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Comparison of different doses of collagenase-induced equine tendonitis: clinical and ultrasonographic study/Comparacao de diferentes doses de colagenase em modelo de inducao de tendinite para equinos: estudo clinico e ultra-sonografico.

INTRODUCAO

O tendao flexor digital superficial (TFDS) e frequentemente agredido por diferentes mecanismos, e as lesoes expressam-se no plano tecidual por fenomenos degenerativos e alteracoes inflamatorias em diferentes graus de intensidade (ALVES, 1998). Essas lesoes cicatrizam lentamente, e de 20 a 60% dos cavalos afetados retornam a atividade atletica, mas acima de 80% deles apresentam reincidencia da lesao (GENOVESE et al., 1997). Como consequencia, observase que a tendinite do flexor digital superficial esta entre as principais causas da diminuicao de desempenho e claudicacao dos equinos atletas, gerando grandes perdas economicas na medicina esportiva equina (WILSON et al., 1996; GILLIS, 2004).

Recentes investigacoes cientificas sobre a ultra-estrutura do TFDS, suas propriedades mecanicas e suas respostas a lesao e as modulacoes farmacologicas da reparacao tendinea buscam elucidar duvidas sobre a etiopatogenia da tendinite, contribuindo assim para o desenvolvimento de metodos preventivos e terapeuticos mais eficazes (ALVES et al.,1993; DOWLING et al., 2000; ALVES et al., 2001 a; ALVES et al., 2001 b).

O extrato de colagenase purificado de bacterias possui a caracteristica de destruir enzimaticamente as fibras colagenas e, quando aplicado pela via intratendinea, pode ser utilizado modelo experimental que mimetiza os sinais clinicos e os efeitos de uma lesao de ocorrencia natural, como, por exemplo, a tendinite causada pelo estresse mecanico da atividade esportiva de alto desempenho (ALVES, 1998; ALVES et al., 2002).

Sabe-se que o exame ultra-sonografico do TFDS e essencial para a avaliacao e o acompanhamento da cicatrizacao da lesao tendinea (FERRARO et al., 2003). Nesse exame, um TFDS normal apresenta-se isoecoico e em corte longitudinal e composto por fibras longas e paralelas e de ecogenicidade caracteristica. A lesao recente do TFDS apresenta-se anecoica resultante da hemorragia, fibrolise ou tecido de granulacao inicial (REEF, 1998). Ja a destruicao do colageno pela administracao da colagenase e caracterizada por areas hipoecoicas ou anecoicas, e o decrescimo da ecogenicidade depende diretamente da dose de colagenase administrada (SPURLOCK et al., 1989). A utilizacao de um modelo experimental em que haja padronizacao das lesoes tendineas permite a aplicacao de diferentes protocolos terapeuticos, alem de possibilitar o estudo do processo de formacao da lesao e do processo cicatricial (CREVIER-DENOIX et al., 2005; MARXEN et al., 2004).

Nesse sentido, por meio da presente pesquisa objetivou-se padronizar lesoes tendineas induzidas experimentalmente em equinos a partir da administracao de diferentes doses de colagenase, avaliando-se aspectos clinicos e ultra-sonograficos.

MATERIAL E METODOS

Foram utilizados 12 equinos adultos, machos e femeas, com faixa etaria media de seis anos e peso medio de 400kg, sem raca definida e clinicamente sadios. Antes do periodo experimental foram submetidos a exames fisicos e laboratoriais para a constatacao do estado de higidez e a exame de claudicacao visando a verificacao da normalidade do aparelho locomotor. Durante todo o experimento foram mantidos em baias individuais e alimentados com feno de capim "coast-cross", agua ad libitum e suplementados com racao comercial e composto mineral para equinos.

