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Cobre antimicrobiano contra patogenos intrahospitalarios en Peru.

Antimicrobial copper against nosocomial pathogens in Peru

INTRODUCCION

Las superficies duras que existen en la mayoria de hospitales, tales como pisos, rieles de cama, mesa de noche y manijas de puertas, que generalmente estan en contacto constante con los pacientes y el personal de salud, ayudan a la propagacion de microorganismos (1-3). Recientemente se ha descrito que las superficies blandas contaminadas, tales como sabanas, pijamas, cortinas, mandiles, cubre almohadas, actuan como reservorio y fuentes de patogenos que pueden contaminar directamente a pacientes y al personal del hospital (4).

Se han aplicado diversas medidas para reducir el riesgo de transmision de patogenos, que incluyen mejorar la vigilancia de las infecciones nosocomiales, uso de antibioticos agresivos para reducir la expansion de cepas resistentes a antibioticos, capacitaciones al personal de salud para mejorar la higiene y aislamiento de pacientes infectados; estas estrategias implican inversiones continuas por parte del Estado. Sin embargo, el impacto es minimo sobre las IIH (3,5,6).

Los materiales metalicos predominantes en los hospitales son el acero inoxidable y el aluminio. Estos metales no tienen efecto alguno sobre los patogenos y constituyen reservorios o fuentes de propagacion por contacto. Tras varios estudios, se demostro que el cobre posee un gran potencial biocida capaz de eliminar a patogenos nosocomiales (7-9), bacterias contaminantes de la industria alimentaria (10), virus (4) y hongos (8). Actualmente, existe un gran interes en el uso del cobre como material antimicrobiano. Se establecio el termino contact killing (muerte por contacto) debido a la rapidez con la que elimina a una bacteria (11). La no existencia de un mecanismo claro de accion (11) ha llevado a la elaboracion de un modelo tentativo, en el cual la bacteria al entrar en contacto con la superficie disuelve el cobre en concentraciones muy pequenas, lo que condiciona el inicio del dano celular (12). Posteriormente, la membrana celular se rompe debido al cobre y por fenomenos de estres--lo que produce la perdida del potencial de membrana y el vertido del contenido citoplasmatico--, los iones de cobre inducen la generacion de especies reactivas de oxigeno (ROS) (13) que aumentan el dano celular producido (11,12), y el ADN genomico y plasmidial comienza a ser degradado (12).

Las superficies de cobre con sus propiedades antimicrobianas y su facil implementacion en hospitales y centros de salud pueden ser una importante contribucion al control de las infecciones, que implicaria la reduccion del hacinamiento de pacientes en tratamiento, la diseminacion de patogenos via aerea o por contacto, asi como el uso de farmacos a los que gran variedad de patogenos han adquirido resistencia. Esto se ha demostrado recientemente en ensayos hospitalarios exitosos en paises como Estados Unidos (14), Reino Unido (7,15), Sudafrica (8), Suiza (16) y Chile (9). Sin embargo, en el Peru no existe evidencia cientifica que compruebe la propiedad antimicrobiana del cobre frente a las principales bacterias patogenas causantes de IIH, como E. coli, P. aeruginosa y S. aureus.

METODOS

Se evaluo nueve cepas--3 de E. coli, 3 de S. aureus y 3 de P aeruginosa, procedentes de la unidad de cuidados intensivos del Hospital Regional Docente "Las Mercedes" (HRDLM), Chiclayo, y del Hospital Provincial Docente "Belen" (HPDB), Lambayeque. Todas las cepas fueron aisladas en agar sangre e identificadas bioquimicamente en el laboratorio (tabla 1).

Las laminas de cobre y acero inoxidable fueron obtenidas comercialmente.

Para el experimento, las nueve cepas bacterianas fueron sembradas e incubadas independientemente en agar TSA (Merck) (9), selladas hermeticamente y almacenadas en refrigeracion a 4[grados]C.

Para la evaluacion de la actividad bactericida de las superficies de cobre, se siguio el modelo (7) modificado, el cual se describe a continuacion.

Las laminas de cobre C11000 proporcionado por Storm Copper y acero inoxidable (JN aceros) fueron cortadas en tamanos de 1 [cm.sup.2]. Nueve laminas para cada metal fueron envueltas en papel y esterilizadas en autoclave por 1 hora, luego sumergidas en etanol (Merck) al 95% y flameadas al mechero por 2 segundos; despues fueron transferidas a placas Petri esteriles.

