la granulosa en oocitos inmaduros tambien es un aspecto importante, dado que los oocitos con un cumulos compacto toman mas tiempo en madurar que los oocitos con un cumulos expandido (26, 28, 45), adicionalmente, las tasas de maduracion nuclear son superiores en oocitos expandidos respecto a los oocitos con cumulus compacto (9), y las tasas de FIV para los primeros han sido igualmente reportadas como superiores (30% vs. 14%) 2.

La composicion de los medios para la MIV de oocitos equinos es en la actualidad uno de los aspectos mas relevantes a analizar. Se han evaluado alternativas como la suplementacion del medio de MIV con celulas de la granulosa, dado que existen antecedentes en el mejoramiento de las tasas de maduracion para oocitos bovinos y porcinos. Sin embargo, resultados de investigaciones realizadas por Sepulveda et al. (2003) (40), no arrojaron diferencias respecto a la utilizacion de medios de maduracion libres de celulas de la granulosa.

Cuando los oocitos son madurados con un 20% de fluido folicular han sido incrementadas las tasas de FIV despues de ICSI, mas no para el caso de la FIV tradicional (18). Se reportan tasas de produccion in vivo de blastocistos a partir de oocitos MIV del 17% (46), y tasas de prenez del 10% (39), por lo que se han asociado las bajas tasas de FIV con la MIV, por lo cual es necesario mejorar la competencia de los oocitos en la maduracion.

Aguilar et al. (2007) (1) evaluaron la maduracion nuclear en oocitos madurados in vitro en medios suplementados con TCM-199 o fluido folicular (FF), y la habilidad de desarrollo de los embriones despues de ser transferidos a las yeguas. Encontrando que el porcentaje de oocitos que avanzaron en la meiosis hasta metafase II, fue significativamente superior para el medio con FF (77.3%), respecto al medio con TCM-199 (46.8%). Despues de realizar la transferencia, fueron pocos los oocitos madurados en FF y fertilizados in vivo que desarrollaron embriones in vivo (4.4%, 3/68), mientras en el caso de los oocitos madurados en TCM-199, no se desarrollaron embriones (0/58). En estudios realizados por Hinrichs et al. (1993) (28), encontraron que para la MIV de oocitos equinos en 100% fluido folicular (FF) se alcanzan mayores tasas de FIV 13-24%, respecto al uso de medio de maduracion con 20% de FF (0-12%).

Lydia et al. (33) sugieren que la adicion de suero de yegua en estro y de FF en el medio TCM-199 mejora los resultados en terminos de la proporcion de oocitos que alcanzan la madurez.

Otras moleculas han sido identificadas como relevantes en la composicion de los medios y por ende en los resultados de la PIVE en equinos. El IGF-I ha sido demostrado como un suplemento que mejora la maduracion nuclear y citoplasmatica de oocitos equinos segun la suplementacion hormonal realizada (7). El factor de crecimiento epidermico (EGF) ha demostrado promover la maduracion de oocitos. Al cultivar oocitos en medio TCM199 durante 36 horas y posteriormente someterlos al cultivo con EGF y dos inhibidores especificos de tirosina quinasa, se obtiene que los oocitos cultivados presentan un aumento significativo en la incidencia de la etapa de metafase II (70.4%), comparados con el tratamiento libre de EGF (22.5%) (31). Por otro lado se ha demostrado que la interleucina 1 (IL-1) induce la maduracion de oocitos, pero reduce la tasa de prenez 14 dias despues de la ovulacion, mientras en evaluaciones in vitro se encontro que la IL-1[beta] no tiene un efecto positivo en la maduracion y que por el contrario puede interferir con la fecundacion y desarrollo embrionario temprano (6).

Para el caso de la hormona del crecimiento (GH), se encontro que su adicion al medio de MIV, aumenta la expansion de las celulas del cumulo, dado que en una investigacion con oocitos recolectados por aspiracion folicular guiada por ultrasonido, se observaron porcentajes de expansion del cumulo del 29% (14/48) cuando se adiciono la GH, y del 13% (6/47) cuando se realizo el proceso en ausencia de esta (34).