Os cavalos foram distribuidos aleatoriamente em dois grupos conforme a dose de colagenase aplicada nos membros toracicos: grupo 1 (G1) foi composto de seis animais submetidos a aplicacao de 1,25mg de colagenasea, correspondente a 0,5mL de solucao a 2,50%; e o grupo 2 (G2) foi composto de seis animais submetidos a aplicacao de 2,5mg de colagenase, correspondente a 1,0mL de solucao a 2,5%. Antes do protocolo de aplicacao da colagenase os cavalos foram submetidos a palpacao do TFDS para observacao de sensibilidade dolorosa, aumento de volume e temperatura local e ao exame ultra-sonografico para verificar possiveis alteracoes que pudessem comprometer as avaliacoes preconizadas.

Os exames ultra-sonograficos foram realizados com o equino contido em tronco e em posicao quadrupedal. Apos tricotomia da regiao palmar do 3 metacarpiano, o TFDS foi avaliado com o aparelho ultra-sonografico provido de transdutor linear de 7,5MHz (b), sendo obtidas imagens em cortes transversais e longitudinais registradas por meio da impressao em papel (c).

Com o cavalo contido em tronco foi realizada sedacao com xilazina a 10% (d) na dose de 0,5mg [kg.sup.-1] pela via intravenosa e anestesia local por meio do bloqueio perineural dos nervos digitais palmares lateral e medial no terco proximal da regiao metacarpiana, onde foram aplicados 2mL de lidocaina sem vasoconstrictore em cada ponto. A regiao foi entao preparada com antissepsia com alcool iodado e uma agulha hipodermica 30x8f foi introduzida na regiao palmar do TFDS a 15cm distal ao osso acessorio do carpo, no sentido perpendicular a pele ate atingir o centro do tendao. O posicionamento da agulha e a aplicacao da colagenase foram acompanhados pela ultra-sonografia. O procedimento de aplicacao de colagenase foi o mesmo para ambos os membros toracicos e grupos, porem as doses de colagenase aplicadas intratendineas foram de 1,25mg e 2,50mg de colagenase, respectivamente, para os grupos G1 e G2.

O monitoramento das lesoes tendineas baseou-se nos exames clinicos e ultra-sonograficos realizados a cada sete dias ate o periodo de 28 dias pos-inducao (D7, D14, D21 e D28). Ao exame clinico foi avaliado o aumento de volume, classificado em escore de 0 a 5 (0 = sem aumento de volume; 1 = discreto aumento de volume; 2 = aumento de volume evidente; 3 = moderado aumento de volume; 4 = severo aumento de volume; 5 = aumento de volume grave) e graus de claudicacao segundo STASHAK (2002), em que I = claudicacao nao observada a passo, mas reconhecivel ao trote; II = claudicacao notada ao passo e evidente ao trote; III = claudicacao evidente ao passo e ao trote; IV = claudicacao que quase nao suporta peso algum no membro; V = impotencia funcional do membro ou decubito.

Na ultra-sonografia, foram avaliados os parametros: Ecogenicidade da lesao (0 = ecoico; 1 = predominio ecoico; 2 = 50% ecoico e 50% anecoico; 3 = predominio anecoico; 4 = totalmente anecoico), segundo GENOVESE et al. (1986); percentual de area lesada no interior de cada tendao, (area da lesao/area total do tendao) x 100, segundo GENOVESE et al. (1990); percentual de reducao da lesao, mensurando o percentual da area da lesao inicial e das avaliacoes subsequentes e o paralelismo das fibras colagenas, avaliado por meio das imagens longitudinais (0 = ausencia de paralelismo; 1 = discreto; 2 = parcial; 3 = total); e grau de severidade da lesao, expresso pela relacao entre a ecogenicidade e o percentual de area da lesao, em escala de 0 a 10.

O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado em esquema fatorial 2 x 4, em que o primeiro fator foi representado pelas diferentes doses aplicadas (G1 e G2) e o segundo fator foi representado pelas diferentes epocas de avaliacao (sete, 14, 21 e 28 dias) e com seis repeticoes (sendo cada repeticao um animal). Os dados foram submetidos a analise de variancia e, em caso de significancia (P<0,05), foram submetidos ao Teste de Tukey para a comparacao de medias, em nivel de 5% de probabilidade.

