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Concentraciones de alcaloides, glucosidos cianogenicos, polifenoles y saponinas en plantas medicinales seleccionadas en Ecuador y su relacion con la toxicidad aguda contra Artemia salina.

Concentrations of alkaloids, cyanogenic glycosides, polyphenols and saponins in selected medicinal plants from Ecuador and their relationship with acute toxicity against Artemia salina.

Las plantas con propiedades medicinales han estado relacionadas estrechamente con el surgimiento y desarrollo de la civilizacion humana en diferentes zonas geograficas y han sido reconocidas por la Organizacion Mundial para la Salud (OMS, 2002) para el tratamiento de diversas enfermedades. En ese sentido, Ecuador, se caracteriza por ser uno de los paises, a nivel mundial, con mayor biodiversidad y riqueza en conocimientos ancestrales relacionados con el uso de las plantas medicinales (Bailon-Moscoso, Romero-Benavides, Tinitana-Imaicela, & Ostrosky-Wegman, 2015).

Estudios precedentes han sugerido que entre las plantas medicinales mas usadas en Ecuador se encuentran: Artemisia absinthium, Cnidoscolus aconitifolius, Parthenium hysterophorus Linn, Piper carpunya Ruiz & Pav y Taraxacum officinale (Aguirre-Mendoza, Linares-Palomino, & Peter Kvist, 2006; Ceron, 2006; Sanchez, Kvist, & Aguirre, 2006). Estas especies vegetales poseen propiedades que promovieron estudios a nivel internacional para validar su uso tradicional y explorar nuevas potencialidades biologicas.

Taraxacum officinale (F. Asteraceae) ha mostrado propiedades como diuretico, estimulante digestivo, estimulante de la insulina, modulador de la inflamacion, y en el tratamiento de cancer de mama y utero (Koo et al., 2004; Yarnell & Abascal, 2009; You et al., 2010). Artemisia absinthium (F. Asteraceae) es utilizada desde la antiguedad como un antipiretico, antihelmintico, diuretico y como analgesico para el tratamiento de dolor de estomago (Canadanovic-Brunet, Djilas, Cetkovic, & Tumbas, 2005). Cnidoscolus aconitifolius (F. Euphorbiaceae) es una planta facil de cultivar con alta productividad en varias partes de la region suramericana y tiene un alto valor nutritivo (Ross-Ibarra & Molina-Cruz, 2002), por lo que es usada, comunmente, tanto para propositos medicinales como alimenticios (Escalante-Erosa, Ortegon-Campos, Parra-Tabla, & Pena-Rodriguez, 2004). Las hojas de Piper carpunya (F. Piperaceae) son ampliamente utilizadas en la medicina popular en los paises tropicales y subtropicales de America del Sur como tratamiento de inflamaciones, ulceras y diarreas (Quilez et al., 2010). Parthenium hysterophorus (F. Asteraceae) ha mostrado efectos citotoxicos frente a A. salina (Al-Mamun, Hamid, Islam, & Chowdhury, 2010) y es usada para el tratamiento de llagas ulceradas, inflamaciones y enfermedades cardiovasculares (Madan, Gogia, & Sharma, 2011), diabetes (Patel, Chitra, Prassanna, & Krishnaraju, 2008), como antibacterial (Pandey, 2007) y tambien ha demostrado tener actividad antitumoral (Reddy et al., 2011).

Para la determinacion de las propiedades de las plantas medicinales, la combinacion de evaluaciones fitoquimicas y biologicas es usada frecuentemente en el estudio de plantas medicinales, ya que de esta forma se correlaciona la composicion quimica con el potencial biologico de drogas y sus extractos. Entre las pruebas biologicas, el bioensayo de la Artemia salina se ha empleado en la evaluacion preliminar de extractos y productos aislados de plantas, demostrando ser util, rapido y sencillo (McLaughlin & Lingling, 1998; Meyer et al., 1982; Parra, Silva, Guerra, & Iglesia, 2001; Pino & Lazo, 2010; Silva, Nascimento, Batista, Agra, & Camara, 2007). Por otra parte, los analisis fitoquimicos permiten cuantificar los metabolitos secundarios, entre estos estan los alcaloides, los polifenoles, los glucosidos cianogenicos y las saponinas, los cuales tienen diversas funciones en las plantas; una de ellas es la defensa a una variedad de patogenos (Bennett & Wallsgrove, 1994; Francisco & Pimenta, 2000; Iriti & Faoro 2009; Mazid, Khan, & Mohammad, 2011). Ademas, los metabolitos secundarios son los responsables de la actividad medicinal de las plantas (Savithramma, Linga, & Suhrulatha, 2011). Es importante destacar que son pocos los estudios, tanto biologicos como fitoquimicos, que muestran el gran potencial de las especies vegetales de Ecuador, las cuales son usadas debido a los conocimientos ancestrales (Bailon-Moscoso et al., 2015).