Los viales conteniendo las nueve cepas bacterianas, se retiraron de refrigeracion a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego una colonia de cada cepa se transfirio a 2 mL de caldo nutritivo e incubo a 37[grados]C por 16 horas. Los cultivos bacterianos resultantes se diluyeron con agua destilada esteril hasta alcanzar ~2 x [10.sup.7] UFC/mL de acuerdo al tubo numero 0,5 del nefelometro de Mac Farland (9).

En cada lamina de cobre y acero inoxidable se inoculo 10 [micron]L de las suspensiones bacterianas (2 x [10.sup.7] UFC/ mL). Cada inoculo fue distribuido sobre el metal con una punta esteril de 10 [micron]L. Se incubo las laminas metalicas por triplicado a temperatura ambiente, a diferentes tiempos de exposicion ([t.sub.0] = 0 min, [t.sub.1] = 5 min, [t.sub.2] = 10 min, [t.sub.3] = 15 min, [t.sub.4] = 20 min, [t.sub.5] = 30 min, [t.sub.6] = 45 min, [t.sub.7] = 60 min, t = 75 min).

Para retirar las bacterias de la superficie metalica se procedio con un lavado, sumergiendo el metal con el inoculo dentro de un tubo esteril con 1 mL de solucion salina fisiologica. Despues, se agito por un minuto y se retiro el metal. Posteriormente, la suspension celular resultante fue sometida a las siguientes diluciones: [10.sup.-1], [10.sup.-2], [10.sup.-3] y [10.sup.-4]. Luego, 10 [micron]L de la dilucion [10.sup.-4] fueron sembrados en placa por la tecnica de la microgota (8) y se incubo a 36[grados]C por 24 horas. Este procedimiento se siguio para todos los tiempos de exposicion.

El tiempo necesario para que las superficies de cobre eliminaran a las cepas en estudio fue determinado por triplicado, considerandose cuando no se encontro crecimiento de bacterias en los cultivos. El rango de exposicion fue de 75 minutos, seccionados en 9 tiempos.

Para el analisis estadistico, los resultados obtenidos para la actividad de las superficies de cobre fueron comparados con el control de acero inoxidable y con la formacion de CFU/mL de las cepas en estudio. La significancia se obtuvo mediante el analisis de ANOVA de una via utilizando el software MINITAB. Posteriormente, se realizo una prueba de Tuckey (p<0,05), para establecer el grupo determinado de estas diferencias mediante la utilizacion del software Sigma plot version 13.

RESULTADOS

Para determinar la actividad bactericida de las superficies de cobre sobre las cepas de estudio (tabla 1), se utilizo como control laminas de acero inoxidable.

El analisis de varianza ANOVA permitio determinar que existieron diferencias significativas entre el crecimiento de las cepas en estudio ([F.sub.8,162]=107,34; P<0,05) y los distintos tiempos de exposicion al cobre y al acero inoxidable: [t.sub.0]= 0 min, [t.sub.4] = 5 min, [t.sub.2]= 10 min, [t.sub.3]= 15 min, [t.sub.4]= 20 min, [t.sub.5]= 30 min, [t.sub.6]= 45 min, [t.sub.7]= 60 min y t8= 75 min ([F.sub.8,162] = 892,14; P<0,05). Para encontrar donde se hallaban estas significancias, se aplico el analisis Tuckey, determinando que existen diferencias significativas en: (1) en dos cepas de E. coli, Ecol1 y Ecol2 (P<0,05), para el [t.sub.0] = 0 min; (2) en [t.sub.0] = 0 min entre las cepas de E. coli con respecto a las cepas de P aeruginosa (P<0,05); (3) entre la comparacion de E. coli con las cepas de S. aureus para los tiempos: [t.sub.4] = 5 min, [t.sub.2] = 10 min, [t.sub.3] = 15 min y [t.sub.4] = 20 min y el tiempo [t.sub.0] = 0 min, solo en Ecol1 y en Saur3 (P<0,05); (4) entre los tiempos [t.sub.4] = 5 min, [t.sub.2] = 10 min, [t.sub.3] = 15 min y [t.sub.4] = 20 min para P aeruginosa y S. aureus (P<0,05). Finalmente, entre los demas tiempos de exposicion y el crecimiento microbiano no se encontro diferencias significativas (P>0,05).

