Printer Friendly

Comparacion de metodos convencionales y moleculares para la deteccion de Giardia lamblia en heces humanas.

COMPARISON OF CONVENTIONAL AND MOLECULAR METHODS FOR DETECTION OF Giardia lamblia IN HUMAN FEACES

INTRODUCCION

Las infecciones por parasitos intestinales constituyen un importante problema de salud publica en todo el mundo por sus altas tasas de prevalencia y amplia distribucion mundial, en particular en las regiones tropicales y subtropicales de los paises en via de desarrollo. Se estima que alrededor de 480 millones de personas sufren de amebiasis y otras infecciones causadas por diversos protozoos intestinales, incluyendo a Giardia lamblia, Entamoeba histolytica, Cryptosporidium spp. y Cyclospora cayetanensis, entre otros, que pueden causar diarreas autolimitadas en individuos inmunocompetentes (WHO, 2002; Nunez, 2004).

Los protozoarios del genero Giardia son organismos unicelulares binucleados, anaerobios facultativos que infectan la parte superior del intestino delgado de muchas especies de vertebrados, entre ellos el humano. En los paises desarrollados y en via de desarrollo constituyen la causa mas frecuente de infeccion gastrointestinal humana producida por protozoos parasitos, ocasionando infecciones sintomaticas en aproximadamente 200 millones de personas en Asia, Africa y America Latina, las cuales representan alrededor de 50.000 nuevos casos al ano (Yason y Rivera, 2007; Barrientos, Torrico y Suarez, 2008).

El interes por este protista flagelado se ha incrementado a partir de la segunda mitad del siglo XX, al ser reconocido como un patogeno potencial por primera vez en 1962 (Paulino, 2005), debido a que el hospedero infectado elimina el quiste de Giardia al medio ambiente con las heces, y el hospedero susceptible contrae la infeccion por la ingestion de estos a traves de alimentos mal procesados o el agua sin tratamiento adecuado (Fernandez y Diaz, 2003; Nunez, 2004).

Una de las tecnicas de referencia mas utilizada en los laboratorios para la deteccion de quistes de Giardia lamblia, es la observacion directa bajo el microscopio utilizando el metodo por concentracion o tecnica de Ritchie (centrifugacion con formol-eter), debido principalmente a su bajo costo y a la sencillez de la prueba. Sin embargo, la identificacion por microscopia tradicional requiere tiempo, experiencia, ademas de ser poco sensible e inespecifica, ya que los quistes pueden confundirse con otros parasitos que presenten morfologia semejante (Gonzalez et al., 1999; Izquierdo et al, 2006).

La aplicacion de herramientas moleculares en los estudios de Giardia ha permitido avanzar en el entendimiento de la biologia basica de este protozoo. En varias partes del mundo se han incrementado los esfuerzos para desarrollar mejores metodos que permitan detectar Giardia en humanos, en diversos animales y en muestras medioambientales, con miras a prevenir su difusion y a mejorar el diagnostico para un tratamiento adecuado y oportuno (Caccio et al., 2003; Corinne, Amar y McLauchlin, 2003; Johnston et al., 2010).

La utilizacion de tecnicas de biologia molecular en los estudios de parasitologia, ha permitido identificar la especie G. lamblia por medio de la deteccion de polimorfismos en regiones especificas (loci especificos) y no especificas (Random Amplification of Polymorphic DNA, RAPD) del genoma de esta especie (Corinne et al., 2003; Tellez, et al., 2003; Robertson et al., 2007; Goncalves et al., 2008). Algunos genes, como los que codifican para la subunidad pequena ribosomal y otros que codifican ciertas enzimas del metabolismo basal, han demostrado gran especificidad para la caracterizacion de este parasito (Monis et al., 1999; Caccio et al., 2003; Tellez et al., 2003; Winkworth et al., 2008).

Teniendo en cuenta que la giardiasis es una enfermedad gastrointestinal de humanos y otros animales, con un impacto socioeconomico importante en todo el mundo, su deteccion y diagnostico certero cobran gran importancia para la prevencion, vigilancia, control y tratamiento de la enfermedad, especialmente cuando las tecnicas microbiologicas convencionales han sido muy limitadas para lograr estos propositos (Molina et al., 2006).

