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Cinetica y morfometria espermatica en semen congelado sexado y convencional de toros Brown Swiss.

Kinetics and sperm morphometry in sexed and conventional frozen semen of Brown Swiss bulls

INTRODUCCION

La inseminacion artificial es una tecnica ampliamente utilizada en Puno, Peru, para la mejora de la respuesta productiva del ganado bovino. La evaluacion de la calidad del semen permite obtener una expresion mas precisa de la fisiologia o de las alteraciones del aparato reproductor masculino, particularmente en el proceso de la espermatogenesis (Kruger et al., 1988; Tamayo Torres, 2013).

La evaluacion de la morfologia espermatica de manera visual conlleva a la obtencion de valores susceptibles de imprecision, dependiendo del tecnico y de otros factores, de alli que los resultados que aporta el espermiograma no sea hasta el momento, por esta y otras razones, un buen predictor de la fertilidad (Quintero-Moreno et al., 2007). Se han desarrollado nuevas tecnologias in vitro, como la citometria de flujo o los sistemas CASA (Computer Assisted Sperm Analisis), que permiten el estudio de multiples caracteristicas funcionales y morfologicas de los espermatozoides para intentar predecir la capacidad fecundante del semen de la forma mas objetiva posible (WHO, 1999). Ademas, la aplicacion de estas nuevas tecnicas permite la reevaluacion de los protocolos de criopreservacion, tales como la eleccion del mejor diluyente para obtener una mayor supervivencia espermatica posdescongelacion o la temperatura ideal de descongelacion de las dosis seminales (Muino et al., 2005).

El uso de los sistemas CASA e ISAS (Integrated Sperm Analysis System) proporciona una serie de datos relativos a la velocidad y trayectoria de cada espermatozoide individual, que permite identificar la existencia de subpoblaciones espermaticas con distintos patrones de movimiento que coexisten en la misma muestra de semen (Davis y Siemers, 1995; Holt et al., 1996; Abaigar et al., 1999; Rigau et al., 2001; Quintero-Moreno et al., 2004), lo cual proporciona una vision mas realista que la motilidad media de la muestra.

MATERIALES Y METODOS

El analisis de la cinetica y morfometria espermatica de semen congelado se realizo en el laboratorio de reproduccion de la Universidad Nacional San Antonio Abad del Cusco, empleando el Integrated Semen Analysis System--IISAS[R] v. 1.2, el cual emplea un microscopio U0P-UB200i (Proiser R+D, Paterna, Valencia, Espana).

Para la cinetica espermatica se determinaron la velocidad curvilinea, VCL ([micron]m/s), velocidad media, VAP ([micron]m/s), velocidad rectilinea, VSL ([micron]m/s), amplitud del desplazamiento lateral de cabeza, ALH ([micron]m/s), frecuencia de batido, BCF (Hz), indice de linealidad, LIN (%), indice de rectitud, STR (%) e indice de oscilacion, WOB (%), de los espermatozoides en semen congelado de 10 pajillas sexadas de 0.25 ml y 10 pajillas convencionales de 0.5 ml de toros Brown Swiss de origen americano (adquiridos de la empresa Expermex EIRL, Peru).

Las pajillas de semen fueron descongeladas a 37[grados]C en bano maria durante 30 segundos. Se tomo una muestra de 5 [micron]l de cada pajilla y se coloco en una placa Petri. Fue observada con un lente de 10X de contraste en fase negativo y platina termica (37[grados]C). La senal del video se registro con una video camara Proiser 782C donde se capturaron 25 imagenes por segundo, analizando los espermatozoides en la configuracion establecida de acuerdo con la clasificacion por Muino et al. (2006).

Se prepararon frotis con 5 [micron]l de semen descongelado y fueron tenidos con Diff Quick (Siemens Healthcare Diagnostics Products). Las muestras tenidas se evaluaron utilizando el modulo de morfometria del ISAS, empleando el lente de inmersion 100X de un microscopio de contraste de fases y fluorescencia UB200i con camara. El sistema delineo los bordes de los espermatozoides fotografiados. La busqueda y captura de las imagenes de espermatozoides se realizo de manera manual. Se determino el area ([micron][m.sup.2]), largo ([micron]m), ancho ([micron]m) y perimetro ([micron]m) de la cabeza de los espermatozoides.

Para el analisis estadistico se utilizo la prueba de Kolmogorov-Smirnov para determinar la distribucion normal y homogenea de los datos. Los datos expresados en porcentajes de los parametros cineticos de LIN=Indice de linealidad, STR=Indice de rectitud y WOB=Indice de oscilacion fueron sujetos a una transformacion de raiz cuadrada. El analisis se hizo mediante un analisis de varianza de medidas repetidas. Todos los analisis estadisticos se realizaron utilizando el programa SPSS 22 (SPSS Inc, EEUU).