Todas las cepas evaluadas fueron eliminadas en una hora en presencia de la lamina de cobre; ademas, el numero de bacterias viables se redujo conforme aumentaba el tiempo de exposicion. Por otro lado, en la superficie de acero inoxidable, todas las bacterias permanecieron viables despues de su inoculacion, incluso sin reduccion en el numero de celulas.

En la figura 1 se observa el crecimiento de las cepas de E. coli-Ecol1, Ecol2 y Ecol3-, demostrando que las superficies de cobre eliminaron un numero de 2 x [10.sup.7] UFC/mL en 15 min en las tres cepas. Resultados similares se muestran con la exposicion de las tres cepas de P aeruginosa: Paer1, Paer2 y Paer3 a las superficies de cobre; aqui se observo una eliminacion rapida del numero de bacterias iniciales, en un tiempo aproximado de 10 minutos (figura 2). Considerando los resultados para las tres cepas de S. aureus, estos difieren mucho a los obtenidos con las dos especies anteriormente mencionadas. Su exposicion a superficies de cobre mostro una eliminacion completa en 60 minutos; ademas, es posible apreciar una mayor resistencia de Saur3 y en menor grado Saur1 y Saur2 (figura 3).

[FIGURA 1 OMITIR]

[FIGURA 2 OMITIR]

[FIGURA 3 OMITIR]

Segun los promedios de muerte bacteriana por el tiempo, se determino que para eliminar las cepas de P aeruginosa, E. coli y S. aureus son necesarios como minimo 10, 15 y 60 minutos de exposicion, respectivamente, a las laminas de cobre.

El acero inoxidable es ampliamente utilizado en los establecimientos de salud por sus costos, facilidad de limpieza y su resistencia a la corrosion. Sin embargo, en este y otros trabajos se demuestra que los patogenos asociados a infecciones intrahospitalarias permanecen viables por largos periodos de tiempo sobre las superficies de acero inoxidable, constituyendo un potencial reservorio de microorganismos patogenos (1,2,17), entre los cuales se encuentran E. coli, P aeruginosa y S. aureus.

Con respecto a otros estudios del efecto de las superficies de cobre sobre estas bacterias, se conoce los siguientes tiempos de supervivencia: E. coli de 30 a 60 min (11), P aeruginosa, de 180 min (8) y S. aureus muere entre 60 y 180 min (7). En cambio, los resultados obtenidos por este estudio indican que las cepas de E. coli Ecol1, Ecol2 y Ecol3 poseen tiempos semejantes de eliminacion, ocurridas entre los 10 a 15 minutos, con una eliminacion completa ocurrida a los 15 minutos (figura 1).

Las cepas de P. aeruginosa, en cambio, fueron eliminadas completamente a los 10 minutos, presentando Paer1, Paer2 y Paer3 un comportamiento similar (figura 2). En consecuencia, la rapida eliminacion de ambas bacterias Gram negativas se debe a la interaccion directa de la membrana celular externa con la superficie de cobre; en cambio, para las cepas de S. aureus gram positivas Saur1, Saur2 y Saur3, se puede observar un tiempo de eliminacion mas lento y gradual, ocurrido totalmente a los 60 minutos.

Un hallazgo interesante de nuestro trabajo fue que las cepas de S. aureus tienen un mayor tiempo de supervivencia a las superficies de cobre que las cepas de E. coli y de P. aeruginosa, lo que contradice los reportes mostrados por otros autores (7,8,14). Posiblemente, su pared celular evitaria el dano oxidativo temprano de la membrana. Se sugiere que la envoltura de las bacterias no es un buen indicador del dano provocado por el contacto con las superficies de cobre, pues las bacterias Gram positivas y negativas responden de la misma forma (18). Pero, en este trabajo demostramos que existe un efecto diferenciado entre el efecto de las superficies del cobre con las bacterias Gram positivas y las Gram negativas, posiblemente debido a la estructura de la pared celular bacteriana.