Varios estudios sobre la prevalencia de la giardiasis en Colombia, indican que esta puede estar en un valor de alrededor del 12% en la poblacion general y del 28% entre ninos de 1 y 4 anos (Chaves et al., 2007; Carmona, Uscategui y Correa, 2009; Medina et al., 2009). Algunos estudios indican que para 1980 el 81,8% de las personas en el pais se encontraban parasitadas, de estas el 63% con parasitos patogenos y 18% con parasitos no patogenos. Para la zona central colombiana, que incluye el departamento del Quindio, en 1980 se reporto una prevalencia de Giardia lamblia del 13,3% y en el ano 2000 en ninos de asentamientos temporales postterremoto se encontro 60,4%, pero se desconoce la frecuencia actual de parasitismo intestinal en la poblacion de ninos de guarderias por fuera de estos asentamientos temporales, y su relacion con el estado nutricional (Lora-Suarez et al., 2002).

El objetivo de este estudio es comparar por porcentaje de pruebas positivas tres metodos de diagnostico de la giardiasis: las tecnicas convencionales basadas en concentracion y microscopia, las basadas en inmunoensayo enzimatico (ELISA) y finalmente aquellas basadas en los analisis moleculares por medio de la amplificacion por PCR del gen de la subunidad pequena ribosomal (SSU-ADNr) y el gen de la enzima triosa fosfato isomerasa (TPI), todas ellas aplicadas a la deteccion de Giardia lamblia en muestras de materia fecal humana colectadas de pacientes adscritos a un servicio de salud en la ciudad de Manizales (Caldas).

MATERIALES Y METODOS

En este estudio se analizaron 88 muestras, provenientes de materia fecal de pacientes humanos que consultaron por enfermedad diarreica al servicio de salud de la empresa prestadora de servicios de salud (ASSBASALUD) de la ciudad de Manizales (Caldas), durante los meses de junio a noviembre del ano 2010. Las muestras se colectaron en frascos coprologicos esteriles, se rotularon y almacenaron bajo refrigeracion en neveras de icopor acondicionadas con pilas refrigerantes para garantizar una temperatura de 4[grados]C, y se transportaron al Laboratorio de Genetica de la Universidad de Caldas para su procesamiento. Las muestras se sometieron a tres tipos de analisis. Primero por el metodo de concentracion de Ritchie utilizando formol-eter; luego por inmunoensayo enzimatico ELISA (Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay), mediante el kit comercial Giardia Celisa de CELLABS [R] y finalmente por amplificacion por PCR de dos secuencias genicas nucleares del parasito: gen de la subunidad pequena ribosomal (SSU-ADNr) y el gen de la enzima triosa fosfato isomerasa (TPI).

Deteccion de Giardia por concentracion (microscopia)

1 g de heces se homogenizo en 7 ml de formalina al 10% v/v. La mezcla se filtro en gasa y se transfirio a un tubo conico de centrifuga marca Falcon de 14 ml de capacidad, y se aforo a un volumen de 10 ml con eter etilico, se homogenizo por inversion y se centrifugo por 4 minutos a 1340 rpm. Cuidadosamente se recupero la capa del sedimento que contenia el concentrado del parasito, y una gota del concentrado se deposito en lamina portaobjetos a la cual se le agrego una gota de lugol parasitologico, luego fue analizada con microscopio optico utilizando el objetivo de 40X.