RESULTADOS

Cinetica Espermatica

No se encontraron diferencias significativas en los parametros de cinetica espermatica entre el semen sexado y convencional (Cuadro 1), aunque se puede observar que los espermatozoides de las pajillas descongeladas de semen sexado presentaban movimientos ligeramente mas rapidos, de mayor velocidad y de trayectoria mas rectilinea (VCL, VAP, VSL, BCF y ALH) que aquellos en pajillas con semen convencional.

Morfometria Espermatica

No hubo diferencias significativas en los parametros de morfometria espermatica entre el semen sexado y semen convencional (Cuadro 2); sin embargo, se evidencian ligeros incrementos en la morfometria de la cabeza del espermatozoide de las pajillas de semen sexado con relacion al de las pajillas con semen convencional.

DISCUSION

Cinetica Espermatica

Las medias encontradas en los parametros de cinetica espermatica en semen sexado y convencional son ligeramente superiores a los valores encontrados por Ancco et al. (2014), quienes trabajando con ocho pajillas congeladas de toros con fertilidad conocida encontro los siguientes valores cineticos espermaticos posdescongelacion (VCL=73.16 [micron]m/s; VSL=26.09 [micron]m/s; VAP=41.38 [micron]/s; LIN=35.76%; STR= 63.05%; BCF=8.06 Hz). Al respecto, Muino (2007) indica que la raza, edad y la interaccion raza x edad tuvieron efectos significativos (p<0.001) sobre los parametros cineticos, donde los espermatozoides de toros frisones presentaron movimientos de mayor velocidad y de trayectoria mas rectilinea en comparacion aquellos de eyaculados de toros Rubia Gallega. Asi mismo, Hoflack et al. (2007) demostraron diferencias significativas en velocidad y linealidad de las trayectorias espermaticas a favor de semen de toros Holstein en comparacion con semen de toros Azul Belga; hallazgos que sugieren que un componente genetico podria ser la base de dichas diferencias.

Se puede indicar que la velocidad media (VAP) y curvilinea (VCL) son reconocidas como parametros importantes en la evaluacion del semen, debido a que son los responsables del transporte de espermatozoides a lo largo del tracto genital de la hembra (Verstegen et al., 2002; Robayo et al., 2008). Verstegen et al. (2002) correlacionaron los parametros cineticos de los espermatozoides con la tasa de fertilizacion, encontrando que los valores de VAP, VSL y VCL fueron significativamente mayores en muestras que producen mas del 50% de ovocitos fertilizados que en aquellas donde la tasa de fertilizacion de ovocitos fue inferior al 50%. Muestras con altos valores de VAP, VSL y VCL, asi como de LIN y BCF presentan mejor migracion y penetracion en el moco cervical (Mortimer, 2000; Verstegen et al., 2002); en forma similar, Cox et al. (2006) reportan que espermatozoides caprinos con velocidad eficiente en la migracion del moco cervical in vitro presentan valores de LIN >50% y ALH = 4.8 im.

Morfometria Espermatica

Diversos estudios demuestran diferencias raciales con respecto a la morfologia de la cabeza del espermatozoide (Dowsett y Knott, 1996) y la morfometria (Ball y Mohammed, 1995; Phetudomsinsuk et al., 2008) en el caballo y en otras especies animales (Aggarwal et al., 2007; Saravia et al., 2007); sin embargo, los autores de este estudio no han ubicado estudio alguno que compare tales diferencias entre las subpoblaciones morfometricas en bovinos.

El eyaculado del toro esta compuesto por poblaciones heterogeneas de espermatozoides, de alli que se les puede agrupar en funcion de su morfometria (Rubio-Guillen et al., 2007). Nava-Trujillo y Quintero-Moreno (2017) agruparon tres subpoblaciones espermaticas con base a su morfometria: de cabeza pequena (SP1) con un area de 23.69 ([m.sup.2], longitud 6.97 [micron]m, ancho 3.86 [micron]m y perimetro 19.03 [micron]m; los que tienen dimensiones intermedias (SP2) con un area de 28.51 ([m.sup.2], longitud 7.77 [micron]m, ancho 4.18 [micron]m y perimetro 21.05 [micron]m; y aquellos de mayor tamano (SP3) con un area de 32.10 [micron][m.sup.2], longitud 8.30 [micron]m, ancho 4.44 [micron]m y perimetro 22.57 [micron]m, donde la subpoblacion intermedia representaba el 60.5%. Esta informacion concuerda, asimismo, con Rubio-Guillen et al. (2007), quienes, ademas, describen una poblacion intermedia predominante de 50.4%.