Al considerar que los enfoques de las investigaciones acerca de los metabolitos secundarios presentes en las plantas son hacia la busqueda de nuevas sustancias con propiedades antitumorales, esta investigacion tuvo como objetivo determinar las concentraciones de alcaloides, fenoles totales, taninos, glucosidos cianogenicos y saponinas, y correlacionarlas con el efecto citotoxico, a traves del bioensayo contra el crustaceo Artemia salina.

MATERIALES Y METODOS

En febrero 2014, las plantas Cnidoscolus aconitifolius, Parthenium hysterophorus y Piper carpunya se recolectaron en la provincia El Oro (3[grados]19' 36.84" S - 79[grados]48' 17.64" W), la planta Artemisia absinthium en la provincia Azuay (2[grados]44' 0" S - 78[grados]50' 0" W) y la planta Taraxacum officinale en la provincia Pichincha (0[grados]1' 22.8" N - 78[grados]53' 31.2" W) de Ecuador. De cada planta se utilizaron solo las hojas, que fueron lavadas con agua destilada y escurridas en un secador artesanal abierto (malla de 8 mm de diametro, en un soporte tipo mesa de acero inoxidable de 150 largo x 60 ancho x 120 cm de alto), por ocho horas, a la temperatura (22 [+ o -] 2[grados]C) del laboratorio. Posteriormente, fueron llevadas a la estufa (MEMMERT SNB 400 con flujo de aire) a 37[grados]C por 24 horas, para el proceso de secado. Seguidamente, se pulverizaron con un molino (Lab. Mill serial No. 56969, Type AR 400 Erweka[R], Germany) y se tamizaron a [menor que o igual a] 1 mm (OMS, 1999).

Obtencion del extracto alcoholico: Para la obtencion del extracto alcoholico, se procedio a macerar separadamente 20 g de material vegetal molido con 100 mL de etanol al 70 %, a temperatura ambiente, durante 48 horas; luego, se las muestras se filtraron al vacio.

Determinacion de fenoles totales y taninos: Se utilizo el metodo sugerido por Velasquez (2004) y Elena (2012), con algunas modificaciones. Para la curva de calibracion, se prepararon una serie de soluciones patron de acido galico, con concentraciones de 0, 10, 20, 30, 40 y 50 mg/L. Del extracto alcoholico anterior se tomo 1mL y se diluyo hasta 50 mL con etanol. Se tomaron 2 mL de esta dilucion y se mezclaron con 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteu, se agito y se dejo en reposo durante cinco minutos. Luego se le anadieron 0.5 mL de carbonato de sodio al 5 %, la solucion se agito y se llevo a un volumen de 10 mL con agua destilada. Despues de 30 minutos de reaccion, se hicieron las determinaciones espectrofotometricas a 700 nm. Posteriormente, para garantizar el secuestro de los taninos, 20 mL del extracto diluido se mezclaron con 10 mL de una solucion de gelatina al 10 %, 20 mL de la disolucion acida de NaCl y 2 g de caolin en polvo. La mezcla fue agitada durante unos 5 minutos, luego se dejo sedimentar para filtrar el decantado a traves de un papel filtro Whatman # 42. Con el liquido filtrado se procedio de la misma forma que lo mencionado arriba con el reactivo de Folin Ciocalteu. Por la diferencia de ambos productos se determino la concentracion de taninos. Todos los analisis fueron hechos por triplicado. Los resultados fueron expresados como mg equivalentes a acido galico/g de material seco de planta.

Determinacion cuantitativa de alcaloides: Se utilizo el metodo basado en la reaccion con verde de bromocresol (BCG) (Shamsa, Monsef, Ghamooshi, & Verdian-rizi, 2008; Ajanal, Gundkalle, & Nayak, 2012), a partir de una solucion de atropina (1 mg/mL), diluida 1:10, se prepararon seis soluciones (0.01-0.1 mg/mL) para la elaboracion de la curva de calibracion. Para las determinaciones en los extractos de las hojas de las plantas, 5 mL de cada extracto se transfirieron a un embudo de separacion, al cual se le agregaron 5 mL de solucion de BCG y 5 mL una solucion buffer de fosfato a pH 4.7. La mezcla se agito, y el complejo formado fue extraido con cloroformo. Los extractos se recogieron en un matraz aforado de 10 mL y se completo a ese volumen con cloroformo. Todo este proceso fue realizado por triplicado para cada extracto de hojas de planta. Las absorbancias del complejo en cloroformo fueron medidas a una longitud de onda de 470 nm en un espectrofotometro UV-Vis (Shimadzu, mini-1240).