Deteccion de Giardia por inmunoensayo

Se utilizo el kit comercial para diagnostico de Giardia Celisa de CELLABS [R] A, el cual utiliza antigenos de los quistes de Giardia lamblia y anticuerpos monoclonales dirigidos contra dichos antigenos ligados a una placa los 96 pozos. Luego se agrega un anticuerpo policlonal conjugado con peroxidasa la cual al actuar sobre el peroxido de hidrogeno y la 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) que actua como solucion cromogenica genera un cambio de color proporcional a la concentracion de antigeno presente en la muestra. En el procedimiento se incluyo un control positivo y uno negativo, para el primero se anadio una gota del antigeno de Giardia provisto por el fabricante del kit de deteccion. Para el control negativo se anadieron dos gotas del diluyente, y en los pozos restantes se adicionaron dos gotas del diluyente y una gota de la muestra de materia fecal diluida, se homogenizo y se dejo incubar a temperatura ambiente durante una hora. El contenido de los pozos fue descartado y cada uno se lleno con el buffer de lavado provisto por el fabricante del kit, para garantizar por completo la remocion de moleculas no unidas. Este paso se repitio tres veces. Posteriormente, se anadio el anticuerpo secundario conjugado y se dejo incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Nuevamente se realizo un lavado con el buffer provisto por el fabricante del kit, se agrego el sustrato con el TMB y se incubo durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Se mezclo 2 o 3 veces el contenido de los pozos y se observo la aparicion del color azul. Luego de la incubacion se agrego a cada pozo una gota de solucion de parada, en este procedimiento se genero un cambio de color azul a amarillo cuando los resultados fueron positivos. Por ultimo, se midio la absorbancia en un rango de 450 nm en el espectrofotometro Nano Vue (General Electric--serie 110482), segun el fabricante del kit, se considero que una muestra era positiva cuando los valores de la absorbancia fueron > de 0,15. Las muestras fueron analizadas por triplicado en el mismo ensayo.

Deteccion de Giardia por metodos moleculares de amplificacion por PCR

Se usaron 200 [micron]l de la muestra concentrada en tubos de 1,5 ml para realizar una serie de tres lavados con 200 [micron]l de agua desionizada y 200 [micron]l de buffer salino fosfatado (PBS 1X, pH 7,0), mediante centrifugacion a 1500 g durante 10 minutos. Se realizo la extraccion de ADN de las 88 muestras, por el metodo fenolcloroformo-alcohol isoamilico (25:24:1) (Goncalves et al., 2008), cada muestra se proceso individualmente en camara de bioseguridad clase IIA.

Para evitar interferencias en el diagnostico individual, al iniciar cada jornada de trabajo, se realizo la extraccion de una muestra control, libre de parasitos, que permitia corroborar las condiciones del area de trabajo y la pureza de los reactivos. La cantidad y la calidad del ADN extraido, se determino por electroforesis (Sanguinetti, Dias y Simpson, 1994) y tambien con la ayuda del espectrofotometro Nano Vue a una absorbancia de 260/280 nanometros.

Los analisis moleculares correspondieron a la amplificacion por PCR de dos secuencias genicas nucleares comunmente utilizadas como identificadoras del parasito, la subunidad pequena ribosomal (SSUADNr) y el gen TPI (triosa fosfato isomerasa) (Sulaiman et al., 2003). Se utilizo la tecnica de PCR anidada con el fin de maximizar la posibilidad de deteccion de ADN genomico y con ello incrementar la sensibilidad de la prueba. Para la PCR se usaron cuatro juegos de cebadores, dos para cada uno de los genes: AL4303-AL4305, AL4304-AL4306, AL3543-AL3546 y AL3544-AL3545 (Tabla 1), la especificidad de cada uno de los cebadores se evaluo con la herramienta "nucleotide blast disponible en linea (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).

Los productos de amplificacion se separaron en geles de agarosa al 0,6% bajo condiciones de voltaje constante de 100 V y coloreados con bromuro de etidio. Para mejorar la resolucion de las bandas tambien se utilizaron geles verticales de poliacrilamida al 6% coloreados con nitrato de plata (Sanguinetti et al., 1994; Robertson et al., 2007).

RESULTADOS

Se analizaron en total 88 muestras de materia fecal humana procedentes de pacientes que consultaron con sintomas de enfermedad diarreica a la empresa prestadora de servicios de salud, y se comparo el porcentaje de pruebas positivas mediante tres metodos diagnosticos: concentracion (microscopia), inmunoensayo (ELISA) y molecular (PCR de los genes SSU-ADNr y TPI).

Empleando el metodo convencional de concentracion de muestra y microscopia optica, se pudo comprobar que los quistes de Giardia tenian forma redonda-ovalada con un tamano aproximado de 8 a 12 micrometros de diametro y una coloracion citoplasmica ambar positiva con el reactivo de lugol, lo cual concuerda con la descripcion senalada en otros estudios (Beaver, Jung y Cupp, 1984; Adam, 2001; Inpankaew et al., 2007; Molina, 2009). En las placas montadas para microscopia tambien fue posible observar la presencia de otros microorganismos parasitarios, como por ejemplo Escherichia coli, Entamoeba histolytica y levaduras.