Factores que afectan la fertilizacion in vitro de oocitos equinos

Desde la primera fertilizacion in vitro exitosa de oocitos equinos madurados in vitro, reportada por Del Campo et al. (1990) (16), se han explorado diversas alternativas con el fin de incrementar la produccion de embriones por esta via. Hasta el desarrollo de la fertilizacion por ICSI, las tasas de desarrollo in vitro de embriones equinos fue muy reducida, por lo cual se hizo necesaria la combinacion de procesos in vitro e in vivo durante para mejorar las tasas de produccion de embriones y la obtencion de gestaciones a termino.

Con el fin de incrementar la habilidad de FIV en los oocitos equinos, se ha planteado que la maduracion citoplasmatica debe darse de una manera paralela a la maduracion nuclear (22), para lo cual ha sido descrito como fundamental, el estimulo de la hormona luteinizante (LH), dado que en condiciones naturales, el desarrollo de los oocitos no puede continuar hasta que los foliculos maduros en el estado preovulatorio son estimulados por dicha hormona, la cual induce la maduracion del oocito y la ovulacion (43).

Al observar reaccion acrosomica en espermatozoides equinos, despues de tratamientos de capacitacion de semen, y tras reportes de la observacion de la union espermatozoide-zona, la principal barrera para la FIV en equinos parece ser la penetracion de la zona pelucida en oocitos madurados in vitro, por el endurecimiento espontaneo de la misma, por una liberacion prematura de los granulos corticales demostrada para los oocitos equinos (17), por lo cual se ha experimentado con la remocion parcial o completa de la zona pelucida (12). Algunas alternativas como la maduracion de oocitos in vivo, y la fertilizacion por ICSI han sido instauradas en la busqueda de mejorar las tasas de FIV (18, 19, 24). Choi et al. (2002) (11) encontraron que la competencia de desarrollo in vivo e in vitro de oocitos fertilizados mediante ICSI con espermatozoides frescos, congelados-descongelados, y sin tratamiento de activacion, no presenta diferencias significativas. Bedford et al. (2004) (3) encontraron que la implementacion de ICSI resulta en la induccion de oscilaciones en la liberacion de calcio requerido para la activacion del oocito durante la fertilizacion y su posterior desarrollo embrionario.

Al igual que para la optimizacion de la MIV, para la FIV en equinos se ha evaluado la influencia de diversas moleculas sobre la tasa de FIV. Choi et al. (2003) (10) evaluaron el efecto del polivinilalcohol (PVA) y la albumina serica bovina (BSA) sobre la penetracion de oocitos con zona pelucida parcialmente desnuda, encontrando que el porcentaje de oocitos fertilizados con espermatozoides tratados con PVA (54%, 23/43) fue mayor que los tratados con BSA (11%, 5/43).

Un estudio reciente demuestra la importancia de la capacitacion y la hiperactivacion de los espermatozoides para el logro de una FIV convencional exitosa, al realizar la induccion de estos fenomenos mediante el uso de procaina, alcanzando porcentajes de fertilizacion de oocitos equinos hasta del 60.7% (36).

Condiciones para el cultivo in vitro de embriones equinos

El cultivo in vitro (CIV) de embriones equinos ha tenido bajo exito comparado con el logrado con embriones de otros animales domesticos (9) Diferentes enfoques han sido explorados para el mejoramiento del CIV. El cocultivo de cigotos con celulas somaticas, y el cultivo de estos en medios definidos libres de celulas como fluido oviductal sintetico (SOF) y medio Eagle Dulbecco modificado (DMEM) han producido bajos porcentajes de cigotos promedio del 15% (9, 21). Choi et al. (2000) (13) no observaron diferencias en las tasas de desarrollo de embriones, al comparar un medio condicionado con trofoblasto con un medio quimicamente definido para el cultivo de cigotos equinos. Las tasas de desarrollo fueron bajas (<5%).