Determinacion cuantitativa de glucosidos cianogenicos: Se confirmo cualitativamente la presencia de glucosidos cianogenicos a traves del cambio de color de amarillo a rojo, o rojo amarillento, debido a la liberacion del HCN, en el papel impregnado con una solucion de acido picrico carbonatado (1 g de carbonato de sodio + 100 mg de acido picrico y agua hasta 10 mL), con el que se cubrio la parte superior del tubo de ensayo que contiene el material vegetal fresco con 1.5 mL de agua y seis gotas de tolueno (Singh, 2010), y dejado a temperatura ambiente por 2 h. La intensidad del color picro sodico se puede usar como un metodo semicuantitativo.

Para la determinacion cuantitativa de cianuro, se utilizo la metodologia sugerida por Oliveros-Bastidas, Carrera y Marin (2009) y Nwokoro, Ogbonna, Ubani, Okpala, y Ofodile (2010), para lo cual 0.5 g de muestra de hojas frescas individuales de la planta, se colocaron en un recipiente cerrado, previa adicion de tolueno, hasta cubrir todas las hojas. El HCN liberado producto de la destruccion celular y la adicion de HCl al 10 %, fue arrastrado por vapor a 80[grados]C y recogido en un vial, que contenia 5 mL de una solucion de picrato de sodio (2.2 mmol/L) ajustado a pH 11.8, con una solucion de NaOH (0.1 mol/L). La solucion resultante se aforo a 10 mL con agua desionizada; despues de 60 minutos se tomaron las medidas de absorbancias a 550 nm, longitud de onda seleccionada de maxima absorcion en un espectrofotometro UV-Vis (Shimadzu, mini-1240). Las curvas de calibracion se obtuvieron usando soluciones de NaCN en agua en un intervalo de concentraciones de 1-10 [micron]g/ mL, con el mismo procedimiento usado para la muestra problema de las especies vegetales. Se prepararon tres curvas de calibracion a diferentes tiempos. Calculando el coeficiente de regresion [r.sup.2] de la curva y el coeficiente de variacion (CV) de cada patron medido. La repetibilidad se efectuo con seis replicas en cada muestra, determinando el coeficiente de variacion. De manera similar se determino la repetibilidad intermedia usando otro equipo y otro operador. Por medio de la tecnica de adicion de estandar se determino el porcentaje de recuperacion del analito. Estos ensayos fueron realizados por triplicado.

Determinacion de saponinas: Los extractos de las hojas de las plantas seleccionadas fueron evaluados cualitativamente para saponinas, a traves del ensayo de formacion de espumas y por el de produccion de hemolisis, observada al microscopio (Price, Johnson, Fenwick, & Malinow, 1987). Basado en la propiedad de estos compuestos de producir hemolisis, para la cuantificacion se uso un metodo modificado de Guerra, Nogueiras, Delgado, y Hernandez (2001). Los eritrocitos se obtuvieron a partir de 5 mL de sangre humana disuelta al 90 % con citrato de sodio (36.5 g/L), centrifugados a 2 500 rpm durante 15 min, y lavados tres veces con 50 mL de suero salino fisiologico. Luego, los eritrocitos se suspendieron en una solucion de citrato de sodio al 3 % para obtener una concentracion de eritrocitos al 5 %.

Para la curva de calibracion se uso 0.2 mg/mL de saponinas de Quillaja saponaria (Sigma[R]) disuelta con una solucion buffer de K[H.sub.2]P[O.sub.4] de pH 7.4. A partir de la cual se preparo una serie de patrones, con las siguientes concentraciones: 30; 25; 20; 15; 10 y 5 [micron]g/mL, por dilucion con la solucion buffer, de las cuales se tomaron 6 mL de cada uno y se colocaron en los tubos de ensayo respectivos.