El ADN obtenido mostro buena calidad segun el analisis espectrofotometrico. Durante la amplificacion de dos genes nucleares por PCR, la mayoria de las muestras positivas exhibieron tamanos acordes con lo reportado en la literatura (Figura 3). Sin embargo, para el gen nuclear SSU-ADNr, amplificado mediante los cebadores AL43 y PCR anidada, en 14 muestras del total analizadas se observaron productos de amplificacion cuya estimacion esta alrededor de 180 pb (Figura 4), lo cual difiere de lo reportado en otros estudios con Giardia para este marcador (Sulaiman et al., 2003).

[FIGURA 3 OMITIR]

[FIGURA 4 OMITIR]

Por concentracion y microscopia convencional en total se obtuvieron tres muestras positivas para Giardia lamblia (Figura 1). Por el metodo de inmunoensayo por ELISA se obtuvieron dos muestras positivas (Figura 2). Finalmente, por el metodo de amplificacion genica por PCR de dos loci nucleares del parasito (SSU-ADNr y TPI) se obtuvieron 26 muestras positivas (Figura 3). Los resultados de los tres ensayos se resumen en la Tabla 2.

[FIGURA 1 OMITIR]

[FIGURA 2 OMITIR]

Las mismas muestras que resultaron positivas por el metodo convencional de concentracion y microscopia, tambien lo fueron por el de inmunoensayo (ELISA) y por el de amplificacion de dos genes nucleares por PCR.

DISCUSION

Tanto el metodo convencional de diagnostico de la giardiasis por concentracion de la muestra y microscopia, como el de inmunoensayo por ELISA, presentaron bajo nivel de deteccion para la deteccion del parasito en heces humanas, comparados con los metodos moleculares basados en la amplificacion por PCR de dos genes marcadores, la subunidad ribosomal pequena (SSU-ADNr) y la triosa fosfato isomerasa (TPI). Es notablemente mayor el porcentaje de diagnosticos positivos (29,6% del total de muestras), comparado con las detecciones logradas por los otros dos metodos; 3,4% por microscopia convencional y 2,3% por inmunoensayo tipo ELISA (Tabla 2).

Estos resultados se pueden comparar con lo obtenido en otros estudios (Corinne et al., 2003; Braga y Catapani, 2005; Inpankaew et al., 2007; Miller y Sterling, 2007), los cuales reportan que los metodos de observacion de quistes al microscopio y el diagnostico del parasito por la tecnica de inmunoensayo por ELISA, fueron menos eficientes comparados con el diagnostico molecular utilizando amplificacion genica por PCR. En el trabajo de Miller y Sterling (2007) los frotis se tineron por inmunofluorescencia y los quistes fueron confirmados en tres de las ocho muestras, pero en una cantidad minima de dos a cuatro quistes por cada una, mientras que por el metodo molecular se detecto la presencia de Giardia en la totalidad de ellas.

Se debe mencionar que el metodo de inmunoensayo tiene algunos aspectos que limitan su aplicacion, pues requiere de una correcta recoleccion y conservacion de la materia fecal; ademas, se puede ver afectado por las tecnicas de concentracion utilizadas y el tiempo transcurrido desde la infeccion hasta la aparicion del parasito en heces, el cual puede ser de dos a tres semanas; por lo que suelen darse falsos negativos en los estadios iniciales de la misma o en el caso de pacientes con patrones de excrecion bajos, en los que la deteccion o confirmacion de la infeccion puede requerir el analisis de dos a tres muestras semanales durante cuatro a cinco semanas.

En los resultados de amplificacion por PCR del gen SSU-ADNr se observo que en 14 muestras analizadas existe un producto de amplificacion aproximado de 180 pb (Figura 4). Por su parte otro estudio tambien reporto un producto de amplificacion en este gen de tamano diferente al esperado (Inpankaew et al., 2007). En dicho estudio tambien se utilizaron los mismos iniciadores AL43 para el gen SSU-ADNr, y el amplicon tenia un tamano de 300 pb, excediendo hasta en 45 pb lo reportado por los demas autores. Todo esto sugiere, entre otras opciones, la presencia de un biotipo desconocido hasta ahora de Giardia lamblia presente en heces humanas en la poblacion estudiada. Otras opciones incluyen la posibilidad de amplificaciones inespecificas relacionadas con otros protozoarios asociados a la microbiota humana, como por ejemplo Chilomastix, Entamoeba o Trichomona, entre otros.

