Colecciones biologicas: una alternativa para los estudios de diversidad genetica.
BIOLOGICAL COLLECTIONS: AN ALTERNATIVE FOR GENETICS DIVERSITY STUDIESINTRODUCCION
Colombia es reconocida internacionalmente, como un pais megadiverso, el cual alberga el 10 % de la biodiversidad del planeta, representando actualmente, un 20 % del total de aves del mundo, 7 % de mamiferos terrestres y 6 % del total de reptiles (FIERRO, 2012). El Instituto de Investigacion de Recursos Biologicos Alexander von Humboldt (IAvH), reporta que, hasta el 2009, se habian evaluado en Colombia, 47.677 especies de las cuales, el 36 %, se considera en peligro de extincion, segun la Union Internacional para la Conservacion de la Naturaleza (UICN), (SECRETARIA DEL CONVENIO SOBRE LA DIVERSIDAD BIOLOGICA, 2010).
Segun el IAvH (2010), en Colombia, se registran 1.971 especies de plantas y animales amenazadas, que precisan de esfuerzos para la implementacion de estrategias de conservacion y uso sostenible de estos recursos biologicos. Este panorama de impacto, sobre la biodiversidad, se ve influenciado por diferentes acciones antropogenicas, que afectan areas, con elementos bioticos diversos, aun sin descubrir a lo largo del territorio colombiano, con gran numero de especies de fauna y flora, caracterizada por una restringida distribucion geografica, lo cual implica, una alta tasa de endemismos y por consiguiente, una alta vulnerabilidad de estas especies (FIERRO, 2012). No obstante, los estudios sobre biodiversidad (inventarios, monitoreos, estudios de linea base, entre otros), realizados por universidades nacionales, grupos o centros de investigacion, que generalmente, capturan ejemplares, que luego son preservados (voucher specimens), en colecciones cientificas publicas o privadas (PAEZ, 2004; VALLEJO & ACOSTA, 2005; CRISTIN & PERRILLIAT, 2011). Estas colecciones biologicas, han sido de especial relevancia para la profundizacion, de estudios biologicos, ecologicos, sistematicos, que son aprovechados por investigadores nacionales o extranjeros, incluso, para el intercambio de especimenes (MESA, 2005).
Las colecciones biologicas, han sido fundamentales para la conservacion del patrimonio biologico, al promover el conocimiento de la biodiversidad y sus usos, ademas apoyan, el desarrollo de investigaciones, que contribuyen con el inventario nacional de biodiversidad (SIMMONS & MUNOZ-SABA, 2005; DELGADILLO & GONGORA, 2009; CRISTIN & PERRILLIAT, 2011). Tradicionalmente, estas colecciones, se han utilizado como herramientas de docencia, para realizar comparaciones morfologicas/biometricas y/o para identificacion de especies. Son escasas las investigaciones moleculares, que se han adelantado utilizando ejemplares de colecciones biologicas colombianas. La mayoria de estos estudios, se han desarrollado en las areas de: sistematica clasica, ecologia y biogeografia (PAEZ, 2004; MESA, 2005; DELGADILLO & GONGORA, 2009).
Las investigaciones moleculares, registran dificultad para realizar estudios que involucren especimenes de museo, debido al notable deterioro de biomoleculas como el ADN y las proteinas, por efecto de las sustancias fijadoras, como: el formaldehido, parafina, alcohol etilico; utilizadas comunmente, para la preservacion de los ejemplares. Ademas, en algunos casos, se carece de la informacion de campo (geografica y ambiental), en el trabajo curatorial y registro de la informacion detallada (SHEDLOCK et al., 1997; SRINIVASAN et al., 2002; BOSCH et al., 2005; CAUDRON et al., 2007).