Del extracto alcoholico de cada planta se preparo una dilucion 1:10 con buffer de K[H.sub.2]P[O.sub.4] a pH 7.4 y de esta se elaboraron una serie de ocho diluciones agregando desde 0.3 a 3.0 mL en diferentes tubos de ensayo y completada con agua destilada hasta un volumen total de 6 mL. Posteriormente, 6 mL de solucion de citrato de sodio al 6 % y 1 mL de la solucion de eritrocitos se le anadieron a cada tubo respectivo, que contenia las soluciones patrones y las diluciones de las muestras. Estos tubos se colocaron en un bano de agua a 35[grados]C, durante 30 min y despues se centrifugaron a 2 500 rpm por cinco minutos, y se dejaron en reposo por 15 minutos antes de realizar las medidas de absorbancias, a 540 nm, en un espectrofotometro UV-Vis (Shimadzu, mini-1240). De la misma forma, se prepararon dos controles, uno utilizando agua destilada y otro de citrato de sodio al 3 %, para determinar el 100 % y el 0 % de hemolisis, respectivamente. Con la curva de calibracion (porcentaje de hemolisis vs concentracion de saponinas) y los resultados de las curvas del porcentaje de hemolisis contra los volumenes de las diluciones de cada muestra, se determino la concentracion de saponinas de cada planta, expresada en mg equivalentes a las de Quillaja saponaria por gramo de material seco.

Bioensayo con nauplios de Artemia salina: Para obtener las larvas nauplios de Artemia salina, los quistes se colocaron en un envase plastico que contenia agua de mar bifiltrada, provisto de una apertura que facilito la aireacion continua e incidencia de luz constante de 75W, durante 24 horas. Para el bioensayo con los extractos alcoholicos de las hojas de las plantas, se prepararon soluciones de 10 mg/mL con agua de mar bifiltrada, a partir de estas, por dilucion, se obtuvieron las soluciones de 1 000, 100 y 10 [micron]g/mL. Luego grupos de diez larvas nauplios de A. salina fueron expuestos a esas soluciones diluidas por 24h. Se realizaron tres replicas por cada concentracion; el numero total de larvas nauplios ensayados en cada concentracion fue de 30. Se estimo el porcentaje de mortalidad de los organismos expuestos al efecto de los extractos y los valores de [CL.sub.50] se calcularon usando el metodo de analisis estadistico Finney Dos (metodos Probit, Logit, Moving Average o Binomial con un limite o intervalos de confianza de 95 %) disenado por Stephan (1977) (Meyer et al., 1982). La [CL.sub.50] se define como la concentracion de un material toxico letal al 50 % de los organismos de la prueba (Pino & Lazo, 2010). Finalmente, la toxicidad fue evaluada tomando como referencia las recomendaciones del CYTED (1995) y Meyer et al. (1982).

Para establecer la relacion entre la concentracion de cada metabolito y el [CL.sub.50], se realizo regresion simple (Zar, 1996) con p<0.05. Asimismo, para relacionar las concentraciones de los metabolitos en general con la toxicidad contra A. salina se realizo un Analisis de Componentes Principales a partir de la matriz de correlacion (Johnson & Wichern, 1992).

RESULTADOS

En el cuadro 1 se presentan las concentraciones promedios de los metabolitos secundarios determinados en los extractos de las plantas medicinales Artemisia absinthium, Cnidoscolus aconitifolius, Parthenium hysterophorus, Piper carpunya y Taraxacum officinale. De los resultados de la cuantificacion se determino que las cinco plantas estudiadas poseen alcaloides a diferentes concentraciones (Cuadro 1), siendo el extracto de A. absinthium el que presento la mayor concentracion.

El contenido de los compuestos fenolicos fue calculado como miligramos equivalentes de acido galico por gramo de material seco de las plantas. Los resultados presentados en el cuadro 1 muestran que las concentraciones de fenoles totales variaron de 2.80 mg/g para P. carpunya hasta la mas alta concentracion de 22.30 mg/g para T. officinale.

En relacion con la cuantificacion de taninos en las especies vegetales analizadas, la de mayor concentracion fue de T. officinale con, 11.7 mg equivalentes a acido galico (A.G)/g materia seca y la de menor concentracion fue C. aconitifolius con 0.2 mg equivalente a A.G/g materia seca.

Todos los extractos de las hojas de las plantas dieron positiva a las prueba cualitativa de saponinas. Los valores reportados de saponinas en las especies vegetales medicinales se encontraron entre 1.77-6.12 mg/g de peso seco. Los resultados indicaron que P. hysterophorus fue la especie con mayor contenido y P carpunya con el menor contenido de saponinas.

De la cuantificacion de glucosidos cianogenicos en las cinco plantas medicinales, C. aconitifolius presento la mayor concentracion de glucosidos, mientras A. absinthium la menor concentracion.