Este resultado puede dar lugar a la realizacion de nuevos estudios, que pueden incluir metodos para la determinacion de la sensibilidad y especificidad de las pruebas, incluso a traves de la secuenciacion de ADN para determinar con mayor precision las nuevas variantes geneticas que pueden existir en poblaciones humanas poco estudiadas, como es el caso de Manizales.

Estos hallazgos sugieren que estos marcadores moleculares pueden ser objeto de una variacion alelica importante entre aislamientos de la misma especie del parasito, un fenomeno que puede ser aprovechado como una herramienta eficiente para la tipificacion molecular de genotipos variables del parasito, la realizacion de estudios de zoonosis potenciales (de riesgo) y la comprension de las relaciones que deben existir entre el perfil genetico de los aislados, las manifestaciones clinicas y la respuesta a los tratamientos. Todo lo cual conduce a la planeacion de mejores estrategias de manejo, control y prevencion de la giardiasis y una mejor comprension de las dinamicas que gobiernan su epidemiologia.

Recibido el 30 de mayo de 2013 y aprobado el 18 de septiembre de 2013

AGRADECIMIENTOS

A las biologas Margarita Diaz y Carolina Osorio Solano, por su apoyo tecnico en laboratorio; a la profesora Carmen Dussan Luber, M.Sc. por la asesoria estadistica, y a todos los integrantes del grupo de investigacion GEBIOME (Genetica, Biodiversidad y Manejo de Ecosistemas) por prestarnos todo el soporte tecnico, equipos y entrenamiento requeridos. A la Entidad Promotora de Salud ASSBASALUD, por facilitar la recoleccion de las muestras para los analisis. Finalmente, a la Vicerrectoria de Investigaciones y Postgrados de la Universidad de Caldas por la financiacion del proyecto.

REFERENCIAS

* Adam, R.D. (2001). Biology of Giardia lamblia. Clinical Microbiol. Reviews, 14, 447-475.

* Barrientos, P.D., Torrico, M.C. y Suarez, E. (2008). Deteccion de Cryptosporidium spp. y Giardia lamblia en ninos inmunodeprimidos del Hospital del Nino Manuel Ascencio Villarroel de Cochabamba en Agosto de 2007. GMB, 31(1), 45-49.

* Beaver, P.C., Jung, R.C, y Cupp, E.W. (1984). Clinical Parasitology (9th ed.). Philadelphia: Lea and Febiger. p. 52-56.

* Braga, A.M. y Catapani, W.R. (2005). Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) immunoassaying versus microscopy: advantages and drawbacks for diagnosing giardiasis. Sao Paulo Med. J., 123(6), 282285.

* Caccio, S.M., De Giacomo, M., Aulicino, F.A. y Pozio, E. (2003). Giardia cysts in wastewater treatment plants in Italy. Appl. Environ. Microbiol., 69(6), 3393-3398.

* Carmona, J., Uscategui, R.M. y Correa, A.M. (2009). Parasitosis intestinal en ninos de zonas paludicas de Antioquia (Colombia). Iatreia, 22(1), 27-46.

* Chaves, M.P., Fernandez, J.A., Ospina, I., Lopez, M.C., Moncada, L. y Reyes, P. (2007). Tendencia de la prevalencia y factores asociados a la infeccion por Giardia duodenalis en escolares y preescolares de una zona rural de Cundinamarca. Biomedica, 27, 345-351.

* Corinne, F.L., Amar, P.H. y McLauchlin, J. (2003). Detection and genotyping by real-time PCR/RFLP analyses of Giardia duodenalis from human faeces. J Med Microbiol., 52, 681-683.

* Fernandez, P.S. y Diaz, P.S. (2003). Pruebas diagnosticas. Cad Aten Primaria, 10, 120-124.

* Goncalves, E.M.N., Araujo, R.S., Orban, M., Matte, G.R., Matte, M.H. y Corbett, C.E.P. (2008). Protocol for DNA extraction of Cryptosporidium spp. oocysts in fecal samples. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo, 50(3), 165-167.