En ambientes hospitalarios, la carga bacteriana es aproximadamente 6 x [10.sup.3] UFC/[cm.sup.2] (19), muy similar a la carga microbiana empleada en este trabajo, condicion que nos permitio evidenciar in vitro el mecanismo bactericida de las superficies de cobre de manera analoga a lo que ocurre en un hospital. Futuras investigaciones pueden abordar la carga microbiana del personal medico y evaluar su efecto a las superficies de cobre.

Actualmente, ninguna bacteria resistente a superficies de cobre ha sido descrita. El motivo por el cual no se ha generado resistencia a las superficies de cobre es por su mecanismo de accion (19) e incluso bacterias sensibles y resistentes a los antibioticos como tambien bacterias con una tasa de reparacion elevada de ADN fueron eliminadas mucho mas rapido que otras bacterias que carecen de dicha capacidad (8,18,16). Posiblemente estos mecanismos independientes o en conjunto sustentan la sensibilidad de las bacterias empleadas en este trabajo (figuras 1, 2 y 3), y en consecuencia el cobre surge como un metal candidato para ser implementado en ambientes hospitalarios en lugar del acero inoxidable, el cual sigue siendo un reservorio de patogenos.

En conclusion, esta investigacion aporta al conocimiento y confirma la actividad bactericida de las superficies de cobre, a diferencia del acero inoxidable frente a patogenos nosocomiales, y proponemos el uso del cobre metalico o aleaciones del mismo como material alternativo para el control de los patogenos y disminuir las IIH.

AGRADECIMIENTO

A Jose Nino Valiente, Jefe del area de Microbiologia del Hospital Provincial Docente Belen, Lambayeque, por proporcionar los aislamientos bacterianos requeridos para el estudio.

REFERENCIAS BIBLIGRAFICAS

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Articulo recibido el 25 de mayo de 2014 y aceptado para publicacion el 11 de octubre de 2014.

Fuentes de financiamiento: Cofinanciado por fondo Ideas Innovativas UA y por los autores.

Conflictos de interes: Los autores senalan no tener conflictos de interes.

Edwin Neciosup [1], (a), Martha Vergara [1,3], Omar Pairazaman [2], (b), Marcos Apablaza [2], (c), Mario Esparza [2], (b)

[1] Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, Lambayeque, Peru.

[2] Laboratorio de Biomineria, Departamento de Biotecnologia, Facultad de Ciencias del Mar y Recursos Biologicos, Universidad de Antofagasta, Antofagasta, Chile.

(a) Biologo; (b) Doctor en Microbiologia; (c) Bioquimico.

Correspondencia: Dr. ario Esparza

Direccion: Laboratorio de Biomineria, Dpto. de Biotecnologia, Facultad de Ciencias del Mar y Recursos Biologicos, Universidad de Antofagasta, Av. Angamos 601, Antofagasta, Chile

Telefono: 056-055-2637445/056-9-85237572

Correo electronico: mrodrigount@yahoo.com
Tabla 1. Caracteristicas de las cepas bacterianas
causantes de infecciones intrahospitalarias (IIH)
usadas en este estudio.

Cepa            Abreviatura   Procedencia

                   Ecol1         HRDLM
E. coli            Ecol2         HPDB
                   Ecol3         HPDB
                   Paer1         HRDLM
P. aeruginosa      Paer2         HRDLM
                   Paer3         HPDB
                   Saur1         HRDLM
S. aureus          Saur2         HPDB
                   Saur3         HPDB

Cepa                IIH asociada       Respuesta al Gram

                     bacteremia            Negativa
E. coli          infeccion urinaria        Negativa
                 infeccion urinaria        Negativa
                      neumonia             Negativa
P. aeruginosa   infeccion de la piel       Negativa
                infeccion de la piel       Negativa
                 infeccion urinaria        Positivo
S. aureus       infeccion a la piel        Positivo
                infeccion a la piel        Positivo

HRDLM: Unidad de Cuidados intensivos del Hospital Regional
Docente "Las Mercedes", Chiclayo.

HPDB: Hospital Provincial Docente "Belen" (HPDB), Lambayeque.
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Article Details
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Author:Neciosup, Edwin; Vergara, Martha; Pairazaman, Omar; Apablaza, Marcos; Esparza, Mario
Publication:Anales de la facultad de medicina
Date:Mar 22, 2015
Words:3262
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