La obtencion de muestras de especies silvestres para la realizacion de estudios moleculares, sigue siendo una de las principales limitaciones, para el avance de este tipo de investigacion, debido a que muchas veces, requieren el sacrificio del animal (muestras destructivas); en otras ocasiones, es necesario la captura, para realizar la extraccion de sangre o hacer la biopsia (muestra invasiva); mientras que, en otros casos, se puede obtener el ADN, sin capturar, ni fatigar al animal (plumas sueltas, escamas de muda, heces, entre otras) o recolectando las muestras de tejido muscular, de cadaveres de animales encontrados en el campo (muestra noinvasiva) (TABERLET et al., 1999). Se considera que las muestras de las colecciones biologicas de museos, pertenecen a esta ultima categoria (BOSCH et al., 2005). Por consiguiente, es evidente, que las colecciones biologicas, deben permanecer bajo un enfoque de conservacion preventiva, con un gran potencial para profundizar en el conocimiento de la biodiversidad, incluso, en el nivel molecular (SIMONS & MUNOZ, 2005; DELGADILLO & GONGORA, 2009).
Esta investigacion, exploro la viabilidad de utilizar como fuente de extraccion de ADN, especimenes conservados en las colecciones biologicas de tres museos colombianos, que facilite, la obtencion de informacion, en el estudio de la variabilidad genetica de la especie B. schlegelii. Este tipo de analisis, puede ser un elemento fundamental para adelantar estudios: filogeneticos, biogeograficos, ecologicos y toxicologicos, con especimenes depositados en museos. Para el caso B. schlegelii, el estudio tiene una importancia destacada, debido a que la especie, presenta, ademas de discrepancias taxonomicas, una variacion en la composicion del veneno, sumado a que los accidentes por esta especie, ocupan el primer lugar en las zonas cafeteras y en el norte de Antioquia (QUINTANA et al., 2000; CASTOE & PARKINSON, 2006; ARIKAN et al., 2008). De esta forma, con la caracterizacion molecular de las diferentes poblaciones de B. schlegelii, es posible asociar la composicion del veneno, ademas de realizar investigaciones toxicologicas y bioquimicas (ALAPE-GIRON et al., 2008).
MATERIALES Y METODOS
Se revisaron las colecciones biologicas de tres museos colombianos (Anexo 1), durante los meses de septiembre, octubre y noviembre, de 2010: Serpentario y Coleccion Biologica de la Universidad del Cauca (MHNUC-Se), Coleccion Biologica del Colegio San Jose del Instituto Tecnologico Metropolitano (CSJ-H) y Museo de Historia Natural de la Universidad de Caldas (MHN-UC). Se analizaron 60 individuos (18 del MHNUC-Se, 38 de la CSJ-H y 4 de MHN-UC), de la especie B. schlegelii, fijados en formaldehido al 10 % y posteriormente, en alcohol etilico, al 75 % (MESA, 2005; SIMMONS & MUNOZ-SABA, 2005), de cada especimen, se obtuvieron fragmentos de escamas ventrales (2 [cm.sup.2] de muestra, equivalentes aproximadamente, a seis escamas de un organismo adulto). Cada muestra, se rotulo y almaceno, en tubos Eppendorf de 1,5 mL, con etanol al 70 %, segun lo recomendado por SALOMAO et al. (1999) y CAMPBELL-STATON (2008).
Las muestras se limpiaron con una solucion tampon fosfato salina (conocida por sus siglas en ingles como PBS; pH = 7,2), que remueve o elimina el fijador y disminuye la probabilidad de inhibir la reaccion de PCR, segun el protocolo comercial de QIAGEN (2006). La extraccion del ADN, se realizo por los metodos Fenol-CloroformoAlcohol-Isoamilico (KOCHER et al., 1989, BELLO et al., 2001) y el DNeasy blood and tissue kit de Qiagen (VIDAL et al., 2007), macerando una o dos escamas, de cada organismo (25 mg de muestra).
La cantidad y calidad de ADN, se determino mediante un espectrofotometro, marca NanoVue, utilizando la razon de absorbancia de 260/280 nm, donde valores entre 1,6 y 1,9 se consideran indicadores de buena calidad del ADN y muestras con valores < 1,6 pueden indicar la presencia de proteinas u otros elementos absorbentes de UV en la muestra, tales como compuestos organicos, entre ellos el fenol. Los valores > 1,9 indican la presencia de ARN (AMARU et al., 2006; LOPERA-BARRERO et al., 2008).