RESULTADOS E DISCUSSAO

A resposta imediata da administracao da colagenase relacionou-se com os achados das pesquisas realizadas por ALVES et al. (2002), MARXEN et al. (2004) e BARREIRA (2005), as quais verificaram alteracoes clinicas locais em todos os animais, nas primeiras 24 a 48 horas apos a aplicacao da enzima. Nos grupos experimentais, foram observados sinais de processo inflamatorio, tais como aumento de temperatura, aumento de volume e sensibilidade dolorosa locais. A face palmar do TFDS, no ponto de aplicacao da colagenase, tornou-se espessada para os dois grupos. MARXEN et al. (2004) relataram que o aumento de volume no ponto de aplicacao conservase ate o final do experimento, explicado por GOODSHIP et al. (1994), os quais descrevem que o espessamento do TFDS na fase inicial deve-se a presenca de liquido inflamatorio e na fase final, ao tecido cicatricial neoformado.

ALVES et al. (2002) relataram que as reacoes posteriores a aplicacao de colagenase, encontradas ao exame fisico e ultra-sonografico, se assemelharam as lesoes provocadas por excesso de exercicios. Em G1, o processo inflamatorio inicial apresentou-se evidente, nao seguindo o padrao encontrado na literatura (HENRY et al., 1986). A partir da terceira semana, apos a inducao da lesao, G1 apresentou menor resposta inflamatoria local. Apesar de nao haver significancia estatistica, foi observado que o exame fisico de G1 foi diferente de G2 (Tabela 1) em todos os momentos, sendo as imagens ultra-sonograficas vantajosas para acompanhar a evolucao da lesao tendinea, ja que nao houve uma constante relacao entre a gravidade das lesoes nas imagens ultra-sonograficas e os achados do exame clinico (ALVES, 1998).

As enzimas bacterianas agridem as moleculas de colageno em multiplos locais ao longo da cadeia, causando rapida solubilizacao do colageno, destruicao de celulas e matriz nao-colagena, com consequente ruptura das fibras (SPURLOCK et al., 1989; FOLAND et al., 1992). Tal processo resulta em hemorragias, formacao de hematomas, inflamacao, acumulo de fluidos, quimiotaxia de neutrofilos e linfocitos e deposicao de fibrina para o local lesionado (ALVES, 1998). MARR et al. (1993) relataram que a anecogenicidade foi resultante principalmente de hemorragia intratendinea, separacao de fibras e edema.

As imagens ultra-sonograficas de G1 na primeira semana apresentaram lesoes com menor ecogenicidade, percentual de area lesada e menor severidade em comparacao com o G2 no mesmo periodo (Tabelas 1, 2 e 3). O G2 apresentou escore medio de severidade de lesao maior nas duas primeiras semanas.

Uma lesao recente do TFDS deve apresentar-se como area anecoica ou hipoecoica, podendo ser difusa ou localizada. G1 apresentou lesoes difusas nos primeiros sete dias de experimento, e G2, lesoes localizadas, explicadas pela diferente dose de colagenase administrada. As lesoes localizadas receberam maior escore de ecogenicidade e porcentagem de lesao por possuirem melhor delimitacao, resultando em maior severidade de lesao. MACHADO et al. (2000); ALVES et al. (2002); MARXEN et al. (2004) e BARREIRA (2005) relataram que lesoes induzidas com diferentes doses de colagenase (1,25mg, 2,5mg) apresentam padronizacao desde o setimo dia ate o vigesimo dia apos a aplicacao da enzima.

Houve diferenca significativa para ecogenicidade nas quatro semanas de avaliacao (P<0,05). Na primeira semana, G1 apresentou ecogenicidade 38,5% menor do que G2. Na segunda semana, nao houve diferenca significativa entre G1 e G2. Para a terceira e a quarta semana, G1 apresentou maior ecogenicidade do que G2 (27% e 44,1%, respectivamente). Os resultados demonstrados por G2 correlacionam-se com os resultados apresentados na literatura consultada, os quais indicam que a colagenase tem maior acao ate os 20 primeiros dias, e a remissao dos sinais clinicos da fase aguda acontece a partir deste periodo, o G1, ao contrario de G2, apresentou lesoes progressivas (Tabela 2).