Se evaluo la actividad citotoxica de los extractos etanolicos de las cinco plantas medicinales: T. officinale, P. hysterophorus, A. absinthium L., C. aconitifolius y P carpunya, frente a los nauplios de Artemia salina. Las larvas de A. salina murieron expuestas a las distintas concentraciones (1 000, 100, 10 [micron]g/ mL) de extractos de las plantas medicinales utilizadas para el bioensayo. Todas las plantas estudiadas presentaron un porcentaje de mortalidad que oscilo entre 66.67 % y 100.0 % a la concentracion mas alta ensayada (1 000 [micron]g/mL), y de 6.57 % y 50.0 % a la concentracion de 100 [micron]g/mL, para A. absinthium y P carpunya, respectivamente. Ademas, P. carpunya mostro la [CL.sub.50] mas baja o citotoxicidad muy significativa y A. absinthium exhibio una citotoxicidad moderada. El porcentaje de mortalidad de los extractos y su citotoxicidad fue dependiente de la concentracion.

La actividad citotoxica ([CL.sub.50]) se evidencio en el siguiente orden: P. carpunya ([CL.sub.50] 3.37) > C. aconitifolius ([CL.sub.50] 74.34 [micron]g/mL) > P hysterophorus ([CL.sub.50] 95.88 [micron]g/mL) > A. absinthium ([CL.sub.50] 1 00.7 pg/mL) > T. officinale ([CL.sub.50] 274.34 pg/mL) (Cuadro 2).

Los niveles de toxicidad y alcaloides mostraron alta asociacion inversa [r= -0.60; ([CL.sub.50]) = -185(alcaloides) + 227] (Fig. 1). Esto indico que los ensayos con altas concentraciones de alcaloides fueron extremadamente toxicos a A. salina, con un grado de significancia p<0.02 y nivel de confianza de 99 %. Con los glucosidos cianogenicos, a pesar de que hubo una tendencia de disminuir el [CL.sub.50] a medida que aumento la concentracion, esta relacion no fue estadisticamente significativa.

[FIGURA 1 OMITIR]

Al contrario, las altas concentraciones de fenoles y taninos, a pesar de ser toxicas, disminuyeron significativamente (p < 0.01) su nivel de letalidad en el bioensayo, con alta linealidad con [CL.sub.50] [r = 0.93; ([CL.sub.50]= 9.4 (fenoles) + 25.5)]. De manera similar ocurrio con los valores de taninos, que presentaron una relacion significativamente positiva (p < 0.01) con el [CL.sub.50] [r = 0.88; ([CL.sub.50] = 14.8 (taninos) + 55.8]). En cuanto a la relacion de las saponinas con la [CL.sub.50], se observo un coeficiente de correlacion de 0.30, que mostro una relacion debilmente positiva entre los valores, pero no fue estadisticamente significativa.

Se aplico un analisis de componentes principales para evaluar las diferencias y similitudes entre los metabolitos secundarios evaluados y la actividad citotoxica, los resultados se presentan en la figura 2. Se seleccionaron los tres componentes principales, en los cuales los valores propios (eigenvalues) fueron [mayor que o igual a] 1 que explican el 97.46 % de la varianza en los datos originales. El 81.14 % de la varianza se encontro en los dos primeros componentes. En el analisis se observo que el [CL.sub.50] estuvo asociado positivamente a los taninos, fenoles y saponinas; contrario al efecto de los alcaloides, que presento una correlacion negativa; por su parte, los glucosidos actuaron en forma independiente a los demas compuestos.

[FIGURA 2 OMITIR]

DISCUSION

Este fue el primer reporte de cuantificacion de los metabolitos secundarios en las plantas analizadas provenientes del Ecuador. En cuanto al contenido de alcaloides, solamente estudios cualitativos evidenciaron la presencia de alcaloides en extractos acuosos y alcoholicos de P. hysterophorus (Nganthoi, Duta, Sagolemcha, & Irabanta, 2014; Padma & Deepika, 2013), C. aconitifolius (Mordi & Akanji, 2012), T. officinale (Amin, Sawhney, & Jassal, 2013) y de A. absinthium (Javed, Mir, & Naqui, 2012). Varias especies del genero Piper fueron estudiadas, pero de la especie P carpunya, no se encontro algun estudio que determine la presencia o ausencia de alcaloides.