Con base a lo anterior, los espermatozoides de este estudio estarian mayormente agrupados como aquellos con cabeza pequena (SP1); sin embargo, es posible que el proceso de criopreservacion haya afectado su tamano (Rubio-Guillen et al., 2007). Los espermatozoides difieren en la forma de la cabeza, lo cual influencia la valoracion de la calidad seminal (Thurston et al., 2001). Asi, se ha demostrado que la morfometria espermatica influye en la calidad del movimiento espermatico (Malo et al., 2006; Gil et al., 2009) y en la capacidad que presenta un eyaculado para responder a los distintos metodos de conservacion (Esteso et al, 2006). Ademas, en otras especies como el caballo (Casey et al., 1997) y el cerdo (Gonzalez Villalobos et al., 2008) se ha puesto en evidencia su implicancia en la fertilidad.

CONCLUSIONES

Los valores de la cinetica y morfometria espermatica fueron similares entre el semen sexado y convencionales de toros Brown Swiss congelados en pajillas.

http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v30i1.14696

Agradecimientos

Los autores manifiestan su agradecimiento al MVZ Enrique Zegarra Ortiz por su apoyo en la realizacion del analisis de semen, y a la Municipalidad del distrito de Asillo por facilitar la ejecucion del estudio en beneficio del sector agropecuario.

LITERATURA CITADA

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(4.) Ancco E, Quispe C, Mellisho E. 2014. Parametros de cinetica espermatica antes y despues de la seleccion con gradiente de Percoll 45/90 en semen congelado de bovinos. Spermova 4: 65-67.

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(32.) [World Health Organization] WHO. 1999. Laboratory manual for the examination of human semen and sperm cervical mucus. 4th ed. UK: Cambridge University Press. 128 p.

Edwin Ormachea V. [1, 4], Bilo Calsin C. [2], Enrique Zegarra O. [3]

[1] Departamento Academico de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Amazonica Madre de Dios, Peru

[2] Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional del Altiplano--UNA, Puno, Peru

[3] Expermex EIRL, Peru

[4] E-mail: edwinormachea@gmail.com

Recibido: 31 de mayo de 2018

Aceptado para publicacion: 27 de octubre de 2018
Cuadro 1. Parametros de cinetica espermatica de pajillas de semen
bovino Brown Swiss sexado (n=10) y convencional (n=10) utilizando el
sistema IISAS[R]

Cinetica espermatica      Semen sexado          Semen convencional

                         Promedio      D.E.      Promedio      D.E.

VCL ([micron]m/s)        85.46 (a)      15.6     77.30 (a)      13.5
VAP ([micron]m/s)        49.84 (a)      5.1      42.30 (a)      6.4
VSL ([micron]m/s)        38.34 (a)      2.9      29.00 (a)      4.9
BCF (Hz)                 19.96 (a)      9.5      10.12 (a)      1.3
ALH ([micron]m/s)         4.12 (a)      1.2       3.24 (a)      0.5
LIN (%)                  46.32 (a)      10.6     39.07 (a)      11.4
STR (%)                  77.48 (a)      8.7      68.70 (a)      8.5
WOB (%)                  59.02 (a)      6.0      55.26 (a)      7.2

VCL=Velocidad curvilinea; VAP=Velocidad media; VSL=Velocidad
rectilinea; BCF=frecuencia de batido; ALH=Amplitud media del
desplazamiento lateral de la cabeza; LIN=Indice de linealidad; STR=
Indice de rectitud; WOB =Indice de oscilacion

Superindices iguales dentro de filas indican que los valores fueron
estadisticamente similares

Cuadro 2. Parametros de morfometria de la cabeza del espermatozoide
(um) de toros Brown Swiss en pajillas de semen sexado (n=10) y
convencional (n=10) utilizando el sistema IISAS[R]

Morfometria espermatica        Semen sexado        Semen convencional

                              Promedio     D.E.     Promedio     D.E.

Area ([micron][m.sup.2])     21.51 (a)     1.87    18.42 (a)     2.33
Largo ([micron]m)             6.36 (a)     0.55     5.23 (a)     0.71
Ancho ([micron]m)             3.42 (a)     0.38     2.67 (a)     0.49
Perimetro ([micron]m)        17.94 (a)     0.99    14.51 (a)     2.58

Superindices iguales dentro de filas indican que los valores fueron
estadisticamente similares
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Title Annotation:Comunicacion
Author:Ormachea V., Edwin; Calsin C., Bilo; Zegarra O., Enrique
Publication:Revista de Investigaciones Veterinarias del Peru (RIVEP)
Date:Jan 1, 2019
Words:3356
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