La amplificacion por PCR para el estudio de regiones correspondientes a los genes mitocondriales 12S, 16S y COI (Citocromo Oxidasa I), se evaluaron con los iniciadores 12Sai-12Sbi; 16Sa-16Sb (SIMON et al., 1994; OGDEN & WHITING, 2005; SHEKHAR et al., 2005), LCO1490-HCO2198 (FOLMER et al., 1994). Ademas, se disenaron dos parejas de iniciadores (18Sf-18Sr y 28Sf-28Sr), para los genes 18S y 28S del ADN ribosomal (Tabla 1), utilizando las secuencias del GenBank EF125058, de la especie Cerastes cerastes y M59413, de la especie Heterodon platirhinos. El diseno de iniciadores, se realizo con el programa Primer-BLAST.
La mezcla de reaccion para PCR, se llevo a cabo en 20 [micron]L, que contenian de 2 a 4 [micron]L de ADN, 0,8 mM de la mezcla de dNTP's, 1 unidad de Taq polimerasa, 1,5 mM de MgCl2, 0,4 [micron]M, de cada iniciador y 2 [micron]L del buffer 10X para PCR. La amplificacion, se realizo en un termociclador (Bio-Rad PTC-100), con el siguiente perfil termico: desnaturalizacion inicial de 95[grados]C x 5 min, seguido de 30 ciclos de desnaturalizacion, a 94[grados]C x 30 s, anillamiento a 50[grados]C x 30 s, extension a, 72[grados]C x 1 min y una elongacion final de 72[grados]C por 5 minutos. Los amplicones, se visualizaron, en geles de poliacrilamida al 6 %, coloreados con nitrato de plata (SANGUINETTI et al., 1994; GARCIA, 2000).
Conociendo las limitaciones y dificultades, que pueden presentarse en la amplificacion de ADN procedente de muestras obtenidas, de las colecciones biologicas (TABERLET et al., 1999; BOSCH et al., 2005), los iniciadores de PCR, se evaluaron utilizando como controles positivos, el ADN obtenido de escamas y mudas (almacenadas posteriormente, en alcohol al 70 %, sin pasar por un proceso de fijacion con formol) de tres organismos vivos de B. schlegelii y otro del genero Clelia. Para la prueba piloto, sobre tejido fijado en formol, se utilizo un ejemplar del genero Bothrops, que fue fijado por el metodo tradicional con formalina (formol o formaldehido) al 10 % y preservado en alcohol al 70 %, segun los protocolos para la preservacion y el manejo de las colecciones biologicas colombianas (MESA, 2005; SIMMONS & MUNOZ-SABA, 2005). Los productos de amplificacion por PCR, fueron visualizados en geles de poliacrilamida al 6 %, coloreados con nitrato de plata (SANGUINETTI et al., 1994; GARCIA, 2000).
RESULTADOS
Si se tiene en cuenta la evaluacion de ADN planteada por AMARU et al. (2006) y LOPERA-BARRERO et al. (2008), con el protocolo de extraccion tradicional con FenolCloroformo-Alcohol-Isoamilico, se logro extraer ADN de buena calidad, 11 de 60 muestras estudiadas (18,33 %), las concentraciones variaron entre 31 y 130,5 ng/ [micron]L. Con el kit comercial Qiagen DNeasy blood and tissue, se logro extraer ADN de buena calidad a partir de 54 muestras (90 %), con concentraciones, que oscilaron entre 103 y 160,5 ng/[micron]L. El ADN procedente de muestras de organismos vivos, fue de buena calidad (a excepcion de la muestra de Bothrops asper), independientemente, del metodo de extraccion utilizado y con un rango de variacion en la concentracion del ADN entre 110 y 125,5 ng/[micron]L.
Las amplificaciones del ADN por PCR, mostraron iniciadores muy sensibles para ser utilizados en estas muestras (Figura 1 y Tabla 2) y otros, se ven limitados para utilizarlos en la amplificacion de ADN procedente de colecciones biologicas. La evaluacion de los dos metodos de extraccion, mostraron diferencias en la eficiencia de extraccion del ADN a favor del kit comercial de Qiagen, lo cual se ve reflejado tambien, en la eficiencia de la amplificacion por PCR (Tablas 2 y 3).