Los compuestos fenolicos son el grupo mas extenso de sustancias no energeticas presentes en los alimentos de origen vegetal (Quinones, Miguel, & Aleixandre, 2012). Los valores de fenoles en A. absinthium fueron superiores a los obtenidos por Lee, Thiruvengadam, Chung y Nagella (2013), pero mas bajos que los encontrados por Canadanovic-Brunet et al. (2005). En C. aconitifolius el contenido de fenoles estuvieron por encima de los encontrados por Kuti y Konuru (2004), quienes reportaron un valor de 2.91 [+ o -] 0.02 mg/g. En cuanto a los valores de fenoles totales en T. officinale estuvieron similares a los obtenidos por Makkar, Norvsambuu, Lkhagvatseren, y Becker (2009) y un poco mayor que el encontrado por Sengul et al. (2009) y Ghaima, Hashim, y Ali (2013). No se encontro reporte de contenido de fenoles en P. carpunya ni de Ecuador, ni de otras partes del mundo.

Los valores de taninos oscilaron de 0.20 a 11.7 mg/g, los cuales fueron significativamente diferentes y se consideran de aceptabilidad para su consumo, por no afectar adversamente su digestibilidad (Diagayete & Huss, 1981).

Los valores de saponinas fueron los primeros reportados en Ecuador, para las especies incluidas en este trabajo y todas presentaron actividad hemolitica dependiente de la concentracion. De la revision bibliografica, de P. hysterophorus se reporto que fueron aisladas dos nuevas saponinas terpenoides, las cuales resultaron ser potentes inhibidores del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) (Shah et al., 2009). Tambien en P. hysterophorus, Gutierrez, Ortiz, Munoz, Bah y Serrano (2010), obtuvieron valores mas altos de saponinas (11.49 mg/g de planta seca) en comparacion con los encontrados en esta investigacion. En T. officinale, Makkar et al. (2009) tambien cuantificaron saponinas, mientras que Escudero, De Arellano, Fernandez, Albarracin y Mucciarelli (2003) no encontraron actividad hemolitica producida por el extracto de la planta. Para A. absinthium, C. aconitifolius y P carpunya, solamente en la literatura se han reportado analisis cualitativos que indican la presencia de saponinas.

En cuanto a los glucosidos cianogenicos, C. aconitifolius presento una concentracion promedio de 5.0 [micron]g equivalente a HCN/g de peso fresco, la cual fue mas alta que la encontrada por Kuti y Konoru (2006), quienes hallaron los niveles de los glucosidos cianogenicos entre 0.79 [+ o -] 0.20 y 1.47 [+ o -] 0.40 [micron]g, equivalente a HCN/g de peso fresco. Aunque todas las plantas estudiadas presentaron valores menores de 10 [micron]g HCN/g de material vegetal fresco, valor considerado potencialmente peligroso (FAO/WHO, 1991), los estudios epidemiologicos han demostrado que pequenas dosis de cianuro dadas durante un largo periodo de tiempo, producen cambios histologicos en el sistema nervioso central (Nwokoro et al., 2010; Smith, 1964). Las investigaciones acerca de las concentraciones de glucosidos cianogenicos en plantas fueron escasas; por lo tanto, fue primordial dar a conocer la presencia de estos compuestos en plantas para minimizar problemas de salud, debido a la intoxicacion por cianuro.

En relacion con la actividad citotoxica, se evidencio una importante variabilidad en las plantas estudiadas, desde extremadamente toxica (P carpunya, [CL.sub.50] de 3.37 pg/mL), altamente toxicas (C. aconitifolius, [CL.sub.50] 74.34 [micron]g/mL; P hysterophorus, [CL.sub.50] de 95.88 [micron]g/ mL y A. absinthium, [Cl.sub.50] de 100.7 [micron]g/mL) hasta moderadamente toxica (T. officinale [CL.sub.50] 274.34 [micron]g/mL. La categoria de toxicidad fue designada segun la clasificacion de CYTED (1995); sin embargo, en la escala de Meyer et al. (1982), una concentracion letal ([CL.sub.50]) basada en la toxicidad de sustancias para las larvas de A. salina < 500 [micron]g/mL indica toxicidad alta, por lo que todos los extractos de las plantas evaluadas se consideraron toxicos.

El resultado obtenido con P. hysterophorus estuvo en similitud con un estudio de Al-Mamun et al. (2010) en el que esta planta mostro actividad citotoxica contra los nauplios de Artemia salina, con una [CL.sub.50] de 93.75 [micron]g/mL. C. aconitifolius presento un porcentaje maximo de mortalidad de 76.66 %, resultado que estuvo en correspondencia con un estudio realizado en la misma planta por Ikpefan (2013); ademas, ellos refieren que la citoxicidad de las plantas evaluadas por exposicion de nauplios de A. salina frente a extractos acuosos y/o etanolicos, son indicadores de efectos antitumorales.