Observa-se que G1 apresentou um percentual de area lesada menor que G2 nas duas primeiras semanas do experimento (Tabela 3). O G2 apresentou lesoes com percentual de area lesada semelhantes durante as quatro semanas. A dose de 1,25mg provocou 19,2% de lesao a menos que a dose de 2,5mg, independente da semana (P<0,01). Houve diferenca significativa entre G1 e G2 (P<0,01) no decorrer do experimento. Para G1, houve menor porcentagem de area lesada na primeira e na segunda semana em comparacao ao G2. Alem disso, G2 apresentou 59,1% a mais de area lesada nas duas primeiras semanas em relacao a G1. Na terceira semana, nao houve diferenca significativa entre as doses e na quarta semana a porcentagem de area lesada foi 40,5% maior quando foi utilizada a dose de 1,25mg.

O G1 manteve lesoes difusas e progressivas ate a terceira semana de experimento, o que nao torna pratico o acompanhamento ultra-sonografico para o emprego de estudos de cicatrizacao tendinea. O G2, por sua vez, apresentou lesoes com rapido decrescimo de ecogenicidade e um quase constante percentual de area lesada, possibilitando melhor correlacao com os aspectos clinicos e experimentais. (ALVES et al., 2002; MARXEN et al., 2004; BARREIRA, 2005). Inferimos que a resposta alterada de G1 em relacao ao desenvolvimento das lesoes tendineas e a G2 se deve a maior mobilidade dos animais desse grupo; decorrente de menor lesao inicial e da menor dose aplicada, resultando em lesoes ainda severas ao final do experimento.

A severidade da lesao na primeira semana foi significativamente diferente ao serem comparadas as duas doses. O G1 apresentou lesoes menos severas que G2 para a primeira e a segunda semana. Na terceira e na quarta semana, G1 apresentou lesoes mais severas que G2 (Tabela 4).

Na terceira semana, G1 apresentou remissao da resposta inflamatoria local, porem evolucao progressiva das lesoes nas imagens ultra-sonograficas, resultando em percentual de reducao da lesao igual a zero para todas as semanas. O G2 apresentou uma media do percentual de reducao dos membros toracicos de 13,90% na terceira semana e de 28,60% na quarta semana, demonstrando diferenca em relacao ao G1. MARXEN et al. (2004) relataram que os animais apresentaram maior severidade de lesao entre o setimo e o vigesimo terceiro dia apos inducao. A partir da segunda semana apos a injecao de colagenase as lesoes tendem a reduzir de gravidade e apresentar areas cicatriciais com fibras colagenas pouco organizadas e espessamento de bainha tendinea. Esses dados foram compativeis com G2, e o G1 apresentou lesoes extensas, anecoicas ou hipoecoicas ate o final do experimento (MACHADO et al., 2000; ALVES et al., 2002; BARREIRA, 2005).

CONCLUSOES

Conclui-se que a ultra-sonografia apresentou vantagens por ser um metodo nao-invasivo de estudo e possibilitar uma avaliacao estrutural mais precisa, complementando o exame fisico. Para o estudo de tratamentos e lesoes do TFDS, o protocolo de 2,5mg de colagenase (G2) e o mais adequado para inducao de tendinite, ja que o G2 apresentou resultados mais condizentes comparados aos casos clinicos.

AGRADECIMENTOS

A Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP), pela bolsa de Iniciacao Cientifica concedida, processo no 04155192R.

FONTES DE AQUISICAO

a--Colagenase tipo 1 C-0130--Sigma Pharmaceutical, EUA. b--SSD 900 marca ALOKA--Berger, Brasil. c--Impressora termica UP8--Sony, Brasil. d--Sedazine--Fort Dodge Saude Animal, Brasil. e--Xylestesin 2%--Cristalia, Brasil. f--Agulha descartavel--Becton, Dickinson and Company, Brasil.