[FIGURA 1 OMITIR]
DISCUSION
El porcentaje de eficiencia en la extraccion de ADN, a partir de muestras de especimenes de Bothriechis schlegelii, depositados en colecciones biologicas, fue superior ([aproximadamente igual a] 72 % mas efectivo) con el kit comercial DNeasy blood and tissue, frente al metodo tradicional Fenol-Cloroformo-Alcohol-Isoamilico. Los resultados, apoyan la hipotesis que, es posible extraer ADN, eficientemente, a partir de muestras depositadas, en museos o en colecciones biologicas, con aplicacion en estudios moleculares, que impliquen la amplificacion posterior por PCR, de genes mitocondriales y nucleares, permitiendo obtener un elevado numero de copias de una region concreta de este acido nucleico; incluso, partiendo de una minima cantidad inicial, ha facilitado extraordinariamente, el estudio con muestras que contienen poco ADN. Estos resultados, son concomitantes, con lo reportado por JIMENEZ et al. (2007), quienes extrajeron ADN, de material biologico parafinado en muestras patologicas, como: tumor congenito de pulmon, tumor de base del higado, osteosarcomas, entre otros.
La cantidad y calidad del ADN obtenido de los ejemplares de museo, fue suficiente para optimizar reacciones de PCR (Tabla 2). En este sentido, CAMPBELL-STATON (2008), obtuvieron resultados similares, a partir de muestras de ADN procedente de piel de reptil, con concentraciones de ADN, dentro del rango de 4,2 a 95,9 ng/ [micron]L. Asi mismo, SHEDLOCK et al. (1997), obtuvieron mas de un 82 %, de exito, al amplificar fragmentos de ADN mitocondrial de tamanos inferiores a 500 pb, a partir de muestras de tejido fijados en formol y posteriormente, preservados en alcohol, las cuales fueron extraidas, con el metodo clasico Fenol-Cloroformo-Alcohol-Isoamilico, con algunas modificaciones.
Se ha reportado, que las muestras procedentes de organismos fijados en formol, conservan la arquitectura del tejido y que, aunque es posible extraer ADN, su calidad se ve disminuida por la solucion fijadora, debido a que esta, produce entrecruzamiento (cross-linkage), entre los acidos nucleicos e hidroliza los puentes fosfodiester del ADN (DOUGLAS & ROGERS, 1998; GARCIA et al, 2006; JIMENEZ et al., 2007). SRINIVASAN et al. (2002) y VILLALOBOS (2006), indican que el tiempo de almacenamiento (a menor tiempo, menor ruptura del ADN), tamano del tejido y el pH del fijador utilizado para la conservacion de especimenes de museo, son cruciales para la obtencion de un ADN de buena calidad. FRANK et al. (1996), reportan que el control del pH, no era una practica comun en decadas pasadas, por tanto, puede que el fijador, afecte en mayor medida las muestras mas antiguas. Por otra parte, BEN-EZRA et al. (1991), registran que los tejidos fijados en formalina, permiten recuperar ADN de baja calidad, lo que hace dificil la amplificacion por PCR. NOGUCHI et al. (1997) y JIMENEZ et al. (2007), publicaron que la amplificacion por PCR de ADN aislado de muestras parafinadas y en formalina, es inconsistente, debido a la baja cantidad, ausencia o degradacion, casi completa del ADN causada por la formalina o la presencia de inhibidores de extraccion, incluso por el PCR, aunque esto, tambien se ve influenciado por las diferencias del metodo de extraccion.