* Gonzalez de la Rosa, J.B., Barbadillo Izquierdo, F., Merino Arribas, J.M. y Sanchez, J. (1999). Aparato Digestivo. Parasitosis intestinales. Protocolo diagnostico-terapeutico. Bol Pediatr, 39, 106111.

* Inpankaew, T., Traub, R., Thompson, R.C. y Sukthana, Y. (2007). Canine parasitic zoonoses in Bangkok temples. Southeast Asian J Trop Med Public Health, 38(2), 247-55.

* Izquierdo, A., Mendoza, D., Sarria, C.A. y Alvarez, G. (2006). Prevalencia de Parasitosis Intestinal en ninos de nivel primario de la Institucion Educativa Juan Maria Rejas de la localidad Tacnena de Pachia, Peru. Revista Ciencias.com. Recuperado de http://www.ilustrados.com/tema/8809/Prevalencia-ParasitosisIntestinal-ninos-nivel-primario.html

* Johnston, A.R., Gillespie, T.R., Rwego, I.B., McLachlan, T.L., Kent, A.D. y Goldberg, T.L. (2010). Molecular epidemiology of crossspecies Giardia duodenalis transmission in western Uganda. PLoS Negl Trop Dis., 4(5), e683. doi: 10.1371/journal.pntd.0000683.

* Lora-Suarez, F., Marin-Vasquez, C., Loango, N., Gallego, M., Torres, E., Gonzalez, M., Castano-Osorio, J. y Gomez-Marin J. (2002). Giardiasis in children living in post-earthquake camps from Armenia (Colombia). BMC Public Health, 2. Recuperado de http://download.springer.com/static/pdf/306/art%253A10.1186%252F1471-2458- 25.pdf?auth66=1385319461_0e96cf4c940760e2af3743cb73a649f3&ext=.pdf

* Medina, L., Garcia, M.G., Galvan, A.L. y Botero, J. (2009). Prevalencia de parasitos intestinales en ninos que asisten al Templo Comedor Sagrado Corazon Teresa Benedicta de la Cruz, del barrio Vallejuelos, Medellin, 2007. Iatreia, 22(3), 227-234.

* Miller, K.M. y Sterling, C.R. (2007). Sensitivity of Nested PCR in the detection of low numbers of Giardia lamblia cysts. Applied and environmental microbiology, 73(18), 5949-5950.

* Molina, N.B. (2009). Epidemiologia molecular de Giardia lamblia en comunidades urbanas y rurales de Buenos Aires y Mendoza, Argentina. (Tesis de Magister en Ciencias del Laboratorio Clinico). Facultad de Ciencias Exactas. Universidad Nacional de La Plata, Argentina.

* Molina, N.B., Polverino, P., Minvielle, M.C., Apezteguia, M., Aguilar, M. y Basualdo, J.A. (2006). Comparacion de metodos de lisis y extraccion de ADN de trofozoitos de Giardia lamblia. Parasitol Latinoam, 61, 133-137.

* Monis, P.T., Andrews, R.H., Mayrhofer, G. y Ey, P.L. (1999). Molecular Systematics of the Parasitic Protozoan Giardia intestinalis. Mol Biol Evol., 16(9), 1135-1144.

* Nunez, F.A. (2004). Estudio de factores asociados con la reinfeccion por Giardia lamblia en ninos de circulos infantiles. (Tesis de Doctorado). Departamento de Parasitologia, Subdireccion de Parasitologia, Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kouri". Cuba.

* Paulino, R.C. (2005). Deteccion Molecular de Giardia sp. en muestras fecales y agua: Extraccion de ADN genomico, PCR y RFLP. (Tesis de Postgrado). Universidad Federal de Parana, Brasil.

* Robertson, L.J., Forberg, T., Hermansen, L., Hamnes, I.S. y Gjerde, B. (2007). Giardia duodenalis cysts isolated from wild moose and reindeer in norway: genetic characterization by PCR-RFLP and sequence analysis at two genes. J Wildl Dis., 43(4), 576-585.

* Sanguinetti, C., Dias, N. y Simpson, A. (1994). Rapid silver staining and recovery of PCR products separates on polycrylamide gels. Biotechniques, 17, 914-919.