COMITE DE ETICA E BIOSSEGURANCA

O presente estudo foi aprovado pela Camara de Etica em Experimentacao Animal da FMVZ-UNESP de acordo com os principios Eticos na Experimentacao Animal (COBEA), protocolo numero 005/2005--CEEA.

REFERENCIAS

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Ana Lucia Miluzzi Yamada (I*) Ana Liz Garcia Alves (II) Carlos Alberto Hussni (II) Jose Luiz de Mello Nicoletti (II) Armen Thomassian (II) Marcos Jun Watanabe (III) Rodrigo Carneiro (I)

(I) Programa de Residencia em Clinica Cirurgica de Grandes Animais, Departamento de Cirurgia e Anestesiologia Veterinaria, Faculdade de Medicina Veterinaria e Zootecnia (FMVZ), Universidade Estadual Paulista (UNESP), 18618-000, Botucatu, SP, Brasil. E-mail: anamyamada@terra.com.br. *Autor para correspondencia.

(II) Departamento de Cirurgia e Anestesiologia Veterinaria, FMVZ, UNESP, Botucatu, SP, Brasil.

(III) Programa de Pos-graduacao em Cirurgia Veterinaria, Departamento de Cirurgia e Anestesiologia Veterinaria, FMVZ, UNESP, Botucatu, SP, Brasil.
Tabela 1 - Medias dos escores do aumento de volume e grau de
claudicacao e valores do desvio padrao e dos TFDS dos membros
toracicos de seis equinos do grupo G1 (1,25mg de colagenase)
e seis equinos do grupo G2 (2,50mg de colagenase) nos momentos
apos a aplicacao de colagenase intratendinea para a inducao
experimental de tendinite

                Aumento de volume *

             d7                  d14

G1      5 [+ or -] 0        2 [+ or -] 0,64
G2      3 [+ or -] 0,5      2 [+ or -] 0,5

                Aumento de volume *

             d21                 d28

G1      3 [+ or -] 0,45   2,1 [+ or -] 0,5
G2      1 [+ or -] 0,9      1 [+ or -] 0

              Grau de claudicacao **

             d7                 d14

G1    2,6 [+ or -] 0,5    1,6 [+ or -] 0,4
G2      2 [+ or -] 0,6      1 [+ or -] 0,7

              Grau de claudicacao **

             d21                d28

G1      3 [+ or -] 0,9    1,5 [+ or -] 0,5
G2   0,16 [+ or -] 0,4           0

D7 - 7 dia apos a aplicacao de colagenase;

D14 -14 dia apos a aplicacao de colagenase;

D21 - 21 dia apos a aplicacao de colagenase;

D28 - 28 dia apos a aplicacao de colagenase.

* Aumento de volume classificado em escore de 0 a 5:

0 = sem aumento de volume;

1 = discreto aumento de volume;

2 = aumento de volume evidente;

3 = moderado aumento de volume;

4 = severo aumento de volume;

5 = aumento de volume grave

** Graus de claudicacao segundo STASHAK (2002):

I = claudicacao nao observada a passo, mas reconhecivel ao trote;

II = claudicacao notada ao passo e evidente ao trote;

III = claudicacao evidente ao passo e ao trote;

IV = claudicacao que quase nao suporta peso algum no membro;

V = impotencia funcional do membro ou decubito.