En el presente estudio, la amplificacion por PCR, mostro variacion en el rango de eficiencia: entre 6,7 % y 100 %. Estas diferencias se pueden asociar con: 1) numero de repeticiones mayores de los genes mitocondriales por celula, con respeto al genoma nuclear, fenomeno reportado por DIAZ & BRADY (1997) y COOMBS et al. (1999). 2) tamano del fragmento de ADN amplificado, observado por GARCIA et al. (2006) y VILLALOBOS (2006), quienes reportaron amplificaciones exitosas con tamanos < 500 pb, independientemente, de las soluciones fijadoras utilizadas (incluida la formalina acida). Asimismo, FRANK et al. (1996), GIANNELLA et al. (1997) y NARDELLI et al. (2011), reportaron amplificaciones < 420 pb. GARCIA et al. (2006), argumentan, que el rompimiento del ADN, generalmente, en fragmentos cortos por el formaldehido, puede generar problemas en la obtencion de material genetico de buena calidad, necesario para la amplificacion por PCR, por lo cual, sugieren la utilizacion de iniciadores que generen amplicones cuyos pesos esperados sean bajos. 3) el estado de preservacion y almacenamiento de las muestras, tal como lo afirman FRANK et al. (1996), BERNSTEIN et al. (2002), JIMENEZ (2005) y MESA (2005), quienes lo atribuyen al efecto de las caracteristicas y propiedades de la solucion fijadora en la calidad del ADN obtenido. BEN-EZRA et al. (1991), mencionan que la magnitud del dano del ADN, es mayor con el paso de los anos de preservacion, todo lo cual, pone en evidencia, el alto riesgo de fragmentacion del ADN, con el paso del tiempo, cambios de temperatura y la solucion fijadora utilizada.
MESA (2005), indica que en Colombia, son pocas las colecciones biologicas que consideran la conservacion de tejidos, de tal forma que, se maximice la factibilidad y que puedan ser utilizados mas adelante para analisis moleculares. En este estudio, se hizo evidente, la posibilidad de amplificacion de ADN por PCR, independientemente, del tiempo de preservacion, de ejemplares de colecciones biologicas, conservadas en formol (en algunos casos con mas de 70 anos de preservacion).
En conclusion, este estudio sugiere la viabilidad, de utilizar muestras de material biologico procedente de especimenes de museo o colecciones biologicas, como una alternativa para los analisis de biodiversidad, basados en pruebas moleculares y de diversidad genetica, sin tener que realizar, esfuerzos de muestreo que implique mayor costo, riesgo y esfuerzo de colecta, ni tampoco, el sacrificio de animales silvestres, especialmente, especies en peligro de extincion o bajo alguna categoria de amenaza.
AGRADECIMIENTOS
Vicerrectoria de Investigaciones y Posgrados de la Universidad de Caldas por la financiacion de este proyecto. Fundacion Alejandro Angel Escobar, por el auxilio, a traves del fondo de apoyo a la investigacion, Beca Colombia Biodiversa convocatoria 2010. Serpentario y Coleccion Biologica de la Universidad del Cauca. Museo de Historia Natural de la Universidad de Caldas. Coleccion Biologica del Colegio San Jose del Instituto Tecnologico Metropolitano de Medellin (ITM-San Jose). Centro de Investigacion y Asesoria Ofidica "Ophidia" de Manizales, Caldas.
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Anexo 1. Ejemplares de Bothriechis schlegelii
(fijados en formol al 10 % y posteriormente,
en alcohol etilico al 75 %), de tres museos
colombianos.
Codigo de Coleccion Procedencia Colector
MHNUC-Se-000371 Cauca, Totoro *
MHNUC-Se-000132 Cauca, Piendamo Santiago Ayerbe MD.
Cauca, Cajibio,
Corregimiento La
MHNUC-Se-000442 Capilla, Vereda La Andres Cortes
Union, Vertiente
Oriental de la
Cordillera
Occidental
MHNUC-Se-000038 Cauca, Popayan, Km Santiago Ayerbe MD.
2, via
Popayan-Totoro
Cauca, El Tambo, Via
Popayan-Lopez
MHNUC-Se-000372 de Micay, Vertiente Fernando Campo
Pacifica de la
Cordillera
Occidental, Km 81
MHNUC-Se-000384 Cauca, Popayan, de Francisco Jose Lopez
la Panamericana via
a la Hacienda
Calibio
MHNUC-Se-000129 Cauca, El Tambo, Santiago Ayerbe MD.
Vereda La Playa,
Vertiente Pacifica
de la Cordillera
Occidental
MHNUC-Se-000127 Cauca, Popayan, La Santiago Ayerbe MD.
Cabuyera
MHNUC-Se-000133 Cauca, Popayan, Rio Santiago Ayerbe MD.
Palace
MHNUC-Se-000130 Cauca, El Tambo, Santiago Ayerbe MD.
Vereda La Playa,
Vertiente Pacifica
de la Cordillera
Occidental
MHNUC-Se-000131 Cauca, El Tambo, La Santiago Ayerbe MD.