La especie P. carpunya, tuvo la mas alta toxicidad y los estudios toxicologicos usando A. salina, han sido escasos. Una [CL.sub.50] de 3.37 [micron]g/mL evidencio una toxicidad muy significativa (Meyer et al., 1982) para esta especie. Dado que el nivel de dosis toxica, segun el Instituto Nacional del Cancer de Estados Unidos, fue < 30 [micron]g/mL (Suffness & Pezzuto, 1990), el resultado de [CL.sub.50] (3.37 [micron]g/mL) del extracto etanolico de hojas de P. carpunya muestra a esta planta como promisoria para seguir con estudios que permitan determinar el verdadero potencial anticancerigeno, dada la alta citotoxicidad observada.

En cuanto a las altas correlaciones que se encontraron en este estudio, entre la citotoxicidad en A. salina y las concentraciones de alcaloides, Coe, Parikh y Johnson (2010) tambien hallaron que las citotoxicidades mas altas fueron registradas en especies de plantas que dieron resultados positivos para alcaloides, causando la muerte de A. salina a concentraciones inferiores de 2 000 [micron]g/mL. Tambien, Bouzada et al. (2009) obtuvieron que los extractos mas citotoxicos fueron los que mostraron mayor contenido de alcaloides. Johnson-Senjobi, Moody y Ettu (2011) observaron que los alcaloides extraidos en el extracto alcoholico de C. aconitifolius tambien presentaron alta toxicidad ([CL.sub.50] 44.7 [micron]g/mL). Esto le confiere un gran valor farmacologico a las plantas ensayadas, y podrian ser fuentes promisorias de compuestos antitumorales.

En esta investigacion, usando analisis de regresion lineal, se demostro que los extractos de las plantas con mayores concentraciones de los fenoles, disminuyeron significativamente las toxicidades contra A. salina. Otros estudios tambien han encontrado altas concentraciones de polifenoles, pero las toxicidades de los extractos contra A. salina fueron de moderadas (Saraiva et al., 2011) a bajas (James, Nnacheta, & Ameh, 2008). Es probable que los extractos de plantas con altas concentraciones de polifenoles, tambien presenten mayores capacidades antioxidantes (James et al., 2008), y esto puede estar inhibiendo la citotoxicidad, dado que muchas veces la muerte celular de los crustaceos se produce por estres oxidativo. Se ha reportado, que la exposicion a determinados compuestos ensayados, ha inducido a alteraciones en el estado redox celular y de peroxidacion lipidica (Nunes, Carvalho, & Guilhermino, 2006; Vitorino, Mantovanelli, Zanotto, & Esposito, 2015).

La aplicacion de analisis de componentes principales (PCA) permitio examinar el patron de la relacion entre todos los metabolitos secundarios cuantificados y la actividad citotoxica. Los tres primeros ejes del PCA fueron seleccionados porque explicaron el 97.4 % de la varianza. Las altas similitudes entre los fenoles y los taninos para disminuir la actividad citotoxica (mayor valor de [CL.sub.50]), podria ser debido a la estructura polifenolica que poseen los taninos (Chung, Cheng-I Wei, & Johnson, 1998). Tambien en el mismo cluster se encontraron asociadas las saponinas, de lo que se puede inferir que puede haber una sinergia entre los polifenoles y las saponinas para disminuir la citotoxicidad. Zhao, Qin y Lou (1999) evaluaron la toxicidad de varios tipos de saponinas contra A. salina, y como resultado, encontraron que los compuestos ensayados disminuyeron su toxicidad a medida que las concentraciones de las saponinas analizadas aumentaron. Estos resultados demuestran que las saponinas y los polifenoles pueden ser letales a A. salina a bajas concentraciones, por lo que se recomendaria a A. salina como un valioso bioensayo citotoxico para evaluar extractos vegetales que contengan bajas concentraciones de compuestos quimicos con altas polaridades.

En contraste, se observaron los alcaloides, reflejando que las altas concentraciones de alcaloides aumentaron la toxicidad de la planta sobre A. salina, lo cual puede servir para determinar la toxicidad intrinseca de la planta y asi poder controlar tratamientos seguros, y evitar efectos por sobredosis aguda hacia celulas normales (Bun et al., 2009).

Con los resultados observados de correlaciones y del analisis de componentes principales, se puede inferir que las plantas medicinales evaluadas en este estudio contienen glucosidos cianogenicos, con una tendencia de toxicidad a nivel celular no significativa y totalmente independiente a los polifenoles, saponinas y a los alcaloides.