* Sulaiman, I.M., Fayer, R., Bern, C., Gilman, R.H., Trout, J.M., Schantz, P., Das, P., Lal, A.A. y Xiao, L. (2003). Triosephosphate Isomerase Gene Characterization and Potential Zoonotic Transmission of Giardia duodenalis. Enfermedades Infecciosas Emergentes, 9(11), 1444-1452.

* Tellez, A., Winiecka-Krusnell, J., Paniagua, M. y Linder, E. (2003). Antibodies in mother's milk protect children against giardiasis. Scand J Infect Dis, 35(5), 322-325.

* Winkworth, C.L., Learmonth, J.J., Matthaei, C.D. y Townsend, C.R. (2008). Molecular characterization of Giardia isolates from calves and humans in a region in which dairy farming has recently intensified. Appl Environ Microbiol, 4(16), 5100-5105. doi: 10.1128/AEM.

* World Health Organization. (2002). Guidelines for drinking water quality. Addendum: Microbial agents in drinking water (2nd ed.). Geneva, Switzerland: WHO.

* Yason, J.A. y Rivera, W.L. (2007). Genotyping of Giardia duodenalis isolates among residents of slum area in Manila, Philippines. Parasitol. Res., 101,681-687.

Edwin Cardona (1)

Silvia Castaneda (1)

Maria Elena Alvarez (2)

Jorge Enrique Perez (2)

Fredy Arvey Rivera Paez (3)

German Ariel Lopez Gartner (4) *

(1.) Biologo Egresado de la Universidad de Caldas.

(2.) Profesor e investigador del Grupo de Biosalud, Departamento de Ciencias Basicas para la Salud, Facultad de Ciencias para la Salud, Universidad de Caldas.

(3.) Profesor e investigador del Grupo de investigacion Genetica, Biodiversidad y Manejo de Ecosistemas, GEBIOME. Departamento de Ciencias Biologicas, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Caldas.

(4.) Profesor e investigador del Grupo de Investigacion en Tecnologias de Informacion y Redes, GITIR. Departamento de Sistemas e Informatica, Facultad de Ingenieria, Universidad de Caldas.

* Autor para la correspondencia.
Tabla 1. Secuencias de los iniciadores de PCR utilizados
en las pruebas moleculares.

Gen e iniciador *    Secuencia

Gen SSU-ADNr
AL4303               ATC CGG TCG ATC CTG CCG
AL4305               AGG ATC AGG GTT CGA CT
AL4304               CGG TCG ATC CTG CCG GA
AL4306               GGC GGA GGA TCA GGG T

Gen TPI
AL3543               AAA TIA TGC CTG CTG GTC G
AL354S               CAA ACC TTI TCC GCA AAC C
AL3544               CCC TTC ATC GGI GGT AAC TT
AL3545               GTG GCC ACC ACI CCC GTG CC

* Secuencias publicadas por Sulaiman et al. (2003). Para cada gen
se utilizaron los cuatro juegos de cebadores en PCR anidada.

Tabla 2. Porcentajes de positividad/negatividad de tres metodos
de deteccion de Giardia lamblia

                        Muestras * (numero y %)

Metodo diagnostico    Positivas      Negativas

Convencional            3 (3,4%)    85 (96,6%)
Inmunoensayo            2 (2,3%)    86 (97,7%)
PCR                   26 (29,6%)    62 (70,4%)

* Tocas las muestras que resultaron poritivas pos los
metodos convencional e inmunoensayo, tambien lo fueron
por el metodo de PCR.
COPYRIGHT 2014 Universidad de Caldas
No portion of this article can be reproduced without the express written permission from the copyright holder.
Copyright 2014 Gale, Cengage Learning. All rights reserved.

Article Details
Printer friendly Cite/link Email Feedback
Author:Cardona, Edwin; Castaneda, Silvia; Alvarez, Maria Elena; Enrique Perez, Jorge; Rivera Paez, Fredy Ar
Publication:Luna Azul
Date:Jan 1, 2014
Words:4471
Previous Article:Evaluacion ambiental asociada a la explotacion del yacimiento de materiales de construccion la Inagua, Guantanamo, Cuba.
Next Article:Metodologia para el diagnostico de areas urbanas con alta exposicion a radiaciones electromagneticas emitidas por estaciones base de telefonia movil.
Topics:

Terms of use | Privacy policy | Copyright © 2019 Farlex, Inc. | Feedback | For webmasters