Playa, Vertiente
Pacifica de la
Cordillera
Occidental
MHNUC-Se-000015 Cauca, El Tambo, Santiago Ayerbe MD.
Hacienda Las Torres,
Rio San Joaquin,
Vertiente Pacifica
de la Cordillera
Occidental
MHNUC-Se-000134 Cauca, Totoro, Santiago Ayerbe MD.
Novirao
MHNUC-Se-000128 * *
Cauca, El Tambo,
Hacienda La
MHNUC-Se-000037 Primavera, Rio San *
Joaquin, Vertiente
Pacifica de la
Cordillera
Occidental
MHNUC-Se-000117 Cordoba, Alto Kjell von Sneidern
Quimari
MHNUC-Se-000216 Cauca, Popayan, Santiago Ayerbe MD.
Julumito
MHNUC-Se-NR Risaralda, Pereira Edwin Royer
Finca El Cedral
(Finca de Carton de
Colombia)
CSJ-H-4761 Antioquia, Sonson *
CSJ-H-4759 Choco *
CSJ-H-4758 Antioquia, Santo *
Domingo
CSJ-H-4757 Antioquia, La Ceja *
CSJ-H-4760 Antioquia, Andes *
CSJ-H-4771 * *
CSJ-H-4769 Antioquia, Medellin, *
El Poblado
CSJ-H-4768 Antioquia, San Pedro *
CSJ-H-4767 Antioquia, San Pedro *
CSJ-H-4766 Antioquia, San Pedro *
CSJ-H-4764 Antioquia, San Pedro *
CSJ-H-4762 Antioquia, San Pedro *
CSJ-H-4765 Antioquia, San Pedro *
CSJ-H-4778 Antioquia, San Pedro *
CSJ-H-4777 Antioquia, Andes *
CSJ-H-4776 Antioquia, Medellin, *
Los Caunces
CSJ-H-4808 Antioquia, San Pedro *
CSJ-H-4775 Antioquia, San Pedro *
CSJ-H-4774 Antioquia, Medellin, *
Santa Elena
CSJ-H-4773 Antioquia, Medellin, *
Santa Elena
CSJ-H-4772 Antioquia, La Ceja *
CSJ-H-4784 Risaralda, Santa *
Rosa de Cabal
CSJ-H-4770 Antioquia, San Carlos *
CSJ-H-4782 Antioquia, San Pedro *
CSJ-H-4783 Antioquia, Yolombo, *
La Cancana
CSJ-H-4755 Antioquia, Amalfi, *
Rio Riachon
CSJ-H-4754 Antioquia, Santa *
Rosa de Osos
CSJ-H-4750 Antioquia, La Ceja *
CSJ-H-4749 Antioquia, Belmira *
CSJ-H-4807 Antioquia, San *
Pedro, La Lana
CSJ-H-4752 Antioquia, Sopetran *
CSJ-H-4753 Antioquia, Santa *
Rosa de Osos, San
Isidro
CSJ-H-4751 Antioquia, Andes *
CSJ-H-4747 Antioquia, Sonson *
CSJ-H-4748 Antioquia, La Ceja *
CSJ-H-4780 Antioquia, San Pedro *
CSJ-H-4779 Antioquia, Medellin, *
Santa Elena
CSJ-H-4781 Antioquia, San Pedro *
MHN-UC-0082 Caldas, Manizales, Gina Maria Duque
Barrio Centenario
MHN-UC-0057 Caldas, Manizales *
MHN-UC-R-0001 Caldas, Samana, Jose Vicente Rueda
Selva de Florencia
MHN-UC-0081 Caldas, Manizales Jesus Velez Estrada
Codigo de Coleccion Ano de Colecta
MHNUC-Se-000371 1960
MHNUC-Se-000132 1991
MHNUC-Se-000442 2004
MHNUC-Se-000038 *
MHNUC-Se-000372 *
MHNUC-Se-000384 2001
MHNUC-Se-000129 1994
MHNUC-Se-000127 1993
MHNUC-Se-000133 1985
MHNUC-Se-000130 *
MHNUC-Se-000131 1998
MHNUC-Se-000015 *
MHNUC-Se-000134 1995
MHNUC-Se-000128 *
MHNUC-Se-000037 *
MHNUC-Se-000117 1949
MHNUC-Se-000216 2000
MHNUC-Se-NR 2010