Con los resultados de esta investigacion se demostraron las interacciones aditivas entre fenoles y taninos, sinergicas entre polifenoles y saponinas, y antagonicas de los alcaloides y los glucosidos cianogenicos. Esto evidencio que los metabolitos secundarios cuantificados presentaron variabilidades en los mecanismos de accion como citotoxicos contra A. salina. Por lo tanto, el bioensayo de A. salina demostro ser util como biomodelo para evaluar los metabolitos secundarios en plantas medicinales con potencial farmacologico.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Proyecto Prometeo de la Secretaria Nacional de Educacion Superior, Ciencia y Tecnologia de la Republica de Ecuador (SENESCYT), por el financiamiento de esta investigacion.

REFERENCIAS

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Carmita Jaramillo Jaramillo (1), Anyi Jaramillo Espinoza (1), Haydelba D'Armas (1,2), Luis Troccoli (3) & Luisa Rojas de Astudillo (1,2)

(1.) Planta Piloto de Farmacia, Facultad de Ciencias Quimicas y Salud, Universidad Tecnica de Machala, Ecuador; cjaramillo@utmachala.edu.ec, anyisssita2203@gmail.com

(2.) Departamento de Quimica, Escuela de Ciencias, Nucleo de Sucre, Universidad de Oriente, Venezuela; lrojas40@yahoo.com, haydelba@yahoo.com

(3.) Instituto de Investigaciones Cientificas. Universidad de Oriente. Boca de Rio, Isla de Margarita; luis.troccoli@gmail.com

Recibido 09-VI-2015. Corregido 10-II-2016. Aceptado 09-III-2016.
CUADRO 1
Valores (promedio [+ o -] desviacion estandar) de los metabolitos
secundarios determinados en extractos de plantas medicinales

TABLE 1
Values (mean [+ o -] standard deviation) of secondary metabolites
determinate in medicinal plant extracts

                        Alcaloides            Fenoles
Especies vegetales        (mg/g)               (mg/g)

A. absinthium        1.01 [+ o -] 0.02   5.60 [+ o -] 0.03
C. aconitifolius     0.69 [+ o -] 0.02   3.30 [+ o -] 0.11
P. carpunya          0.77 [+ o -] 0.03   2.80 [+ o -] 0.17
P. hysterophorus     0.55 [+ o -] 0.02   6.00 [+ o -] 0.20
T. officinale        0.33 [+ o -] 0.03   22.30 [+ o -] 0.23

                          Taninos
Especies vegetales         (mg/g)         Saponinas (mg/g)

A. absinthium        1.40 [+ o -] 0.02    3.90 [+ o -] 0.04
C. aconitifolius     0.20 [+ o -] 0.01    4.45 [+ o -] 0.03
P. carpunya          0.90 [+ o -] 0.02    1.77 [+ o -] 0.03
P. hysterophorus     1.00 [+ o -] 0.05    6.12 [+ o -] 0.02
T. officinale        11.70 [+ o -] 0.10   3.50 [+ o -] 0.01

                             Glucosidos
Especies vegetales   cianogenicos ([micron]g/g)

A. absinthium            0.52 [+ o -] 0.05
C. aconitifolius         5.02 [+ o -] 0.37
P. carpunya              1.92 [+ o -] 0.04
P. hysterophorus         1.12 [+ o -] 0.06
T. officinale            1.42 [+ o -] 0.04

CUADRO 2
Resultados obtenidos del bioensayo (24 h) con nauplios
de Artemia salina

TABLE 2
Results obtained with the Artemia salina bioassay

                   Concentracion
Especie            ([micron]g/mL)   Muertos   Vivos   Mortalidad (%)

T. officinale          1 000          21        9        70.00
                         100          12       18        40.00
                          10           7       23        23.33
A. absinthium          1 000          20       10        66.67
                         100          13        7        43.33
                          10           2       28         6.67
P. hysterophorus       1 000          29        1        96.70
                         100          13       17        43.33
                          10           5       25        16.66
C. aconitifolius       1 000          23        7        76.66
                         100          20       10        66.67
                          10           6       24        20.00
P. carpunya            1 000          30        0        100.0
                         100          23        7        76.66
                          10          15       15        50.00

                   [CL.sub.50]
Especie            [micron]g/mL   Categoria

T. officinale        274.74       Moderadamente toxico

A. absinthium         100.7       Moderadamente toxico

P. hysterophorus      95.88       Altamente toxico

C. aconitifolius      74.34       Altamente toxico

P. carpunya            3.37       Extremadamente toxico
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Author:Jaramillo Jaramillo, Carmita; Jaramillo Espinoza, Anyi; D'Armas, Haydelba; Troccoli, Luis; Rojas de
Publication:Revista de Biologia Tropical
Date:Sep 1, 2016
Words:7580
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