Tabela 2 - Medias dos escores da ecogenicidade das lesoes * e valores
do desvio padrao e dos TFDS dos membros toracicos de seis equinos do
grupo G1 (1,25mg de colagenase) e seis equinos do grupo G2 (2,50mg de
colagenase) nos momentos apos a aplicacao de colagenase intratendinea
para a inducao experimental de tendinite.

              d7                    d14

G1   2,0 [+ or -] 0,70 Bb   2,7 [+ or -] 0,4 Aba
G2   3,3 [+ or -] 0,5 AA    2,8 [+ or -] 0,3 Aba

             d21                    d28

G1   3,1 [+ or -] 0,4 Aa    2,8 [+ or -] 0,5 a
G2   2,3 [+ or -] 0,3 BCb   1,6 [+ or -] 0,2 Cb

Medias seguidas pela mesma letra maiuscula na linha e minuscula
na coluna nao diferem estatisticamente entre si pelo Teste de
Tukey em nivel de 5% de probabilidade.

D7 - 7 dia apos a aplicacao de colagenase;

D14 -14 dia apos a aplicacao de colagenase;

D21 - 21 dia apos a aplicacao de colagenase;

D28 - 28 dia apos a aplicacao de colagenase.

* Escores da ecogenicidade da lesao:

0 = ecoico; 1 = predominio ecoico;

2 = 50% ecoico e 50% anecoico;

3 = predominio anecoico;

4 = totalmente anecoico.

Tabela 3 - Medias dos percentuais de area lesada * e valores do
desvio padrao e dos TFDS dos membros toracicos de seis equinos
do grupo G1 (1,25mg de colagenase) e seis equinos do grupo G2
(2,50mg de colagenase) nos momentos apos a aplicacao de
colagenase intratendinea para a inducao experimental de
tendinite.

               d7                       d14

G1   11,42 [+ or -] 2,24 Bb    13,25 [+ or -] 2,58 Bb
G2   27,92 [+ or -] 7,58 Aba   32,25 [+ or -] 3,65 Aa

               d21                      d28

G1   29,08 [+ or -] 6,70 Aa    34,17 [+ or -] 7,70 Aa
G2   28,25 [+ or -] 2,71 Aa    20,33 [+ or -] 3,76 Bb

Medias seguidas pela mesma letra maiuscula na linha e minuscula
na coluna nao diferem estatisticamente entre si pelo Teste de
Tukey em nivel de 5% de probabilidade

D7 - 7 dia apos a aplicacao de colagenase;

D14 -14 dia apos a aplicacao de colagenase;

D21 - 21 dia apos a aplicacao de colagenase;

D28 - 28 dia apos a aplicacao de colagenase.

* Percentual de area lesada = (area da lesao/area total do
tendao) x 100.

Tabela 4 - Medias dos escores dos graus de severidade das lesoes * e
valores do desvio padrao e dos TFDS dos membros toracicos de seis
equinos do grupo G1 (1,25mg de colagenase) e seis equinos do grupo G2
(2,50mg de colagenase) nos momentos apos a aplicacao de colagenase
intratendinea para a inducao experimental de tendinite.

              d7                      d14

G1   3,10 [+ or -] 1,14 Bb   4,30 [+ or -] 0,71 Bb
G2   6,50 [+ or -] 1,24 Aa   5,90 [+ or -] 0,50 Aba

              d21                     d28

G1   6,10 [+ or -] 1,09 Aa   6,60 [+ or -] 0,95 Aa
G2   4,50 [+ or -] 0,56 Bb   2,80 [+ or -] 0,52 Cb

Medias seguidas pela mesma letra maiuscula na linha e minuscula
na coluna nao diferem estatisticamente entre si pelo Teste de
Tukey em nivel de 5% de probabilidade

D7 - 7 dia apos a aplicacao de colagenase;

D14 -14 dia apos a aplicacao de colagenase;

D21 - 21 dia apos a aplicacao de colagenase;

D28 - 28 dia apos a aplicacao de colagenase.

* Grau de severidade da lesao: expresso pela relacao entre a
ecogenicidade e o percentual de area da lesao, em escala de
0 a 10.
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Author:Yamada, Ana Lucia Miluzzi; Alves, Ana Liz Garcia; Hussni, Carlos Alberto; Nicoletti, Jose Luiz de Me
Publication:Ciencia Rural
Article Type:Report
Date:Jul 1, 2009
Words:4066
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