CSJ-H-4761 1986
CSJ-H-4759 1941
CSJ-H-4758 1989
CSJ-H-4757 *
CSJ-H-4760 1951
CSJ-H-4771 *
CSJ-H-4769 1969
CSJ-H-4768 1937
CSJ-H-4767 1933
CSJ-H-4766 1965
CSJ-H-4764 1965
CSJ-H-4762 1960
CSJ-H-4765 *
CSJ-H-4778 *
CSJ-H-4777 *
CSJ-H-4776 1956
CSJ-H-4808 *
CSJ-H-4775 *
CSJ-H-4774 1964
CSJ-H-4773 *
CSJ-H-4772 1957
CSJ-H-4784 1972
CSJ-H-4770
CSJ-H-4782 1985
CSJ-H-4783 1988
CSJ-H-4755 1988
CSJ-H-4754 1966
CSJ-H-4750
CSJ-H-4749 1964
CSJ-H-4807 1994
CSJ-H-4752 1999
CSJ-H-4753 1998
CSJ-H-4751 *
CSJ-H-4747 *
CSJ-H-4748 *
CSJ-H-4780 1984
CSJ-H-4779 1960
CSJ-H-4781 1965
MHN-UC-0082 2002
MHN-UC-0057 *
MHN-UC-R-0001 1992
MHN-UC-0081 1985
* No se tiene informacion.
Paula A. Ossa L. (1), Javier Mauricio Giraldo M. (1), German Ariel Lopez G. (1), Lucimar G. Dias (1), Fredy A. Rivera P. (1)
* FR: 24-V-2012. FA: 24-VIII-2012.
(1) Grupo de investigacion: Genetica, Biodiversidad y Fitomejoramiento: GEBIOME, Departamento de Ciencias Biologicas, Facultad de Ciencias exactas y Naturales, universidad de Caldas, Manizales, Caldas, Colombia. e-mail: paulaandrea_ossa@hotmail.com, plamao43@hotmail.com, german.lopez@ucaldas.edu.co, lucimar. dias@ucaldas.edu.co, fredy.rivera@ucaldas.edu.co.
Tabla 1.
Iniciadores utilizados para la caracterizacion molecular
de Bothriechis schlegelii.
Gen Iniciadores Secuencia de los iniciadores (5'-3')
18Sr 18Sforward ACAAACGTTTACATGGATAACCGTGGT
18Sreverse CGCGCCTGCTGCCTTCCTTA
28Sr 28Sforward CGGTAACGCGACCGATCCCG
28Sreverse CCTCTCTCGGGGCGAACCCA
COImt LCO1490 GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
HCO2198 TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
16S mt 16Sa GCCTGTTTATCAAAAACAT
16Sb CTCCGGTTTGAACTCAGATCA
12S mt 12Sai AACTACGATTAGATACCCTATTAT
12Sbi AAGAGCGACGGGCGATGTGT
Tabla 2. Comparacion de metodos de extraccion de ADN de
Bothriechis schlegelii de tres colecciones biologicas
colombianas a traves de amplificacion por PCR.
Iniciador METODO DE EXTRACCION DE ADN
Fenol-Cloroformo- DNeasy blood and
Alcohol Isoamilico tissue Kit
A NA % de A NA % de
eficiencia eficiencia
16Sa-16Sb 25 35 41,7 22 38 36,7
12Sa-12Sb 0 60 0 4 56 6,7
28Sf-28Sr 24 36 40 60 0 100
18Sf-18Sr 27 33 45 54 6 90
A: Amplifico, NA: No amplifico.
Tabla 3. Peso molecular aproximado en pares de bases (pb)
de las muestras amplificadas con los diferentes marcadores
moleculares.
Gen Iniciador Bothriechis Clelia Bothrops
schlegelii clelia asper
16Smt 16Sa-16Sb 600 600 600
12S mt 12Sai-12Sbi 380 380 380
COI mt LCO1490-HCO2198 890 890 --
28r 28Sf-28Sr 115 115 115
18r 18Sf-18Sr 300 300 300
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