Pocos trabajos han sido desarrollados sobre el efecto de factores especificos del medio para el desarrollo de embriones equinos in vitro. En estudios recientes una variedad de medios han permitido un buen desarrollo de embriones de 4 dias (8 a 16 celulas), y han sido alcanzadas tasas de blastocistos del 25% al 35% usando medios de cultivo como medio DMEM/ F-12 con 10% de suero fetal bovino, en una mezcla de gases de 5% O2, 5% CO2 y 90% N2, a 38.2[grados]C. De igual forma el desarrollo de embriones equinos en morulas y blastocistos ha sido mayor en medio SOF modificado y suplementado con 1.5 mM de glucosa, y por el cultivo inicial en SOF modificado con la transferencia aproximadamente al dia 5 a medio DMEM/ F-12 (25).

Potros obtenidos mediante las tecnicas de produccion in vitro e ICSI han sido conseguidos de la transferencia de embriones tempranos en los oviductos de receptoras (36). Sin embargo, es deseable el logro de un sistema completo que soporte el desarrollo de embriones equinos por produccion in vitro, transferibles a nivel uterino antes que para transferencia oviductal. Dado que las tasas maximas de gestacion (50%) han sido alcanzadas por transferencia de cigotos derivados de ICSI al oviducto de yeguas tratadas con progesterona (21, 42)

Conclusiones

Para lograr el nacimiento de crias vivas a partir de embriones resultantes de procedimientos de reproduccion asistida para la especie equina, ha sido necesario el avance de las tecnicas de produccion de embriones, desde la combinacion de procesos in vivo e in vitro, y la obtencion hace apenas dos decadas de los primeros embriones equinos producidos totalmente in vitro, hasta los recientes avances en las tecnicas de fertilizacion y cultivo embrionario.

Con el uso de diversidad de sustancias, condiciones de cultivo e instrumentos tecnologicos se ha pretendido mejorar cada vez las tasas de maduracion, fertilizacion y desarrollo embrionario, con lo cual se ha incrementado sin duda la calidad embrionaria, los resultados de la fertilizacion, y por ende la eficiencia en la produccion de embriones viables.

Entre los metodos para la fertilizacion, la tecnica ICSI ha demostrado ser la alternativa mas viable para mejorar las tasas de fertilizacion, sin embargo sus altos costos y necesidades de especializacion tecnica, se convierten en una restriccion sobretodo para la difusion comercial de este proceso.

Los medios de desarrollo embrionario para equinos requieren aun ser lo suficientemente estudiados, dado que los componentes exitosos en la produccion de embriones de otras especies animales no siempre son los optimos para los embriones equinos, lo que sugiere que deberan ser maximizados los esfuerzos investigativos futuros para el mejoramiento de la tecnica y sus resultados.

La produccion in vitro de embriones equinos es una biotecnologia que podra ayudar a incrementar la eficiencia reproductiva, sobretodo en los paises con sectores pecuarios avidos de crecimiento, siempre y cuando se logre maximizar la difusion y comercializacion de la tecnica y sus resultados, para diseminar la genetica de alta calidad productiva, y preservar las caracteristicas geneticas de los animales.

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* Para citar este articulo: Restrepo G, Restrepo S. 2011. Consideraciones importantes acerca de la produccion in vitro de embriones equinos. Rev CES Med Vet Zootec. Vol 6 (1): 55-63

Giovanni Restrepo Betancur [1] **, MV, Zoot, MSc; Sara Restrepo Escobar [2], Ing. Agrop.

** Autor para correspondencia: Giovanni Restrepo Betancur. Carrera 48 No 7-151 Medellin - Colombia. Correo electronico: grestrepo@elpoli.edu.co

[1] Politecnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid; Facultad de Ciencias Agrarias; Grupo de Investigacion en Biotecnologia Animal (GIBA).

[2] Politecnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid, Facultad de Ciencias Agrarias, Grupo de Investigacion en Biotecnologia Animal (GIBA), Ingeniera Agropecuaria.

(Recibido: 6 de junio, 2010; aceptado: 23 de marzo, 2011)
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Title Annotation:Texto en Portuguese
Author:Restrepo Betancur, Giovanni; Restrepo Escobar, Sara
Publication:Revista CES Medicina Veterinaria y Zootecnia
Date:Jan 1, 2011
Words:4818
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